吳劍平，張鑫，李丹妮，嚴鳳，潘娟，張婧

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

分散固相萃取結合親水作用色譜-串聯(lián)質譜法檢測預混合飼料中7種抗病毒藥物含量

吳劍平，張鑫*，李丹妮，嚴鳳，潘娟，張婧

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

建立了同時檢測預混合飼料中7種抗病毒藥物含量的分散固相萃取(QuCHERS)結合親水作用色譜(HILIC)-串聯(lián)質譜檢測方法，包括了金剛烷胺、嗎啉胍、金剛乙胺、阿昔洛韋、利巴韋林、更昔洛韋和奧司他韋。選擇使用乙腈提取，無水MgSO4進行脫水和鹽析，C18粉和丙基乙二胺(Primary secondary amine，PSA)進行樣品凈化。使用親水作用液相色譜柱進行分離，流動相為0.2%甲酸和乙腈，采用梯度洗脫，三重四級桿質譜進行定性定量分析。實驗結果表明，方法的最低檢出限為25 μg/kg，最低定量限為50 μg/kg，在50～5000 μg/kg范圍內線性關系良好(r>0.995)，添加回收率在60%～110%之間，RSD<10%，表明該方法具有較好的準確度與精密度。

抗病毒藥物; 分散固相萃取;親水作用色譜；串聯(lián)質譜法

抗病毒藥物一般是指具有可抗病毒感染機體的藥物，抗病毒感染的機制很多，包括直接抑制或殺滅病毒、干擾病毒吸附、阻止病毒穿入細胞、抑制病毒生物合成、抑制病毒釋放或增強宿主抗病毒能力等。因此，抗病毒藥物種類繁多，運用于臨床治療的主要包括金剛烷胺類、核苷類以及神經氨酸酶抑制劑類[1]。從20世紀80年代初至今，我國畜牧業(yè)正逐漸向規(guī)?；⒓s化方向發(fā)展。大規(guī)模、集約化、高密度的畜禽養(yǎng)殖對動物疫病防控提出了更高的要求，如何防控“圓環(huán)病”、“藍耳病”、“禽流感”等病毒感染性疾病也成為了養(yǎng)殖業(yè)當前面臨的一大課題。然而，這樣的大背景下也催生出飼料中濫用抗病毒藥物的現(xiàn)象，和濫用抗菌藥物現(xiàn)象同時成為畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的兩大痼疾[2-3]。2012年11月肯德基的供應商山西粟海集團“速成雞”事件被曝光，據報道在飼喂過程中涉及到11種藥物，其中就包含大劑量的金剛烷胺、利巴韋林等抗病毒藥物。據文獻報道[4-6]，抗菌藥物的濫用有巨大危害，會導致動物中毒、免疫抑制、藥物殘留等問題，同時還有促使病毒產生變異,對目前人用抗病毒藥物產生耐藥的可能。目前抗病毒藥物檢測方法的報道主要集中在血漿和尿液等生物體液以及獸藥中的非法添加領域，而對動物飼料中違法添加檢測方法研究的相關報道較少[7-8]，其方法主要以液相色譜法或液相色譜串聯(lián)質譜法[9-10]為主，但這些方法往往僅局限于某一種或少數幾種抗病毒藥物，因此當前研究可以簡便、迅速、準確地同時檢測預混合飼料中添加多種類抗病毒藥物的檢測方法就有相當的必要性。

1 材料和方法

1.1 儀器 Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜、Excalibur控制軟件、串聯(lián)四極桿質譜帶HESI電離噴霧源(TSQ Quantiva)、Xcalibur數據處理系統(tǒng)、高速冷凍離心機(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；減壓旋轉蒸發(fā)儀(B-490，BUCHI)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 反相聚合物固相萃取柱(HLB 3 mL/60mg)、QuCHERS材料，均購于美國Waters公司；金剛烷胺(Amantadine，ATD)，嗎啉胍(Moroxydine，MXD)，金剛乙胺(Rimantadine，RTD)，阿昔洛韋(Acyclovir，ACLV)，利巴韋林(Ribavirin，RBV)，更昔洛韋(Ganciclovir，GCLV)，奧司他韋(Oseltamivir，OSTV)(純度均≥99.0 %，德國DrEhrenstofer GmbH)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國Merk)；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

1.3 親水相互作用色譜條件 色譜柱：Waters Cortecs HILIC(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min,進樣量5 μL，流動相：A為0.2%甲酸，B為乙腈，采用梯度洗脫程序如表1，所得典型色譜質譜圖如圖1。從上至下通道依次為金剛烷胺、金剛烷胺-D6、嗎啉胍、金剛乙胺、阿昔洛韋、利巴韋林、更昔洛韋、奧司他韋。

表1 親水相互作用法梯度洗脫程序

圖1 10 ng/mL混合對照品溶液親水相互作用色譜法的SRM圖

1.4 質譜條件 使用Thermo Fisher公司的TSQ Quantiva串聯(lián)四極桿質譜帶HESI電離噴霧源質譜檢測器對1 μg/mL的7種抗病毒類藥物單標溶液進行優(yōu)化，兼顧各目標化合物優(yōu)化后的質譜條件為：選擇正離子模式，源電壓3900 V，鞘氣(Sheath gas)壓力344 kPa，輔助氣(Aux gas)流速5 L/min，吹掃氣(Sweep gas)流速0.3 L/min，離子傳輸管(Ion transfer tube)溫度 350 ℃，霧化器(Vapourizer)溫度400 ℃，檢測模式為選擇反應監(jiān)控(Selected reaction monitor，SRM)，碰撞氣壓力0.2 Pa，Q1段分辨率設為半峰寬0.7，Q2段分辨率設為半峰寬0.7，7種抗病毒類藥物的定性與定量離子對以及對應的撞擊能量見表2。

表2 抗病毒類藥物定性與定量離子對

續(xù)表

*為定量離子

1.5 前處理條件 分散固相萃取法：取2.00 g預混合飼料樣品置于50 mL試管中，加1 mL水渦旋振勻，加10 mL乙腈振蕩提取5 min，加入2 g無水硫酸鎂，渦旋振勻，8000 r/min離心5 min，取上層清液備用。取備用液2.00 mL，依次加入無水硫酸鎂150 mg，C18粉50 mg，PSA粉 100 mg，渦旋1 min后10000 r/min離心5 min，取上清液過 0.22 μm尼龍濾膜后待測。反相色譜法中待測液以50 ℃氮氣吹干，用0.2%甲酸1.00 mL溶解后上機測定；親水相互作用色譜法中待測液直接上機測定，添加樣品檢測結果如圖2所示。

2 結果與分析

2.1 線性定量范圍的確定 將7種抗病毒藥物對照品分別用甲醇溶解，制成1 μg/mL的標準品貯備液，取適量該貯備液用0.2%甲酸稀釋成1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50、100.0 μg/L的標準曲線系列工作溶液，將該系列溶液依次按1.4項和1.5項的檢測方法進樣檢測，將所得定量通道色譜圖積分后面積與內標峰面積比值以Y表示，進樣濃度以X表示，所得回歸曲線結果如下表3所示，其線性相關系數r都大于等于0.995。實驗表明，該方法同時檢測7種抗病毒藥物進樣濃度在1.0～100.0 μg/L，即實際含量在50～5000 μg/kg范圍內線性良好。

表3 7種抗病毒藥物線性范圍表

圖2 25 μg/kg添加樣品親水相互作用色譜法的SRM圖

2.2 檢測限與定量限的確定 選擇20個空白樣品，按優(yōu)化條件進行處理后上機測定，取與標準品圖譜中相同保留時間的噪音信號平均值，以信噪比S/N≥3為檢出限(LOD)，S/N≥10為定量下限(LOQ)，確定該方法的檢出限為25 μg/kg，定量下限為50 μg/kg。檢測限處SRM圖譜見圖2。2.3 方法準確度與精密度實驗 為研究分散固相萃取和傳統(tǒng)固相萃取法檢測預混合飼料中7種抗病毒藥物時方法回收率和精密度的差異，使用6批不同預混合飼料，每批稱取等量6份，3份一組分兩組，分別加入50、100、500 μg/kg的7種喹惡啉類化合物，兩組分別采用分散固相萃取法和傳統(tǒng)固相萃取法，所得結果如表4所示。實驗結果表明，分散固相萃取法檢測預混合飼料中7種抗病毒藥物時回收率結果在60%～90%之間，RSD<10%，同時測得使用傳統(tǒng)反相機理的固相萃取法只有金剛烷胺、金剛乙胺和奧司他韋三種藥物的回收率達到60%以上，而其他四種藥物的回收率均未達到60%，結果表明分散固相萃取具有較高的準確度與精密度。

2.4 方法選擇性的驗證 選擇20個空白樣品，按優(yōu)化條件進行處理后上機測定，未發(fā)現(xiàn)有假陽性結果，表明該方法的選擇性良好。

3 討論與小結

3.1 色譜方法的確定 本次實驗嘗試了兩種截然不同的色譜分離方法，其中使用具有超純硅膠載體高碳載量的Waters HSS T3超高效液相色譜柱，其目的是在對目標化合物中高極性化合物增強保留的同時，對非極性化合物不會產生過強的保留。另外，將流動相起始比例設為0.2%甲酸∶甲醇=95∶5，盡量增強其中強極性化合物的保留，然后在強極性的化合物均出峰以后迅速將比例調整到0.2%甲酸∶甲醇=20∶80，使得保留較強的弱極性化合物能盡早出峰。除極性較弱的金剛乙胺、奧司他韋以外，其余5種化合物的極性均較強，在2 min以內均已出峰。考慮到對色譜柱的耐用性，不宜將流動相的水相比例再升高，因此很難增強對剩余5種化合物的保留，而一般樣品基質中的強極性干擾雜質往往在0～2 min內出峰，應此很容易與目標化合物爭奪電荷，造成嚴重的基質干擾；由于抗病毒類藥物的分子量較小，過早的出峰時間也容易受到質量數接近的物質干擾，金剛烷胺通道就明顯有此情況。針對這一情況同時嘗試了使用親水相互作用(HILIC)色譜法，選擇了采用薄殼核殼技術填料的Waters Cortecs HILIC色譜柱。親水相互作用色譜是通過類似于硅膠的強親水性聚合物吸附劑作為固定相，在流動相水含量較低的時候其與極性化合物之間產生較強的分子間作用力以實現(xiàn)保留，當水含量提高后由于水的極性強于大多數有機目標物，因此會取代目標化合物與固定相產生鍵合，從而實現(xiàn)對高極性化合物的保留。由于一般HILIC色譜柱的柱效相對較低，難以實現(xiàn)高效率的分離，本方法選擇具有薄殼核殼技術的HILIC色譜柱，該填料核外的殼層增加了目標化合物在色譜柱中的行程，提高了填料的比較面積，充分利用傳質阻力和渦流擴散效應提高了色譜柱的柱效。實驗結果如圖1所示，所有目標化合物保留時間均在5～6 min之間，除色譜峰型略有拖尾，柱效略遜于反相C18柱以外，其保留行為十分適合液質聯(lián)用檢測技術的需求。而且，該方法的另一個優(yōu)勢是進樣溶劑可以是純乙腈，因此預處理步驟中最后用高比例乙腈洗脫的溶劑可以經過過濾以后直接進樣，省去了溶劑置換的步驟。

表4 分散固相萃取準確度和精密度結果表

3.2 分散固相萃取法的確定 分別以分散固相萃取法和傳統(tǒng)固相萃取法對相同樣品進行了分析檢測，實驗結果表明，分散固相固相萃取法同時檢測預混合飼料中7種抗病毒藥物時回收率結果在60%～90%之間，而使用傳統(tǒng)反相機理的固相萃取法所得結果中只有金剛烷胺、金剛乙胺和奧斯他韋三種藥物的回收率達到60%以上，而其他四種藥物的回收率均未達到60%，推測這可能與化合物性質差異有關。因此查閱了化合物的水溶解系數、水油分配系數和酸堿環(huán)境下的解離系數等理化性質參數[8]。水溶解系數、水油分配系數表明該7種抗病毒藥物在有機溶劑中溶解度較高，因此提取試劑宜采用高比例有機溶劑；而金剛烷胺、金剛乙胺和奧司他韋的水油分配系數較大，因此在傳統(tǒng)的反相固相萃取柱上保留較好，同時在色譜柱上也會有較好的保留行為，而其余4種藥物在反相柱上較難保留，回收率結果較差；酸堿條件下的pKa顯示金剛烷胺、金剛乙胺、嗎啉胍在酸性條件下難以水解，呈極性較小的分子狀態(tài)，在堿性條件下易呈極性較大的離子狀態(tài)，而阿昔洛韋、利巴韋林、更昔洛韋和奧司他韋則正好相反，在酸性條件下易解離而堿性條件下不易解離，因此不能采用傳統(tǒng)的調節(jié)pH后使用離子交換型固相萃取方法來同時兼顧這7種化合物，最終采用了中性有機溶劑提取以同時兼顧7種化合物的提取與凈化，分散固相萃取和HILIC色譜技術結合同時分析7種抗病毒藥物。

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(編輯：侯向輝)

Determination of 7 Antivirus in Premixed Feed by QuCHERS Combined with Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Jian-ping, ZHANG Xin*, LI Dan-ni, YAN Feng, PAN Juan, ZHANG Jing

(ShanghaiMunicipalSupervisoryInstituteVeterinaryDrugsandFeedstaff,Shanghai201103,China)

To determine 7 antivirus in feed including amantadine, moroxydine, rimantadine, acyclovir, ribavirin, ganciclovir and oseltamivir, a QuCHERS combined with hydrophilic interaction chromatography (HILIC) - tandem mass method was established. The acetonitrile was chosen to extract the target compounds, the anhydrous magnesium sulfate was chosen to dehydrate and salt out, and the C18 powder and the primary secondary amine (PSA) were chosen to purify the sample. After centrifugation, the extract was determined by the method below.The targets was separated by the gradient elution with a HILIC column as the stationary phase and 0.2% formic acid with acetonitrile as the mobile phase. The qualification and quantification were achieved by a tandem mass spectrometry. The results showed that the LOD of the method was 25 μg/kg and the LOQ was 50 μg/kg. The linearity of the method was good in the range of 50～5000 μg/kg and the liner correlations were all above 0.995, and the recovery of 7 targets were between 60%～110%, and theRSDwere lower than 10%, which showed the good accuracy and precision of the method.

antivirus; QuCHERS; HILIC; tandem mass spectrometry

上海市市級農口系統(tǒng)青年人才成長計劃:滬農青字(2014) 第2-5號;公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203023)

吳劍平，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析與研究。

張鑫。E-mail: xin_zh@yeah.net

2015-12-28

A

1002-1280 (2016) 03-0049-07

S859.84