海帶轉(zhuǎn)錄組SSR序列特征及其相關(guān)基因功能分析

李秋瑩, 張 杰, 姚建亭 王秀良 段德麟

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

海帶轉(zhuǎn)錄組SSR序列特征及其相關(guān)基因功能分析

李秋瑩1,2,3, 張 杰1,2,3, 姚建亭1,2, 王秀良1,2, 段德麟1,2

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

對海帶(Saccharina japonica)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 從70 497條Unigenes中共檢測到9 237個(gè)簡單序列重復(fù)(SSR)位點(diǎn), 并對包含SSR序列的Unigenes進(jìn)行功能注釋。海帶轉(zhuǎn)錄組中SSR的類型十分豐富, 其中單核苷酸和三核苷酸重復(fù)SSR的數(shù)量最多, 分別占SSR總數(shù)的40.9%和39.4%, 其次為四核苷酸、二核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù), 分別占SSR總數(shù)的9.8%, 6.1%, 3.1%和0.7%。SSR重復(fù)單元類型共有147種, 其重復(fù)次數(shù)的范圍為5～70次。功能注釋發(fā)現(xiàn)約50%含有SSR的Unigenes獲得了注釋信息, 并且大多數(shù)與已知蛋白有同源性。COG、GO功能分類結(jié)果均表明, 大量含有SSR序列的基因與多種生物功能有關(guān), 其中與碳水化合物代謝及參與細(xì)胞組成相關(guān)的基因數(shù)量最多。本研究結(jié)果為深入開發(fā)功能性SSR標(biāo)記奠定基礎(chǔ), 也為開展海帶分子標(biāo)記輔助選育提供支持。

微衛(wèi)星; 轉(zhuǎn)錄組; 簡單序列重復(fù)(SSR); 海帶(Saccharina japonica)

海帶(Saccharina japonica)是中國重要的養(yǎng)殖海藻之一, 廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。全球海帶養(yǎng)殖主要集中在中國、日本和韓國。中國作為海帶養(yǎng)殖大國, 年產(chǎn)海帶近500萬t, 占全球海帶產(chǎn)量的86%左右[1]。海帶的重要性狀均為典型的數(shù)量性狀[2], 其遺傳機(jī)制十分復(fù)雜。海帶重要性狀的分子遺傳解析有賴于有效的分子標(biāo)記的開發(fā)。近年來, 許多研究應(yīng)用AFLP、RAPD、SSR等分子標(biāo)記, 對海帶進(jìn)行種群遺傳、數(shù)量性狀作圖等研究[2-6]。

相比于顯性標(biāo)記, 共顯性的簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat, SSR)標(biāo)記(也稱為微衛(wèi)星標(biāo)記)具有共顯性、多等位, 變異高等優(yōu)點(diǎn), 在基因組中分布廣泛, 常被應(yīng)用于群體遺傳分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、QTL作圖等研究[7]。海帶中運(yùn)用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳研究的報(bào)道較少。Liu等[8]通過EST數(shù)據(jù)開發(fā)了15個(gè)海帶EST-SSR并成功應(yīng)用到QTL作圖和海帶群體遺傳多樣性分析中。由于受全基因組序列信息缺乏的限制, 海帶中尚未開展高通量SSR標(biāo)記的開發(fā), 海帶中開發(fā)的可用SSR標(biāo)記還十分有限[8-11]。因此, 開發(fā)更多可用的SSR標(biāo)記對海帶的遺傳研究具有重要意義。以往常用富集文庫法和從數(shù)據(jù)庫中已知的EST序列開發(fā)SSR, 但這些方法均耗時(shí)、費(fèi)力, 且效率低。高通量測序的不斷增加為SSR的開發(fā)提供了豐富資源, 如轉(zhuǎn)錄組和基因組的測序數(shù)據(jù)。SSR根據(jù)其開發(fā)來源的不同可以分為: 基因組SSR (genomic SSR)和轉(zhuǎn)錄組SSR(genic SSR)?；蚪MSSR常比轉(zhuǎn)錄組SSR更易呈現(xiàn)出多態(tài)性, 而轉(zhuǎn)錄組SSR比基因組的SSR更易與表型性狀相關(guān)聯(lián)[12]。

本文基于海帶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對其SSR的組成和分布特征進(jìn)行分析, 并對含有SSR序列的Unigenes進(jìn)行功能注釋與分類, 為從海帶中開發(fā)具有功能的SSR標(biāo)記并應(yīng)用于數(shù)量性狀遺傳解析及分子標(biāo)記輔助選育提供有利資源。

1 材料與方法

1.1 海帶轉(zhuǎn)錄組中SSR序列的分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來源于本實(shí)驗(yàn)室分別對黑暗處理和藍(lán)光誘導(dǎo)下海帶幼孢子體的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[13]。使用MISA腳本工具(http: //pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組一共得到的70 497條非冗余Unigenes (總長度為37 895 389 bp)進(jìn)行了SSR序列的篩選。篩選條件為單核苷酸重復(fù)次數(shù)至少15次, 二核苷酸重復(fù)次數(shù)至少8次, 三核苷酸重復(fù)次數(shù)至少6次,四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)至少5次, 復(fù)合型SSR的中間間隔小于10 bp。利用Primer3 version 4.0(http: // frodo.wi.mit.edu/primer3)對SSR進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.2 含有SSR序列的Unigene的功能分析

使用Blastall程序分別將含有SSR序列的Unigene比對到Nr蛋白數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫和Cluster of Orthologous Groups (COG) 數(shù)據(jù)庫(E-value ＜1e-5)。使用Blast2go 和WEGO軟件分別對Unigenes進(jìn)行Gene ontology (GO) 注釋信息分析和功能分類[14-15]。含有單核苷酸序列的Unigenes未進(jìn)行功能分析。

2 結(jié)果

2.1 SSR序列的分布

利用MISA腳本工具在海帶轉(zhuǎn)錄組70 497條Unigenes中檢測到9 237個(gè)SSR位點(diǎn)。在檢測的Unigenes中包含SSR的Unigenes共7 725條, 其中1 238條包含2個(gè)或2個(gè)以上的SSR位點(diǎn)。在檢測到的SSR位點(diǎn)中, 185個(gè)位點(diǎn)以復(fù)合形式存在。海帶轉(zhuǎn)錄組中SSR的平均分布頻率為每4.1 kbp一個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR類型分析顯示其類型十分豐富, 且各種類型分布頻率不均衡。單核苷酸和三核苷酸重復(fù)的SSR類型數(shù)量最多、所占比例最大, 分別為3 781個(gè)(40.9%)和3 642個(gè)(39.4%), 共占SSR總數(shù)的80.3%。而二、四、五和六核苷酸重復(fù)類型共占SSR總數(shù)的19.7%, 其數(shù)目和所占的比例分別為568(6.1%)、901(9.8%)、282(3.1%)、63(0.7%)。

一個(gè)SSR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)是可變的, 這也是SSR呈現(xiàn)多態(tài)的主要原因。由于篩選條件的原因, 海帶轉(zhuǎn)錄組SSR最小重復(fù)次數(shù)為5, 最大的重復(fù)次數(shù)為70,重復(fù)6次的SSR位點(diǎn)最多, 占總數(shù)的20.6%(1 901個(gè)) (圖1)。以二、四、五和六核苷酸為重復(fù)單元的SSR重復(fù)次數(shù)主要集中在5～14次。長度超過20 bp的SSR序列共3 032個(gè)。二、四、五和六核苷酸重復(fù)單元的最大重復(fù)次數(shù)分別為70(GA)、40(ACA)、44(TAGA)、13(AAGCA)和10(CATCAC)。

2.2 SSR重復(fù)單元類型

本研究中, 海帶轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元的類型共有147, 其中將互補(bǔ)的序列歸為一種類型。擁有重復(fù)單元類型最多的是五核苷酸重復(fù)(64種, 圖2)。二核苷酸最豐富的重復(fù)單元類型為AG/CT型(53%), 而CG/GC類型最少, 在二核苷酸重復(fù)類型總數(shù)中所占比例不足1%(圖3)。在三核苷酸重復(fù)單元中, AGC/CTG重復(fù)所占比例高達(dá)46%, 其次為ACC/GGT(14%) (圖3)。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)單元類型較多, 所占比例較低, 有的類型僅出現(xiàn)1次。除單核苷酸重復(fù)外, 在所有重復(fù)單元類型中出現(xiàn)頻率最多的是AGC/CTG。

圖1 海帶轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)次數(shù)的SSR數(shù)量變化Fig. 1 Variations in SSR for different repeat times in the Saccharina japonica transcriptome

圖2 海帶轉(zhuǎn)錄組不同核苷酸類型SSR含有的重復(fù)單元類型數(shù)目Fig. 2 Number of repeat motif types in different SSR types in the Saccharina japonica transcriptome

圖3 海帶轉(zhuǎn)錄組中二核苷酸和三核苷酸SSR的不同重復(fù)單元的比例Fig. 3 Proportion of different motifs in dinucleotide and thrinucleotide SSRs of the Saccharina japonica transcriptome

2.3 SSR相關(guān)Unigene的功能注釋與分類

為了解所獲得的SSR序列可能的生物學(xué)功能,我們對含有SSR序列的Unigene (共4 728條)進(jìn)行了功能注釋分析(單核苷酸除外)。同源比對分析結(jié)果表明2 240條(47.4%), 1 835條(38.8%), 1 384條(29.3%)和1 072條(22.7%)Unigenes分別與Nr、Swissport、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫中的已知序列具有高度同源性,其中2 842個(gè)SSR位于的2 366條(50.0%)Unigenes與至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫的蛋白序列具有高度同源性。大部分Unigenes與已知蛋白具有同源性, 464條與假定蛋白或未知蛋白具有較高同源性。

通過COG功能分類對這些注釋的Unigenes進(jìn)行功能歸類。3 967條Unigene共歸為24類(A: RNA加工和修飾; B: 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動態(tài); C: 能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換; D: 細(xì)胞周期調(diào)控, 細(xì)胞分裂, 染色體分裂; E: 氨基酸運(yùn)輸和代謝; F: 核苷酸運(yùn)輸和代謝; G: 碳水化合物運(yùn)輸和代謝; H: 輔酶運(yùn)輸和代謝; I: 脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝; J: 翻譯, 核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成; K: 轉(zhuǎn)錄; L: 復(fù)制, 重組和修復(fù); M: 細(xì)胞壁/膜/胞外被膜; N: 細(xì)胞運(yùn)動; O: 翻譯后修飾, 蛋白質(zhì)折疊, 分子伴侶; P: 無機(jī)鹽運(yùn)輸和代謝; Q: 次生代謝物的生物合成, 運(yùn)輸和分解代謝; R: 一般功能預(yù)測; S: 未知功能; T: 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制; U: 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸, 分泌和膜泡運(yùn)輸; V: 防御機(jī)制; W: 細(xì)胞外結(jié)構(gòu); Z: 細(xì)胞骨架)(圖4), 其中“一般功能預(yù)測”是最大一類(占COG注釋的Unigene總數(shù)的12.0%),其次是“碳水化合物運(yùn)輸和代謝”(9.3%)和“細(xì)胞壁/膜/胞外被膜”(9.2%); “細(xì)胞外結(jié)構(gòu)”(0.2%)是最小的一類(圖4)?？梢钥闯龊蠸SR序列的這些基因功能豐富多樣。GO分類分析將3 366個(gè)Unigenes分到3大類(生物學(xué)過程, 細(xì)胞組成, 分子功能)的31個(gè)功能類群中(圖5)。其中, “細(xì)胞”、“細(xì)胞組分”、 “催化活性”以及 “代謝過程”是最大的幾個(gè)功能類群。

圖4 海帶轉(zhuǎn)錄組包含SSR序列的Unigene COG功能分類Fig. 4 COG functional classification of the unigenes containing SSR in the transcriptome of Saccharina japonica

3 討論

3.1 海帶轉(zhuǎn)錄組SSR序列特征

基于已知序列開發(fā)SSR標(biāo)記是SSR標(biāo)記開發(fā)最直接的、快捷的方法。目前已有多個(gè)物種通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析獲得了大量的SSR標(biāo)記[16-18]。我們的研究發(fā)現(xiàn)海帶轉(zhuǎn)錄組中SSR標(biāo)記資源也十分豐富,在70 497條Unigenes中共檢測出9 237個(gè)SSR位點(diǎn),包含各種核苷酸重復(fù)類型。在檢測的SSR類型中, 單核苷酸重復(fù)類型是最多的, 但是由于轉(zhuǎn)錄組與基因組不同, 許多單核苷酸重復(fù)是由RNA聚合酶添加的polyA結(jié)構(gòu), 而不是存在于基因組DNA中的SSR,因此, 在做后續(xù)分析的時(shí)候并未對單核苷酸重復(fù)進(jìn)行分析[19]。除了單核苷酸重復(fù)的SSR外, 最豐富的重復(fù)類型是三核苷酸重復(fù), 這與Zhang等人[11]的研究結(jié)果一致。與高等植物相似, 海帶中AT/TA重復(fù)是二堿基中較豐富的重復(fù)單元, 而CG/GC是最少的[7]。SSR重復(fù)次數(shù)的不同是引發(fā)其長度多態(tài)性的主要原因, 其突變機(jī)制主要有DNA聚合酶滑移錯(cuò)配、不平等重組、錯(cuò)配和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座[7]。而且SSR重復(fù)次數(shù)越多通常多態(tài)性也越高[20]。海帶轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的SSR序列的重復(fù)次數(shù)較高, 最多重復(fù)次數(shù)為70。因此, 我們認(rèn)為這些SSR具有高多態(tài)的潛力, 可在種群遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)研究中發(fā)揮重要作用。

圖5 海帶轉(zhuǎn)錄組包含SSR序列的Unigene GO功能分類Fig. 5 GO functional classification of the unigenes containing SSR in the transcriptome of Saccharina japonica

3.2 海帶SSR序列相關(guān)功能分析

海帶轉(zhuǎn)錄組中SSR序列所在Unigenes的功能注釋結(jié)果表明, 約50%的含有SSR的Unigenes具有注釋信息, 并且大多數(shù)與已知蛋白具有高度同源性。COG、GO功能分類結(jié)果均表明, 大量的SSR序列分布在與碳水化合物代謝及細(xì)胞組成相關(guān)的基因中。其中一些基因可能與海帶中重要的多糖, 甘露醇、褐藻膠和巖藻多糖的合成積累相關(guān), 因?yàn)樗鼈兎謩e是海帶中重要的儲存多糖及細(xì)胞壁組成成分[21]。我們選取了含有SSR的幾個(gè)參與淀粉和蔗糖代謝、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝的重要基因進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)(表1), 以便于后續(xù)應(yīng)用研究。分布于這些基因中的SSR變異可能會與海帶中這些多糖的合成和積累有關(guān)。并且碳水化合物代謝作為基礎(chǔ)能量代謝, 與海帶其他性狀形成也相關(guān)。因此, 研究這些功能性SSR標(biāo)記可為海帶中相關(guān)多糖積累及細(xì)胞壁形成研究提供支撐, 也為將來海帶的分子標(biāo)記輔助選育提供依據(jù)。

4 結(jié)論

利用已知的海帶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)海帶SSR標(biāo)記是較為直接、快捷的方法。海帶轉(zhuǎn)錄組中的SSR類型豐富且重復(fù)次數(shù)較高, 具有較高的多態(tài)性潛能,是開發(fā)新的SSR標(biāo)記的重要資源。海帶轉(zhuǎn)錄組中大量含有SSR序列的基因參與多種生物功能, 其中參與基礎(chǔ)的碳水化合物代謝的基因最多, 這些功能性SSR標(biāo)記更易于進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)研究。因此, 本研究為進(jìn)一步開發(fā)海帶SSR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ), 對于后續(xù)海帶遺傳資源評價(jià)、遺傳圖譜繪制、分子標(biāo)記輔助選育等研究具有重要意義。

表1 海帶中參與多糖代謝部分基因相關(guān)SSR及引物Tab. 1 SSR in the genes involved in carbohydrate metabolism and primer information in Saccharian japonica

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Received: Feb. 6, 2015

Characterization of SSR in Saccharina japonica transcriptome and functional analysis of SSR-containing unigenes

LI Qiu-ying1,2,3, ZHANG Jie1,2,3, YAO Jian-ting1,2, WANG Xiu-liang1,2, DUAN De-lin1,2
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

microsatellite; transcriptome; simple sequence repeat (SSR); Saccharina japonica

In this study, we identified a total of 9 237 SSR (simple sequence repeat) loci in 70 497 unigenes from the transcriptome data of Saccharina japonica and conducted a function analysis of unigenes containing SSR. SSRs were abundant in the transcriptome of S. japonica, and the most commonly repeating motifs were mononucleotides and trinucleotides (40.9% and 39.4% of the total SSRs, respectively), followed by tetranucleotides, dinucleotides, pentanucleotides, and hexanucleotides (9.8%, 6.1%, 3.1%, and 0.7% of the total SSRs, respectively). There were 147 repeated motif types ranging from 5 to 70 repetitions. Our analysis of the functional annotation revealed that nearly 50% of the unigenes containing SSRs contain annotation information and that most of them are homologous to known proteins. Our clusters of orthologous group (COG) classification and gene ontology (GO) assignment results indicate that genes containing SSR are involved in various biological functions, of which carbohydrate metabolism and cell components are the top two. These SSRs provide new resources for further developing functional SSR markers, which can play important roles in molecular marker-assisted selection while breeding S. japonica.

S917.3

A

1000-3096(2016)11-0001-06

10.11759/hykx20150206001

(本文編輯: 劉珊珊)

2015-02-06;

2015-03-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272660); 國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAB01B01); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201405040)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 31272660; National Key Technology Research and Development Program, No. 2013BAB01B01; Ocean Public Welfare Scientific Research Project, No. 201405040]

李秋瑩(1986-), 女, 遼寧錦州人, 博士研究生, 研究方向?yàn)楹Ｔ暹z傳, 電話: 0532-82898554, E-mail: liqiuying21@163.com; 段德麟, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-82898556, E-mail: dlduan@qdio.ac.cn;王秀良, 通信作者, 副研究員, 電話: 0532-82898554, E-mail: xlwang@ qdio.ac.cn