王楠，李旭妮，于曉輝，徐磊，張媛，劉博，李建，毛開(kāi)榮，蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

布氏菌病活疫苗活菌計(jì)數(shù)項(xiàng)目能力驗(yàn)證結(jié)果分析

王楠，李旭妮，于曉輝，徐磊，張媛，劉博，李建，毛開(kāi)榮，蔣玉文*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為了解全國(guó)布氏菌病活疫苗生產(chǎn)企業(yè)活菌計(jì)數(shù)能力，2015年對(duì)該項(xiàng)目進(jìn)行了能力驗(yàn)證分析，每名參比企業(yè)發(fā)放布氏菌活疫苗(S2株)樣品3份，要求在規(guī)定時(shí)間內(nèi)對(duì)其進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并提交結(jié)果報(bào)告。結(jié)果顯示，參比的17家企業(yè)中，15家結(jié)果“滿意”，2家企業(yè)結(jié)果“不滿意”，表明全國(guó)大部分布氏菌病活疫苗生產(chǎn)企業(yè)具備可信任的布氏菌病活疫苗活菌計(jì)數(shù)檢測(cè)能力。

布氏菌病活疫苗；活菌計(jì)數(shù)；能力驗(yàn)證；結(jié)果分析

布氏菌病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的動(dòng)物源性人畜共患病，進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，布病疫情在我國(guó)快速反彈，防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。動(dòng)物布氏菌病防治以預(yù)防為主，因此布氏菌病疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響布氏菌病的防控效果。截至2012年，我國(guó)具有布氏菌病活疫苗生產(chǎn)文號(hào)的企業(yè)有14家，年產(chǎn)量超過(guò)2.5億頭份[1]。為了解全國(guó)布氏菌病活疫苗生產(chǎn)企業(yè)活菌計(jì)數(shù)能力，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所組織實(shí)施了布氏菌病疫苗生產(chǎn)企業(yè)活菌計(jì)數(shù)項(xiàng)目能力驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 測(cè)試樣品

1.1.1 樣品制備 委托生產(chǎn)企業(yè)制備布氏菌病活疫苗(S2株)240瓶，制備方法同《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》[2]。樣品密封、粘貼標(biāo)簽，于-18 ℃以下保存。

1.1.2 樣品均勻性檢驗(yàn) 按照CNAS-GL03：2006《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[3]要求進(jìn)行。樣品均勻性檢驗(yàn)按5%比例從樣品中隨機(jī)抽取12瓶，每個(gè)樣品分別在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)兩次。

1.1.3 樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn) 考慮到本測(cè)試樣品可能受溫度影響較大，所以，穩(wěn)定性檢驗(yàn)包括靜置狀態(tài)和郵寄狀態(tài)。

1.1.3.1 靜置狀態(tài)檢驗(yàn) 樣品在-18 ℃以下保存的穩(wěn)定性檢測(cè)：檢測(cè)周期為21 d，每隔7 d檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)3次，每次隨機(jī)檢測(cè)3瓶樣品。

1.1.3.2 郵寄狀態(tài)檢驗(yàn) 選擇距離最遠(yuǎn)的3個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別郵寄1份樣品，3瓶/份，實(shí)驗(yàn)室收到樣品后反饋樣品狀態(tài)并原樣寄回，收到返回的郵寄樣品后立即開(kāi)封檢測(cè)。

1.1.4 樣品發(fā)放 按照隨機(jī)抽取樣品的原則，采用隔熱泡沫塑料盒內(nèi)置樣品3瓶和2個(gè)生物冰袋，最外層包裝為紙箱，由EMS快遞至各實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)將樣品狀態(tài)確認(rèn)表、作業(yè)指導(dǎo)書和結(jié)果報(bào)告等文件隨樣品同時(shí)郵寄。

1.2 參加單位 報(bào)名參加單位包括具有布氏菌病活疫苗生產(chǎn)文號(hào)的獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)共計(jì)17家，各參加實(shí)驗(yàn)室擁有唯一性代碼，結(jié)果統(tǒng)計(jì)中用唯一性代碼代替實(shí)驗(yàn)室名稱，結(jié)果評(píng)價(jià)結(jié)束后發(fā)放能力驗(yàn)證合格實(shí)驗(yàn)室證書。

1.3 試驗(yàn)方法 本次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)采用《中國(guó)獸藥典》活菌計(jì)數(shù)的方法[4]。

Z比分值計(jì)算公式：Z=(X-XM)/NormIQR，式中：Z為穩(wěn)健比分值；X為檢驗(yàn)數(shù)據(jù)；XM為中位值；NormIQR為標(biāo)準(zhǔn)化四分位距，NormIQR =0.7413×四分位間距(IQR)。

1.5 結(jié)果評(píng)價(jià)依據(jù) 本次能力驗(yàn)證采用綜合評(píng)價(jià)方式，既重結(jié)果，也重過(guò)程。統(tǒng)計(jì)結(jié)果僅作為評(píng)價(jià)依據(jù)之一，評(píng)判依據(jù)還包括檢測(cè)思路是否清晰、報(bào)告填寫是否規(guī)范、原始記錄是否符合要求、檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確等。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的均勻性檢驗(yàn) 采用單因子方差分析法進(jìn)行樣品均勻性檢驗(yàn)，結(jié)果表明：計(jì)算得到F值=0.75，該值小于臨界值F0.05(11,12)=2.72，表明在0.05的顯著性水平下，該樣品是均勻的。

2.2 樣品的穩(wěn)定性檢驗(yàn) 采用t檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)分析樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)。靜置狀態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果表明：計(jì)算得到的t值=1.22，該值小于臨界值t0.05(5)=2.57，表明在0.05的顯著性水平下，該樣品在靜置狀態(tài)下，21 d內(nèi)是穩(wěn)定的。郵寄狀態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果表明：計(jì)算得到的t值=0.48，該值小于臨界值t0.05(5)=2.57，表明在0.05的顯著性水平下，該樣品在郵寄狀態(tài)下是穩(wěn)定的。

2.3 檢驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 檢驗(yàn)結(jié)果 各參比企業(yè)均能在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)按照《作業(yè)指導(dǎo)書》的檢驗(yàn)要求，將能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告和原始檢驗(yàn)記錄及時(shí)反饋，匯總17家參比企業(yè)的檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 參比單位檢驗(yàn)結(jié)果匯總表

2.3.2 檢驗(yàn)結(jié)果的參數(shù)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果 結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理參照CNAS-GL02：2014《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[6]，檢測(cè)結(jié)果中編號(hào)為08和15的參比單位平皿菌落平均數(shù)出現(xiàn)極端值(平皿菌落平均數(shù)大于200CFU或小于40 CFU)，為了避免極端值對(duì)其他檢驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)生影響，實(shí)際統(tǒng)計(jì)中將其剔除，其余15家參比單位給予的3瓶樣品的檢測(cè)結(jié)果均參與統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)Z比分?jǐn)?shù)計(jì)算公式，統(tǒng)計(jì)參數(shù)值結(jié)果見(jiàn)表2，Z比分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，各參比單位的Z比分?jǐn)?shù)序列圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，15家企業(yè)的ΙZΙ值均≤2，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為“滿意”。

表2 參比單位檢驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)參數(shù)

圖1 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果Z比分?jǐn)?shù)序列圖

參比單位編號(hào)瓶號(hào)1瓶號(hào)2瓶號(hào)3檢測(cè)值Z值檢測(cè)值Z值檢測(cè)值Z值0110.2620.80810.2430.65610.3031.1360210.093-0.54410.061-0.80010.079-0.6560310.2650.83210.2720.88810.2040.3440410.2830.97610.2410.64010.2600.7920510.2070.36810.114-0.37610.111-0.4000610.076-0.68010.076-0.68010.093-0.5440710.093-0.54410.143-0.14410.037-0.9920910.004-1.25610.013-1.18410.000-1.2881010.3101.19210.2300.55210.2901.0321110.072-0.71210.104-0.45610.093-0.5441210.041-0.9610.013-1.18410.009-1.2161310.2330.57610.2170.44810.16101410.2620.80810.2600.79210.2941.0641610.117-0.35210.124-0.29610.1730.0961710.2460.6810.2480.69610.1730.096

表中的“檢測(cè)值”為檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)值

2.3.2 綜合評(píng)價(jià)結(jié)果 對(duì)原始檢驗(yàn)記錄，檢驗(yàn)報(bào)告和統(tǒng)計(jì)結(jié)果的進(jìn)行綜合分析后認(rèn)為：15/17家參比企業(yè)能夠按照《中國(guó)獸藥典》和《作業(yè)指導(dǎo)書》的規(guī)定完成檢驗(yàn)，結(jié)果滿意。但是，仍發(fā)現(xiàn)存在的一些問(wèn)題(表4),經(jīng)過(guò)綜合評(píng)價(jià)后，15家企業(yè)在本次能力驗(yàn)證中獲“滿意”結(jié)果，2家企業(yè)獲“不滿意”結(jié)果。

表4 綜合評(píng)價(jià)存在的問(wèn)題匯總表

3 討論

本次能力驗(yàn)證的樣品為活微生物，考慮到其特殊性質(zhì)，樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)中增加郵寄狀態(tài)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)。樣品郵寄正值夏季氣溫較高，三個(gè)地點(diǎn)的郵寄天數(shù)為3～5 d，郵寄過(guò)程中樣品的活菌數(shù)雖有一定下降，但是經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,不同郵寄地點(diǎn)和郵寄天數(shù)的樣品檢測(cè)結(jié)果差異并不顯著，說(shuō)明采用隔熱泡沫塑料盒內(nèi)置樣品和生物冰袋，外層包裝為紙箱，由EMS快遞至各實(shí)驗(yàn)室的方法可行。

本次能力驗(yàn)證的結(jié)果評(píng)價(jià)采用綜合評(píng)價(jià)的方式，目的是在對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上，全面考察企業(yè)布氏菌病活疫苗活菌計(jì)數(shù)項(xiàng)目的檢測(cè)能力。通過(guò)綜合評(píng)價(jià)的方式，我們發(fā)現(xiàn)布病活疫苗在活菌計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制過(guò)程中存在一些問(wèn)題，例如①不能有效控制菌落計(jì)數(shù)的稀釋度。3/17(17.6%)家企業(yè)存在布病活疫苗活菌計(jì)數(shù)的平皿菌落數(shù)超過(guò)《中國(guó)獸藥典》規(guī)定(>200 CFU/個(gè))導(dǎo)致單個(gè)平皿菌落數(shù)過(guò)多，無(wú)法計(jì)數(shù)。②未嚴(yán)格執(zhí)行企業(yè)內(nèi)部操作規(guī)程中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行檢驗(yàn)。由于布氏菌菌落特性是生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)至少72 h以上否則無(wú)法用肉眼清晰辨認(rèn)菌落，4/17(23.5%)家企業(yè)培養(yǎng)時(shí)間僅為48 h左右。③相關(guān)檢驗(yàn)記錄不完整，檢驗(yàn)信息無(wú)法溯源。如原始檢驗(yàn)記錄中缺失培養(yǎng)基種類，名稱和批次、稀釋液種類和批次、稀釋過(guò)程等相關(guān)信息。又如，檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)6/17(35.2%)家企業(yè)檢驗(yàn)報(bào)告中試驗(yàn)步驟十分簡(jiǎn)單，反映出檢驗(yàn)人員在檢驗(yàn)過(guò)程中未按照企業(yè)操作規(guī)程執(zhí)行，或是企業(yè)制定操作規(guī)程不夠詳細(xì)。④原始檢驗(yàn)報(bào)告中沒(méi)有明確注釋頭份數(shù)的計(jì)算過(guò)程和公式，頭份數(shù)的計(jì)算結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥至關(guān)重要，如果頭份數(shù)計(jì)算偏大，疫苗無(wú)法達(dá)到免疫效果；反之，頭份數(shù)計(jì)算偏小，疫苗安全性存在隱患。本次能力驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，12/17(70.6%)家企業(yè)未能在原始檢驗(yàn)報(bào)告中清晰注釋頭份數(shù)的計(jì)算過(guò)程和公式，如果頭份數(shù)結(jié)果錯(cuò)誤，將無(wú)法確定是否由計(jì)算過(guò)程導(dǎo)致。由于不同企業(yè)和不同批次的半成品加入稀釋液的數(shù)量不同和稀釋的方法也不同，應(yīng)將各種變量(平板菌落數(shù)的平均數(shù)、溶解液量、稀釋倍數(shù)和平皿滴加菌液量)代入頭份數(shù)計(jì)算公式，從而得出的布病活疫苗頭份數(shù)更為科學(xué)準(zhǔn)確。由此可見(jiàn)，僅僅將活菌計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果作為細(xì)菌活疫苗活菌計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證的評(píng)價(jià)依據(jù)尚不夠全面，需采用綜合評(píng)價(jià)的方式，客觀、具體的反映出企業(yè)檢驗(yàn)?zāi)芰唾|(zhì)量控制中存在的問(wèn)題。如何制定更科學(xué)、合理的綜合評(píng)價(jià)方式，是我們今后組織能力驗(yàn)證活動(dòng)中需要進(jìn)一步思考的問(wèn)題。

[1] 王楠，程君生，丁家波，等.布氏菌病活疫苗的生產(chǎn)現(xiàn)狀與質(zhì)量分析[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47(4): 49-50.

[2] 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2000: 157-158.

[3] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS—GL03:2006能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南[S]. 2006．

[4] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010:附錄19-20.[5] 張媛，張磊，李建，等.穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法及t檢驗(yàn)法在活菌技術(shù)能力比對(duì)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2013，47(4): 19-20.

[6] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS GL 02：2006能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南[S]. 2006．

(編輯：李文平)

Analysis of the Proficiency Testing of Live Bacteria Counting of Brucellosis Vaccine

WANG Nan, LI Xu-ni, YU Xiao-hui, XU Lei, ZHANG Yuan, LIU Bo,LI Jian, MAO Kai-rong, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081,China)

In order to ensure the product quality of brucellosis vaccine, proficiency testing of brucellosis vaccine live bacteria counting has been organized by China Institution of Veterinary Drug Control,further investigate and compare the companies' testing capabilities. The samples of brucellosis vaccine have been sent to the companies, and then they should submit the test result paper within the given time. 17 national veterinary biologics companies have participated in the proficiency testing. Results of 15 companies were determined as satisfactory while results of the other 2 companies were determined as unsatisfactory after comprehensive evaluation. In conclusion, the result shows that most national manufacturers own trusted brucellosis vaccine testing capabilities.

brucellosis vaccine; live bacteria counting; proficiency test; result analysis

北京市科技新星計(jì)劃(Z141107001814013)

王楠，副研究員，從事人畜共患類獸用生物制品檢驗(yàn)和研究工作。

蔣玉文。E-mail:jiangyuwen@ivdc.org.cn

2016-01-14

A

1002-1280 (2016) 05-0015-04

S855.12