劉飛，馬騰茂，王蓉，羅奎元，強(qiáng)宇靖，楊秀娟，高慧琴

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

HPLC法測(cè)定秦艽及其不同配伍藥對(duì)中兩種環(huán)烯醚萜苷類成分含量研究

劉飛，馬騰茂，王蓉，羅奎元，強(qiáng)宇靖，楊秀娟，高慧琴

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

目的：建立HPLC法同時(shí)測(cè)定秦艽及其不同配伍藥對(duì)（秦艽威靈仙、秦艽桑寄生、秦艽防己）水煎液中兩種環(huán)烯醚萜苷類成分含量的方法。方法：采用Agilent A3000250×046 Pursuit 5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱；流動(dòng)相為甲醇（A） -0.04%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～28 min，A 15%→23%；28～35 min，B 23%→35%；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。結(jié)果：獐牙菜苦苷、龍膽苦苷分別在0.025 8 μg～1.032 0 μg、0.265 μg～10.60 μg內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.67%（RSD=2.55%，n=6），101.36%（RSD=2.86%，n=6），與單味秦艽比較，三組藥對(duì)中獐芽菜苦苷的含量均升高，尤以秦艽威靈仙藥對(duì)升高明顯；三組藥對(duì)中龍膽苦苷含量亦發(fā)生了變化，其中秦艽威靈仙藥對(duì)中龍膽苦苷含量升高，而秦艽桑寄生藥對(duì)、秦艽防己藥對(duì)中龍膽苦苷含量卻降低，尤以秦艽桑寄生藥對(duì)降低明顯。結(jié)論：秦艽配伍用藥后所含的有效成分含量發(fā)生了變化；本研究所建立的龍膽苦苷、獐牙菜苦苷含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性較好。

HPLC；秦艽；秦艽-威靈仙；秦艽-桑寄生；秦艽-防己；環(huán)烯醚萜苷；含量測(cè)定

秦艽味辛、苦，性平，歸胃、肝、膽經(jīng)，具有袪風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛等功效，臨床主要用于風(fēng)濕痹證、筋脈拘攣、關(guān)節(jié)屈伸不利等，素有風(fēng)寒濕三痹要藥之稱[1]。本研究在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，以性平祛風(fēng)濕中藥秦艽為基本藥，分別配伍威靈仙、桑寄生、防己，組成平溫相配(秦艽+威靈仙)、平平相配(秦艽+桑寄生)、平寒相配(秦艽+防己)的配伍關(guān)系，通過前期秦艽寒熱不同配伍藥對(duì)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠作用的觀察，發(fā)現(xiàn)其作用強(qiáng)弱有別[2]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版(一部)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)祛風(fēng)濕中藥秦艽中的龍膽苦苷進(jìn)行定量測(cè)定，相關(guān)文獻(xiàn)亦有關(guān)于單味秦艽中的龍膽苦苷、獐芽菜苦苷同時(shí)含量測(cè)定的方法[2～4]，但關(guān)于秦艽配伍藥對(duì)中龍膽苦苷、獐芽菜苦苷同時(shí)含量測(cè)定方法的研究尚未見報(bào)道。本研究采用HPLC法測(cè)定單味秦艽及秦艽藥對(duì)中的龍膽苦苷及獐芽菜苦苷的含量變化，為秦艽及其寒熱不同配伍藥對(duì)的祛風(fēng)濕作用及化學(xué)成分的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥材 實(shí)驗(yàn)所用藥材均購(gòu)自蘭州惠仁堂藥店，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李成義教授鑒定：秦艽為龍膽科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.的干燥根，威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根及根莖，桑寄生為桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis(DC.)Danser的干燥帶葉莖枝，防己為防己科植物粉防己Stephania tetrandra S. Moore的干燥根。

1.2 儀器與試劑 Agilent1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；SK3300H型超聲清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；BT125D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；102電熱鼓風(fēng)干燥箱(龍口市先科儀器公司)；500mLMYB型電子調(diào)溫電熱套(天津市中實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。獐芽菜苦苷對(duì)照品(批號(hào) PY20150915GF)，龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)PY20150908AT)，以上對(duì)照品純度均為98%，均購(gòu)自南京普怡生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)默克公司)；水為超純水；磷酸及其他試劑均為市售分析純(廣州化學(xué)試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為A3000250×046 Pursuit 5 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.04%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～28 min，A相15%→23%；28～35 min，B相23%→35%)；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 高濃度對(duì)照品溶液的制備：精密稱取獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對(duì)照品1.032 mg、10.60 mg分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別制成對(duì)照品高濃度溶液。低濃度對(duì)照品溶液的制備：分別精密量取獐牙菜苦苷、龍膽苦苷高濃度對(duì)照品溶液各1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別制成對(duì)照品低濃度溶液。精密量取上述高濃度對(duì)照品溶液各1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得0.010 32 mg/mL獐牙菜苦苷、0.106 0mg/mL龍膽苦苷的混合對(duì)照品溶液，置4℃冰箱保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備 分別稱取秦艽1 g，秦艽-威靈仙(質(zhì)量比1∶1)2 g，秦艽-防己(質(zhì)量比1∶1)2 g，秦艽-桑寄生(質(zhì)量比1∶1)2 g。分別置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入十倍量純水，回流加熱提取60 min，稍冷后過濾于100 mL容量瓶中，藥渣再加八倍量純水，回流加熱提取30 min，稍冷后過濾于原100 mL容量瓶中，加純凈水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液5 μL進(jìn)樣分析。

2.4 陰性樣品液的制備 分別稱取威靈仙、防己、桑寄生藥材各1 g，按2.3項(xiàng)下方法分別制成威靈仙、防己、桑寄生單煎陰性樣品液。

圖1 高效液相色譜圖 (A：獐芽菜苦苷，B：龍膽苦苷)

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品液各5 μL，在上述選定的色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，HPLC色譜圖見圖1。結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷的保留時(shí)間分別在23.4 min、27.8 min，峰分離度良好，陰性樣品無干擾。

2.6 線性關(guān)系 分別依次精密吸取2.2項(xiàng)下的高濃度對(duì)照品溶液各2.5 μL、5 μL、10 μL及低濃度對(duì)照品溶液各2.5 μL、5μL、10 μL、15 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)X為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獐牙菜苦苷的回歸方程為：Y=2 205.1X-27.099，(r= 0.999 7)，龍膽苦苷的回歸方程為：Y=1 964.5X-169.25，(r=0.999 8)。結(jié)果表明獐牙菜苦苷在0.025 8 μg～1.032 0 μg、龍膽苦苷在0.265 μg～10.60 μg的含量范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取獐芽菜低濃度苦苷對(duì)照品溶液、龍膽苦苷低濃度對(duì)照品溶液各5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)得獐芽菜苦苷、龍膽苦苷的峰面積RSD值分別為1.96%、2.06%，結(jié)果表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取秦艽1 g，平行6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，5 μL進(jìn)樣檢測(cè)分析，煎液中獐芽菜苦苷、龍膽苦苷含量的RSD分別為2.16%、1.48%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，獐芽菜苦苷、龍膽苦苷峰面積RSD值分別為1.64%、1.40%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.10 加樣回收率試驗(yàn) 見表1、表2。稱取已知含量的同一批號(hào)秦艽樣品6份，分別加入一定量的獐芽菜苦苷對(duì)照品、龍膽苦苷對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣5 μL，記錄色譜峰，計(jì)算加樣回收率。

表1 獐芽菜苦苷加樣回收率結(jié)果

表2 龍膽苦苷加樣回收率結(jié)果

2.11 樣品的測(cè)定 見表3。取4種樣品(秦艽、秦艽-威靈仙、秦艽-防己、秦艽-桑寄生)按2.3項(xiàng)下方法平行制備3份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣5 μL，測(cè)得獐芽菜苦苷、龍膽苦苷峰面積并代人回歸方程計(jì)算獐芽菜苦苷、龍膽苦苷的含量。

表3 不同配伍樣品中獐芽菜苦苷、龍膽苦苷含量的測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取獐芽菜苦苷對(duì)照品、龍膽苦苷對(duì)照品適量，在190 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示獐芽菜苦苷、龍膽苦苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為236 nm、270 nm，綜合考慮，在245 nm波長(zhǎng)處，獐牙菜苦苷、龍但苦苷的靈敏度均較高，雜質(zhì)干擾少，故選擇245 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的選擇 在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[5～9]，根據(jù)指標(biāo)性成分的理化性質(zhì)和色譜行為，我們分別對(duì)柱溫，流動(dòng)相，進(jìn)樣量等條件進(jìn)行了摸索。比較了多種柱溫，優(yōu)選出柱溫為30℃；比較了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水多種洗脫系統(tǒng)，分別進(jìn)行等度與梯度的洗脫方式，結(jié)果表明，采用甲醇-磷酸水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，各成分的分離效果較好；比較了多種進(jìn)樣量，結(jié)果顯示5 μL較合理。

3.3 樣品的制備方法 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合臨床給藥模式，采用經(jīng)典而傳統(tǒng)的水煎煮樣品制備方法，煎煮后又采用三種處理方法，第一種方法，直接用純凈水定容至刻度；第二種方法，濃縮到定量，精密移取少量用甲醇定容至刻度；第三種方法，濃縮至干，加甲醇定容至刻度，結(jié)果顯示，第一種處理方法得到的色譜峰分離度良好，有效成分含量高，故選擇第一種方法。

3.4 含量測(cè)定的討論 本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定秦艽及其配伍藥對(duì)中的兩種有效成分，方法簡(jiǎn)便、有效，與單味秦艽相比，三組藥對(duì)中獐芽菜苦苷的含量均升高，尤以秦艽威靈仙藥對(duì)升高明顯；三組藥對(duì)中龍膽苦苷含量亦發(fā)生了變化，其中秦艽威靈仙藥對(duì)中龍膽苦苷含量升高，而秦艽桑寄生藥對(duì)、秦艽防己藥對(duì)中龍膽苦苷含量卻降低，尤以秦艽桑寄生藥對(duì)降低明顯。含量測(cè)定結(jié)果顯示，秦艽配伍用藥后，有效成分含量確實(shí)有所改變，這種有效成分含量的改變，與其臨床藥效之間的關(guān)聯(lián)性還需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Simultaneous Content Determination of 2 kinds of Iridoid Glycosides in Gentiana macrophylla Pall and Its Different Double-Drugs Compatibility with HPLC

LIU Fei，MA Tengmao，WANG Rong，LUO Kuiyuan，QIANG Yujing，YANG Xiujuan，GAO Huiqin

Objective：To establish HPLC(high performance liquid chromatography)method for simultaneous determination of 2 kinds of Iridoid glycosides’composition in Gentiana macrophylla Pall and its different double-drugs compatibility(Gentiana macrophylla Pall-Clematis chinensis Osbeck，Gentiana macrophylla Pall-Herba taxilli， Gentiana macrophylla Pall-Radix stephaniae tetrandrae)decoction.Methods：Adopted chromatograph column Agilent A3000250×046 Pursuit 5 C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，mobile phase was methanol(A)-0.04%phosphoric acid solution(B)，gradient elution：0～28 min，A 15%→23%；28～35 min，B 23%→35%；flow rate was 0.8 mL/min；column temperature was 30℃；detection wavelength was 245 nm.Results：Swertiamarin and gentiopicroside were in a good linear relationship within 0.025 8 μg～1.032 0 μg，0.265μg～10.60 μg separately.Average recovery rate was 99.67%(RSD=2.55%，n=6)，101.36%(RSD=2.86%，n=6)separately. Compared with single Gentiana macrophylla Pall，contents of swertiamarin in the three drug pairs were increased，especially in drug pair Gentiana macrophylla Pall-Clematis chinensis Osbeck.Contents of Gentiopicroside in the three groups were changed.Contents of swertiamarin in drug pair Gentiana macrophylla Pall-Clematis chinensis Osbeck was increased，but was decreased in drug pair Gentiana macrophylla Pall- Radix Stephaniae Tetrandrae，especially in drug pair Gentiana macrophylla Pall-Herba Taxilli.Conclusion：Content of active components in Gentiana macrophylla Pall was changed after compatibility medication.Determination method of Gentiopicroside and Swertiamarin that established in this research is simple，accurate and has good repeatability.

High performance liquid chromatography(HPLC)；Gentiana macrophylla Pall；Gentiana macrophylla Pall -Clematis chinensis Osbeck； Gentiana macrophylla Pall- Herba Taxilli； Gentiana macrophylla Pall-Radix Stephaniae Tetrandrae；Iridoid glycosides；Content determination

R284

A

0256-7415（2016）12-0217-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.091

2016-07-06

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（81360648）

劉飛（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥及復(fù)方應(yīng)用的研究。

高慧琴，E-mail：ghq@gszy.edu.cn。