邢梅梅,朱曉娣,邵 欣,康文藝,2,孫慧玲,2,郭秀春,2,*

(1.河南大學中藥研究所,河南開封 475004;2.開封市保健食品功效成分研究重點實驗室,河南開封 475004)

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牛蒡、桑葉和靈芝改善糖尿病作用研究

邢梅梅1,朱曉娣1,邵 欣1,康文藝1,2,孫慧玲1,2,郭秀春1,2,*

(1.河南大學中藥研究所,河南開封 475004;2.開封市保健食品功效成分研究重點實驗室,河南開封 475004)

以牛蒡、桑葉和靈芝組方,研究其水煎煮液降血糖作用。通過尾靜脈注射四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠模型。檢測給藥前后糖尿病小鼠血糖、肝糖原以及血清中TG、TCH、SOD和MDA含量的變化,考察復方對糖尿病小鼠血糖、脂質(zhì)代謝和氧化應激的影響。結(jié)果表明:高劑量組能顯著的升高SOD的水平(p<0.01),降低空腹血糖(p<0.05)、TCH(p<0.05)、TG(p<0.01)和MDA的含量(p<0.01);中劑量組能顯著的升高SOD的水平(p<0.01),降低空腹血糖(p<0.05)、TCH(p<0.05)、TG(p<0.05)和MDA的含量(p<0.05);低劑量組能顯著升高SOD(p<0.01)、肝糖原水平(p<0.05);降低TCH(p<0.05)和TG的含量(p<0.01)。結(jié)果表明：牛蒡、桑葉和靈芝方水提取物具有降低糖尿病小鼠空腹血糖,改善糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝紊亂和增強糖尿病小鼠抗氧化應激的作用。

牛蒡,桑葉,靈芝,水提法,糖尿病

菊科植物牛蒡(Arctium lappa L.)主產(chǎn)于河北、吉林、遼寧和浙江。性辛、苦、寒。歸肺胃經(jīng),具有疏散風熱,宣肺透疹,解毒利咽等功效[1-2]。牛蒡根含有氨基酸、揮發(fā)油、多酚、炔類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、低聚糖、類黃酮、粗纖維、礦質(zhì)元素和維生素等,具有抗突變、防癌、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降脂、降膽固醇、降糖等活性,是我國傳統(tǒng)的藥食兩用珍品[3-5]。從牛蒡根中提取的牛蒡多糖具有良好的體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用,能顯著降低鏈脲霉素所致糖尿病小鼠的血糖水平,改善糖耐量及胰島組織病變狀況[6]。牛蒡根水提物可影響大鼠性行為[7]。

桑葉為?？浦参锷?Morus alba L.)的干燥葉,性甘、苦、寒。歸肺、肝經(jīng)[8]。桑葉中含有糖類、脂肪、氨基酸、膽堿、有機酸、異槲皮苷、胡蘿卜素、維生素B1、維生素B2、維生素C、葉酸、鈣、磷、鐵、錳等營養(yǎng)成分[9]以及黃酮類、生物堿類、甾醇、1-脫氧野尻霉素和桑葉多糖等次生代謝產(chǎn)物[10-11],具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒、抗癌等作用[12-14]。桑葉多糖具有顯著的降血糖作用[15],桑葉多糖增加Ⅱ型糖尿病大鼠脂肪組織葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的基因表達[16]。研究證實了桑葉生物堿、多糖、生物堿聯(lián)合二甲雙胍降糖作用均顯著[17]。實驗研究表明:桑葉中的桑葉黃酮能明顯降低糖尿病小鼠糖化血清蛋白和MDA含量。提高血清胰島素、肝己糖激酶、肝糖原和SOD活力[18]。

靈芝(Ganoderma lucidum karst.)為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體,性甘,平。歸心、肺、肝、腎經(jīng)。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載靈芝可益精氣、安心魂、補肝益氣、堅筋骨、益智?，F(xiàn)代研究表明:靈芝含有有機鍺,能與重金屬、污染物結(jié)合,使之排除體外。使血液循環(huán)暢通,增加紅血球的攝氧能力[19];含有高分子多糖體,有效抑制癌細胞的擴散、保肝、降脂、降糖;含有腺苷,可降低血液粘稠度,預防血栓形成;含有小分子蛋白,可雙向調(diào)節(jié)免疫功能[20]。靈芝廣泛用于抗腫瘤、抗衰老、預防神經(jīng)系統(tǒng)疾病、預防心血管系統(tǒng)疾病、保肝解毒、美容、抗過敏、降壓、降糖等方面[20-21]。黑靈芝多糖具有顯著降血糖、降血脂作用[14],并且黑靈芝多糖可以明顯改善Ⅱ型糖尿病多飲、多食的癥狀。通過調(diào)節(jié)糖尿病大鼠糖脂代謝,改善糖尿病大鼠小血管動脈的病變[22]。靈芝多糖能有效增加小鼠血清胰島素濃度,靈芝多肽和多糖可以降低小鼠空腹血糖含量,可增加小鼠SOD活性,降低肝臟MDA含量[23]。

本課題組預實驗顯示牛蒡、桑葉和靈芝水煎液具有較好的體外抑制α-葡萄糖苷酶活性,在此基礎之上,對牛蒡、桑葉和靈芝組方進行高血糖小鼠實驗研究,探討牛蒡、桑葉和靈芝組方的水煎煮液對糖尿病小鼠的影響。本文首次對牛蒡、桑葉和靈芝組方,進行降血糖作用研究,為開發(fā)降血糖保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡、桑葉和靈芝 開封市樂仁堂藥房;健康昆明系小鼠100只,周齡6～8周,體重22±2 g 由河南省動物中心提供。阿卡波糖 杭州中美華東制藥有限公司,批號:150626;二甲雙胍 上海信誼藥廠有限公司,批號:48150410;氯化鈉注射液 石家莊鵬海制藥有限公司 批號:1510092103;葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物技術有限公司,批號20150804147;葡萄糖標準品 南京建成生物工程研究所,批號:20150804147;甘油三酯測定試劑盒 浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司,批號:2015080021;總膽固醇測定試劑盒 浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司,批號:2015060033;SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所,批號:20151111;肝糖原/肌糖原試劑盒 南京建成生物工程研究所,批號:20151113;丙二醛(MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所,批號:20151113。

UV-2000型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-1010 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;實驗室型噴霧干燥儀 SD-06 英國abplant公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;Multiskan Go全波長酶標儀 Thermo fisher scientificoy Ratastie2,F1-01620 vantaa,Finland;TGL-16gR型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;Power Gen125組織勻漿機 Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 水提物制備方法 將牛蒡、桑葉和靈芝分別粉碎,然后分別稱取牛蒡、桑葉和靈芝各500 g,添加15倍體積蒸餾水(約22.5 L),煎煮2次。第1次煎煮,煮沸后,保持沸騰0.5 h,文火0.5 h;第2次煮沸后,保持沸騰0.5 h。提取液過濾濃縮,用全自動噴霧干燥儀干燥至粉末。

1.2.2 糖尿病小鼠造模方法 選擇22±2 g的雄性小鼠110只,給予充足的水和食物喂養(yǎng)1周,待其適應環(huán)境之后,禁食不禁水10 h,分組染色。空白組10只。糖尿病造模組于禁食不禁水10 h后,按80 mg/kg一次性尾靜脈注射四氧嘧啶致糖尿病[24]。正常飼養(yǎng)96 h,禁食不禁水12 h后,稱重,眼眶靜脈取血,分離血清。測定血清血糖值,將血糖值大于16.7 mmol/L的作為造模成功的標準[25],造模過程中死亡1只,造模成功率77%。按照每組血糖值均衡原則隨機分組:將造模成功的小鼠按血糖值高低分成7個區(qū)段,血糖值過高的舍去。每個區(qū)段隨機分到6個實驗組。

1.2.3 實驗方法 按照血糖值均衡原則將造模成功的糖尿病小鼠分為6組,每組10只。分別為:高劑量組、中劑量組、低劑量組、阿卡波糖陽性對照組、二甲雙胍陽性對照組、模型組[24]?？瞻捉M和模型組都灌胃蒸餾水,其他實驗組都用蒸餾水配成相應的水溶液,灌胃給藥。一天一次,連續(xù)給藥7 d。在最后一次給藥后2 h,眼眶取血測餐后血糖。并于當晚禁食不禁水12 h,第8 d摘取眼球取血,分離血清,放置于冰箱(0～3 ℃)保存。用于測定空腹血糖、TG、TCH、MDA和SOD。處死小鼠,解剖肝臟,制備肝糖原測定液,用于測定肝糖原的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 復方水提取物對空腹血糖和餐后血糖的作用

按照實驗方法1.2.3取血,分離血清,利用葡萄糖測定試劑盒對小鼠空腹血糖和餐后血糖進行了測定。并考察了復方水提取物對小鼠餐后血糖和空腹血糖的影響見表1。

表1 對小鼠空腹血糖和餐后血糖的影響
Table 1 The influence of the fasting blood glucose and postprandial blood glucose in mice

組別劑量(mg/kg)給藥前空腹血糖(mmoL/L)給藥后空腹血糖(mmoL/L)給藥后餐后血糖(mmoL/L)高劑量8002132±482##2794±489?3972±324中劑量4002253±386##3085±526?3924±363低劑量2002430±453##3052±4414244±260阿卡波糖752244±461##3222±2183070±579??二甲雙胍1952132±486##2791±908?4022±304模型2284±460##3594±363##4215±370##空白589±157438±050838±124

注:阿卡波糖、二甲雙胍為陽性對照藥,與空白組相比:#p<0.05,##p<0.01,與模型組相比:*p<0.05,**p<0.01，表2～表4同。

表2 復方對小鼠肝糖原的影響
Table 2 Effects of compound on liver glycogen in mice

由表1可知,各組給藥前空腹血糖值高于空白組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),且阿卡波糖組、二甲雙胍組、模型組、高、中、低劑量組兩兩比較沒有顯著性差異,說明造模成功。由表1可知,給藥7 d后,阿卡波糖組空腹血糖值與模型組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義,說明阿卡波糖對空腹血糖影響不大。二甲雙胍組空腹血糖值與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),說明二甲雙胍可以降低小鼠空腹血糖。高、中劑量組空腹血糖值低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),說明高、中劑量有降低小鼠空腹血糖的作用。

由表1可知,阿卡波糖組餐后血糖值低于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01),說明阿卡波糖可降低餐后血糖。高、中、低劑量組分別與模型組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義,說明該復方水提取物降低餐后血糖的作用不明顯。

2.2 復方水提取物對肝糖原的作用

按照實驗方法1.2.3取血,分離血清,利用肝糖原/肌糖原試劑盒對小鼠肝糖原含量進行了測定。并考察了復方水提取物對小鼠肝糖原含量的影響見表2。

由表2可知,阿卡波糖、二甲雙胍組肝糖原含量高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。該復方水提取物低劑量組肝糖原含量高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。低劑量有效而高、中劑量無效的原因分析如下:肝糖原的含量隨著肝臟放置時間的延長而降低,可能由于高、中劑量組取樣時間長,導致小鼠肝糖原的分解[25]。此外,肝糖原含量還受到取樣部位、勻漿時間、沉降溫度的影響[26]。也有可能是樣品升高肝糖原的最佳濃度在低劑量(200 mg/kg)附近,需要進一步探討其最佳升高肝糖原的濃度。

2.3 復方水提取物對總膽固醇和甘油三酯的作用

按照實驗方法1.2.3取血,分離血清,利用總膽固醇測定試劑盒和甘油三酯測定試劑盒對小鼠膽固醇含量和甘油三酯含量進行了測定。并考察了復方水提取物對小鼠膽固醇含量和甘油三酯含量的影響見表3。

表3 復方對小鼠總膽固醇和甘油三酯的影響
Table 3 The influence of Compound on the total cholesterol and triglyceride in mice

組別TCH(mmol/L)TG(mmol/L)高劑量237±016?151±059??中劑量277±064?171±050?低劑量237±038?137±049??阿卡波糖290±060149±043??二甲雙胍236±014?159±053?模型290±026##233±033##空白143±010091±022

由表3可知,二甲雙胍組、高、中、低劑量組總膽固醇水平均低于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。說明該復方水提取物能夠降低小鼠總膽固醇的水平。

由表3可知,所有組別甘油三脂水平均低于模型組。阿卡波糖組、高、低劑量組與模型組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01);二甲雙胍組、中劑量組與模型組相比,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);說明該復方水提取物能夠降低小鼠甘油三酯的水平。

2.4 復方水提取物對丙二醛和超氧化物歧化酶的作用

按照實驗方法1.2.3取血,分離血清,利用丙二醛(MDA)測試盒和SOD試劑盒對小鼠丙二醛(MDA)含量和SOD含量進行了測定。并考察了復方水提取物對小鼠丙二醛(MDA)含量和SOD含量的影響見表4。

表4 復方對小鼠丙二醛和超氧化物歧化酶的影響
Table 4 The level of Malondialdehydeand superoxide dismutase(SOD)in mice

組別劑量(mg/kg)MDA(mmoL/Ml)SOD(mmoL/mL)高劑量80018.72±2.45**272.59±26.25**中劑量40020.75±3.84*276.85±19.95**低劑量20022.34±3.26284.62±20.69**阿卡波糖7517.58±3.70**246.21±25.24二甲雙胍19517.81±5.69**303.62±13.29**模型26.64±5.74##228.94±41.60##空白13.74±4.49305.49±15.10

由表4可知,阿卡波糖組、二甲雙胍組MDA含量低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01);高劑量組MDA水平低于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01);中劑量組MDA水平也低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。說明該復方水提取物高、中劑量都能夠降低小鼠MDA水平。

由表4可知,阿卡波糖組SOD水平與模型組相比沒有顯著性差異,二甲雙胍組SOD值高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),說明二甲雙胍能夠提高小鼠SOD含量。高、中、低劑量組SOD含量均高于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01);說明該復方水提取物能夠提高小鼠SOD的含量。

王佳佳[6]的研究顯示了牛蒡多糖具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶、降糖、改善糖耐量,降低MDA,提高SOD活力的作用[6]。魏東的研究顯示牛蒡能夠降低高血脂大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平[5]。何羨霞的研究顯示桑葉中生物堿、黃酮、多糖具有重要降糖活性[27]。曹慧的實驗顯示靈芝多糖對STZ致Ⅱ型糖尿病大鼠有一定降低血糖、膽固醇、甘油三酯的作用[28]。本課題組在單味藥具有降糖作用的基礎之上,采用不同于單味藥提取的方法讓三味藥合方,探討其對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的影響。數(shù)據(jù)顯示三者合方水提取物具有降糖、改善脂質(zhì)代謝、抗氧化的作用。本研究僅在動物實驗水平上探討其對糖尿病相關指標的影響,有待進一步探討其在細胞和分子水平上對糖尿病的作用?？蛇M一步探討合方后產(chǎn)生的新的活性。

3 結(jié)論

本文研究了牛蒡、桑葉和靈芝復方水提取物對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的降血糖作用。該復方水提取物降低餐后血糖的作用不明顯;高、中劑量組降低糖尿病小鼠空腹血糖(p<0.05)。低劑量該復方水提取物提高糖尿病小鼠肝糖原的水平(p<0.05),說明低劑量的該復方水提取物具有提高小鼠肝糖原的作用;高、中、低劑量該復方水提物降低總膽固醇和甘油三酯含量,差異均有統(tǒng)計學意義。降低總膽固醇和甘油三酯的作用不存在劑量依賴性;該復方提取物降低丙二醛的作用與劑量有一定的相關性;不同劑量該復方水提取物提高SOD均具有顯著性差異。綜上所述:牛蒡、桑葉、靈芝的復方水提取物能夠降低糖尿病患者的空腹血糖,改善糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂,增強糖尿病小鼠抗氧化應激能力。

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Hypoglycemic effect of the compound of burdock,mulberry leaf and ganoderma lucidum on diabetic rats

XING Mei-mei1,ZHU Xiao-di1,SHAO Xin1,KANG Wen-yi1,2,SUN Hui-ling1,2,GUO Xiu-chun1,2,*

(1.Institute of Chinese Materia Medica,Henan University,Kaifeng 475004,China; 2.Kaifeng Key Laboratory of Functional Components in Health Food,Kaifeng 475004,China)

Burdock,mulberry leaf and ganoderma lucidum were used as the raw material,the decoction of fructus arctii,mulberry leaf,ganoderma lucidum compound was prepared by the water extracts. The change of blood sugar,hepatic glycogen,and serum TG,TCH,SOD,MDA was measured in the diabetic mice model established by the tail vein injection of alloxan. The effects of the compound extract was reflected on diabetes mice blood glucose,lipid metabolism,oxidative stress. The results showed that high dose group of water extract compound could significantly increase the content of SOD(p<0.01),and decrease the content of fasting blood(p<0.05),TCH(p<0.05),TG(p<0.001)and MDA(p<0.05). Medium dose group of water extract compound could significantly increase the content of SOD(p<0.01),and decrease the content of fasting blood(p<0.05),TCH(p<0.05)and MDA(p<0.05). Low dose group of water extract compound could significantly increase the contents of SOD(p<0.01)and liver glycogen(p<0.05),and decrease the content of TCH(p<0.05)and TG(p<0.01). Results indicated that the water extract compound of burdock,mulberry leaf and ganoderma lucidum had significant hypoglycemic effect,and rectified the derangement in lipide metabolism and strengthen antioxidant defense system.

Burdock;mulberry leaf;ganoderma lucidum;water extraction;diabetes

2016-06-01

邢梅梅(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：中藥活性成分提取與分離，E-mail：eieiing@163.com。

*通訊作者:郭秀春(1982-)，女，博士，講師，研究方向：中藥學及天然產(chǎn)物化學，E-mail:guoxiuchun1982@163.com。

國家教育部大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃(201510475073)；河南省產(chǎn)學研項目(152107000051)；河南省高校科技創(chuàng)新團隊(16IRTSTHN019)；2015年河南省教育技術裝備和實踐教育研究立項課題(GZS008)；開封市創(chuàng)新人才項目(1509010)。

TS218

A

1002-0306(2016)23-0338-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.055