邵考珍，何淑瑩

佛山市南海區(qū)第七人民醫(yī)院藥劑科，廣東 佛山 528247

HPLC法測定紫背天葵中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量的研究

邵考珍，何淑瑩

佛山市南海區(qū)第七人民醫(yī)院藥劑科，廣東 佛山 528247

目的：建立紫背天葵中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量測定的高效液相色譜法（HPLC）。方法：采用Shim-pack VPODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，0.5%磷酸-50%乙腈為流動(dòng)相；檢測波長為280 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30℃。結(jié)果：矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在0.05 μg～1 μg的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），平均加樣回收率為100.4%，RSD為1.3%（n=6）。結(jié)論：該方法可準(zhǔn)確測定紫背天葵中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量，重復(fù)性好，可作為控制紫背天葵質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

紫背天葵；HPLC法；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；含量測定

紫背天葵是秋海棠科秋海棠屬的多年生無莖草本植物，又名紅天葵、紅葉、紅水葵、散血子等，分布于中國的廣東、福建、江西、海南、香港、湖南、廣西、福建、浙江等地，質(zhì)量以肇慶鼎湖山出產(chǎn)的為佳。該藥具有清熱解毒、涼血、活血、潤肺止咳的功效，主治暑熱高燒，肺熱咳嗽，咯血，跌打扭傷，血瘀疼痛，瘡毒疥癬，水火燙傷等[1～2]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)紫背天葵有抗氧化、自由基清除、擴(kuò)張血管、抗血小板凝集、提高免疫力、抗癌等多方面的生物活性[3～6]。目前的紫背天葵成分研究表明，藥材含有大量花色苷、黃酮苷和活性多糖化合物等有效成分，其中主要的成分是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[7～12]。目前相關(guān)的研究報(bào)道主要集中在不同成分的提取及穩(wěn)定性研究上，使用HPLC測定其成分的研究未見報(bào)道。本課題組采用HPLC法對8個(gè)不同產(chǎn)地的10批紫背天葵樣品中的成分矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量進(jìn)行測定。

1 材料和儀器

1.1 儀器與設(shè)備 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，包括：四元泵，脫氣機(jī)，二極管陣列檢測器，柱溫箱，Chemstation工作站。R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；HN-1006型超聲波清洗機(jī)(廣州市華南超聲設(shè)備有限公司)。

1.2 藥物與試劑 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品(批號：20160201)購自Hyphytochem公司，純度≥98%；甲醇、乙腈為色譜純(色譜試劑均購自德國默克股份公司)，其他試劑為分析純，水為高純水(高純水為自制)。紫背天葵干品(干品的來源：廣東肇慶2批，購自廣州至信藥業(yè)有限公司；廣西桂林，廣西玉林，網(wǎng)購自峻豪野生中藥行；湖南永州、安徽亳州，網(wǎng)購自豐豐藥行；福建南平2批、江西宜豐、廣東陽江，網(wǎng)購自鑫淼中藥材批發(fā))，經(jīng)廣州市皮膚病防治所副主任中藥師龍惠鑒定，均為秋海棠科秋海棠屬的紫背天葵 Begonia fimbristipulate Hance[B.cyclophylla Hook.f.]干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品溶液的制備 取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量溶解，超聲溶解，放冷，定容，制成0.1 mg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品貯備液。精密量取上述溶液2 mL，置10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得0.02 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取不同產(chǎn)地的紫背天葵干品10批分別單獨(dú)粉碎并過40目篩。精密稱取不同產(chǎn)地的樣品粉末各1 g，分別按照如下方法制備：置錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min。取出，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，濾紙濾過，再以0.45 μm濾膜濾至進(jìn)樣瓶，即為供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用色譜柱Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.5%H3PO4(V/V)為流動(dòng)相A，以50%乙腈為流動(dòng)相B(V/V)，按表1的程序進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.8 mL/min；柱溫30℃；檢測波長為280 nm；進(jìn)樣量10 μL；運(yùn)行時(shí)間為80 min。理論板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)算，不得低于3 000。不同產(chǎn)地來源的10批樣品按照以下方法試驗(yàn)：分別精密吸取2.1、2.2項(xiàng)下的對照品溶液與供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取空白甲醇同法進(jìn)樣。結(jié)果顯示，在對照品主峰相應(yīng)的位置(16.67 min)，供試品顯示相同的色譜峰(分離度＞1.5)，空白甲醇對測定無干擾，見圖1～3。

表1 梯度洗脫程序表

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下的對照品0.5mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=18.38X+0.8917(r=0.999 9，n=6)。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在0.05 μg/mL～1 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品HPLC圖

圖2 產(chǎn)地廣東肇慶的紫背天葵供試品HPLC圖

圖3 空白甲醇的HPLC圖

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果矢車菊素-3-O-葡萄糖苷峰面積平均值為363.376，RSD為0.23%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紫背天葵樣品約1 g，精密稱定，按照2.2項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)行測定。結(jié)果測得平均含量為0.039%，RSD為1.4%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液各10 μL，分別于0、2、4、8、12、24小時(shí)注入液相色譜儀進(jìn)測定，測得矢車菊素-3-O-葡萄糖苷平均含量為0.040%，RSD為0.9，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 見表2。取已知含量的同一批紫背天葵樣品約0.5 g，各6份，精密稱定，置三角瓶中，分別精密加入矢車菊素 -3-O-葡萄糖苷對照品溶液各 2 mL(0.1 mg/mL)，照供試品溶液方法處理，計(jì)算回收率。

表2 加樣回收率測定結(jié)果

2.9 樣品的含量測定 見表3。取不同產(chǎn)地的紫背天葵，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量。

表3 不同產(chǎn)地紫背天葵樣品的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量

3 討論

3.1 吸收波長的選擇 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷紫外可見光譜圖顯示，在280 nm及520 nm有最大吸收(見圖4)。供試品在該兩處波長下，前者峰較多、分離度良好，較好地體現(xiàn)出了紫背天葵樣品的特征，而后者有僅寥寥數(shù)個(gè)峰。因此選擇280 nm作為測定波長。通過對不同來源的10批樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果表明不同來源的紫背天葵表現(xiàn)出了不同的HPLC特征，所含矢車菊素-3-O-葡萄糖苷差異較大。其中以廣東肇慶產(chǎn)的含量最高，達(dá)到0.068%，該結(jié)論跟傳統(tǒng)鑒定中的道地藥材是一致的，表明以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷做為紫背天葵的主要成分做檢測是可靠的，該方法可以準(zhǔn)確測定紫背天葵中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量，重復(fù)性好，可作為控制紫背天葵質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

3.2 關(guān)于流動(dòng)相的選擇 本研究曾考察了甲醇—磷酸溶液、乙腈—磷酸溶液系統(tǒng)，結(jié)果以后者的峰形及分離較好。通過嘗試不同比例的乙腈溶液與不同濃度的磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，最終確認(rèn)了分離度較高的梯度洗脫程序。在設(shè)定的程序下，主峰分離度大于1.5，符合測定要求。同時(shí)考察了不同濃度的甲醇及不同的提取方法，包括回流提取、超聲波提取法。結(jié)果表明，使用25倍量(W/V)純甲醇超聲30 min后，主成分基本溶出，操作簡便、快捷。

圖4 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷UV吸收光譜圖

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Research on Content Determination of Procyanidin-3-O-glucoside in Begonia Fimbristipula Hance with HPLC

SHAO Kaozhen，HE Shuying

Objective：To establish high performance liquid chromatography(HPLC)method for content determination of Procyanidin-3-O-glucoside in Begonia Fimbristipula Hance.Methods：Adopted chromatographic column Shim-pack VP-ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm，mobile phase was 0.5%Phosphoric acid-50% acetonitrile，detection wavelength was 280nm；flow rate was 0.8 mL/min and column temperature was 30℃).Results：Procyanidin-3-O-glucoside and peak area were in a good linear relationship(r=0.999 9)in the range of 0.05 μg～1 μg.The average sample recovery rate was 100.4%，RSD(relative standard deviation)was 1.3%(n=6).Conclusion：The therapy can determine contents of Procyanidin-3-O-glucoside in Begonia fimbristipula Hance accurately，with good repeatability.It’s an important indicator to control the quality of Begonia fimbristipula Hance.

Begonia fimbristipula Hance；High Performance Liquid Chromatography(HPLC)；Procyanidin-3-O-glucoside；Determination of content

R284

A

0256-7415（2016）12-0204-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.087

2016-07-03

邵考珍（1975-），女，主管中藥師，研究方向：中藥材的HPLC指紋圖譜。