鄭雪芳，陳 崢，劉 波，朱育菁，史 懷

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003)

高效液相色譜/四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法篩選產(chǎn)溶血磷脂酸芽胞桿菌

鄭雪芳，陳 崢，劉 波*，朱育菁，史 懷

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003)

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是一種重要細(xì)胞外信號(hào)遞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)第二信使。本研究采用高效液相色譜/四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-QTOF-MS)技術(shù)對(duì)34株不同種類芽胞桿菌的代謝物進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，供試的菌株中只有1株枯草芽胞桿菌BacillussubtilisFJAT-8784的代謝物中檢測(cè)出產(chǎn)溶血磷脂酸，與Metlin代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中溶血磷脂酸的匹配得分達(dá)96.73，該化合物的質(zhì)子化分子離子[M+H]+質(zhì)荷比為439.281 9，質(zhì)量數(shù)為438.275 8，推斷出其分子式可能為C21H43O7P，其相對(duì)含量占發(fā)酵上清液總代謝物的1.32%。

芽胞桿菌；溶血磷脂酸；高效液相色譜/四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)，化學(xué)結(jié)構(gòu)：1-?；?2-羥基-3-磷酸甘油(1-acyl-2-hydroxy-sn-glycerol-3-phosphate)，CAS：944265-88-7。LPA是溶血磷脂的活性成分之一，為一種重要細(xì)胞內(nèi)第二信使，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及細(xì)胞內(nèi)信息傳遞產(chǎn)生多種影響，在維持機(jī)體正常的生理功能，參與各種病理過程的發(fā)生發(fā)展均有著重要的作用[1]。美國(guó)羅德島大學(xué)(university of Rhode Island)的研究人員發(fā)現(xiàn)LPA通過干擾病原菌生物膜的形成，可千倍增強(qiáng)抗生素效果，使得一些較老的β-內(nèi)酰胺類抗生素能再次使用，而且可降低抗生素的使用劑量[2]。Zhang等[3]研究了LPA抗乳房癌的特性，Schleicher等[4]研究了LPA抗輻射敏化作用，Nikitopoulou等[5]研究了LPA治療關(guān)節(jié)炎作用。

關(guān)于溶血磷脂酸來源主要采用化學(xué)合成和酶法合成，Jiang等[6]研究了PLA的選擇性合成。陳家華等[7]研究了溶血磷脂酸(LPA)的化學(xué)合成方法，通過合成重要中間體2-O-芐基甘油，接著先進(jìn)行脂肪?；缓笥寐却姿岫锦プ鳛榱柞；噭┻M(jìn)行磷?；?，最后用PtO2/H2這一還原方法將芐基和苯基同時(shí)還原去保護(hù)，得到了目標(biāo)分子——?；鵏PA，與此同時(shí)，利用相似的方法，醚鍵LPA也被成功地合成。關(guān)于微生物產(chǎn)生LPA研究報(bào)道較少，Hara等[8]報(bào)道了枯草芽胞桿菌甘油醛3-磷酸(sn-glycerol-3-phosphate (G3P))代謝過程發(fā)現(xiàn)LPA的產(chǎn)生，Lu 等[9]發(fā)現(xiàn)了肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae細(xì)胞膜磷脂合成過程產(chǎn)生LPA。

高效液相色譜/四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-QTOF-MS)聯(lián)用技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一門綜合性分析技術(shù)，具有高分離能力、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣和極強(qiáng)的專屬性等特點(diǎn)[10]。本研究利用HPLC-QTOF-MS法對(duì)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所保存的不同種類及地理來源的芽胞桿菌進(jìn)行溶血磷脂酸(LPA)普篩，篩選出具產(chǎn)生LPA的芽胞桿菌，為具有活性芽胞桿菌代謝物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的34株不同種類的芽胞桿菌由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所保存(表1)。芽胞桿菌的固體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，購(gòu)買自上海生工。發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，購(gòu)買自美國(guó)BD公司。試驗(yàn)試劑：色譜純乙腈購(gòu)買自美國(guó)JT Baker公司；色譜純乙酸銨(CNW)購(gòu)買自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。試驗(yàn)儀器：液相四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 1260/6520為美國(guó)安捷倫科技公司生產(chǎn)。

表1 供試芽胞桿菌菌株Table 1 Bacillus strains used

(續(xù)上表)

1.2 試驗(yàn)方法

發(fā)酵液制備: 供試芽胞桿菌在LB培養(yǎng)基上活化，30℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接至20 mL LB種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，為種子液。取種子液按1%接種量接入TSB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液密封，4℃冰箱中備用。樣品制備：取50 mL 芽胞桿菌發(fā)酵液，8 000 r·min-1離心15 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜后，轉(zhuǎn)置GC小瓶，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Extend C18(2.1 mm× 50 mm， 1.8 Micron)，柱溫35℃，進(jìn)樣量為2 μL。流動(dòng)相：A液為10 mmol·L-1的乙酸， B液為乙腈；流速為0.2 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～3 min為90% B和10% A，3～25 min為50% B和50% A，25～35 min為90% B和10% A。QTOF-MS運(yùn)行條件：正離子模式，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為5 L·min-1，霧化器壓力為30 psig，毛細(xì)管電壓為3 500 V，裂解電壓為175 V，Skimmer為65.0 V，質(zhì)量范圍：150～1 000 m·z-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)溶血磷脂酸芽胞桿菌的篩選

利用HPLC-QTOF-MS技術(shù)檢測(cè)到供試的34個(gè)不同種類芽胞桿菌中只有1株產(chǎn)溶血磷脂酸，為枯草芽胞桿菌FJAT-8784，其他菌株暫無檢出該成分。菌株FJAT-8784的溶血磷脂酸與Metlin代謝物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的溶血磷脂酸匹配得分為96.73?？莶菅堪麠U菌FJAT-8784胞外代謝物中溶血磷脂酸相對(duì)含量占其發(fā)酵上清液總代謝物的1.32%。

2.2 芽胞桿菌來源的溶血磷脂酸成分分析

采用HPLC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)34株不同種類芽胞桿菌發(fā)酵上清液中的代謝物進(jìn)行測(cè)定后，利用Mass Hunter軟件，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分子特征提取，然后將它們?cè)贛etlin代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索比對(duì)而獲得各代謝物的信息。結(jié)果表明，從枯草芽胞桿菌FJAT-8784的發(fā)酵上清液中檢測(cè)出溶血磷脂酸(LPA)，色譜圖顯示其特征峰的保留時(shí)間為25.90 min，離子響應(yīng)度為5.90×105(圖1)。FJAT-8784中LPA的掃描質(zhì)譜圖(圖2)和分子特征提取質(zhì)譜圖(圖3)提供了相應(yīng)同位素峰的相對(duì)豐度和同位素峰的間距。

采用正離子模式電離，正離子模式下產(chǎn)生 [M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+等，根據(jù)表2化合物鑒定結(jié)果顯示，化合物的質(zhì)子化分子離子[M+H]+質(zhì)荷比為439.281 9，因而該成分質(zhì)量數(shù)為438.275 8，進(jìn)而推斷出其分子式可能為C21H43O7P，該化合物名稱為溶血磷脂酸(LPA)，其分子結(jié)構(gòu)見圖4。

表2 化合物鑒定結(jié)果Table 2 Identification of related compound

3 討論與結(jié)論

LPA主要來源于血小板，具有生長(zhǎng)激素樣效應(yīng)，在各項(xiàng)細(xì)胞效應(yīng)中起重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[11]。LPA主要功能有以下幾點(diǎn)：(1)促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。Dunlop等[12]在人胰島細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)LPA能激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4)，促進(jìn)其與四環(huán)素D1(cycline D1)形成復(fù)合物，使細(xì)胞從G1期轉(zhuǎn)入S期；(2)抗細(xì)胞淍亡。Murph等[13]首次報(bào)道LPA與Gi偶聯(lián)受體結(jié)合，可以抑制胱門蛋白酶(caspases)的活性，上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)，使致癌基因與抑癌基因比例失調(diào)，腫瘤細(xì)胞淍亡數(shù)目下降；(3)影響神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。張兆輝等[14]證明LPA具有明顯的劑量信賴性的神經(jīng)毒性作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)合成活性氧(ROS)形成而發(fā)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。

關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)溶血磷脂酸的研究報(bào)道較少，Hiraoka等[15]報(bào)道枯草芽胞桿菌RB14能產(chǎn)LPA。Hara 等[8]研究枯草芽胞桿菌甘油醛3-磷酸(sn-glycerol-3-phosphate (G3P)?；^程，發(fā)現(xiàn)了LPA的產(chǎn)生。Lu等[9]發(fā)現(xiàn)了肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae代謝過程合成LPA。有關(guān)芽胞桿菌產(chǎn)LPA的研究報(bào)道較少。芽胞桿菌種類多、數(shù)量大、能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，已在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)保等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[16]。因此，從芽胞桿菌中尋找LPA產(chǎn)物，為開發(fā)新型天然的LPA制劑提供很好的條件。本研究在芽胞桿菌產(chǎn)溶血磷脂酸菌株篩選中，使用了HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，相較于傳統(tǒng)研究方法，具有高通量、高靈敏度、高分辨率及強(qiáng)大的定性分析能力，適用于大量樣品的研究。本研究充分發(fā)揮技術(shù)優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)溶血磷脂酸芽胞桿菌菌株的快速篩選，結(jié)果表明在供試的34種芽胞桿菌，包括枯黃芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌等，只有1株枯草芽胞桿菌FJAT-8784能產(chǎn)次生代謝物L(fēng)PA，這也印證了Hiraoka等的研究，本研究的LPA色譜圖顯示其特征峰的保留時(shí)間為25.90 min，離子響應(yīng)度為5.90×105，與Metlin代謝物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的溶血磷脂酸匹配得分較高，為96.73，分子式為C21H43O7P，相對(duì)含量較高，為1.32%。產(chǎn)溶血磷脂酸枯草芽胞桿菌篩選，使得利用芽胞桿菌作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)LPA成為可能，拓展了LPA來源途徑，為生物活性物質(zhì)LPA的利用奠定基礎(chǔ)，有關(guān)芽胞桿菌產(chǎn)溶血磷脂酸的代謝機(jī)理和應(yīng)用范圍有待進(jìn)一步研究。

[1]何蘭杰. 溶血磷脂酸——一種具有多種生物學(xué)功能的磷脂信號(hào)分子[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2000, 22(3): 121-126.

[2]KROGFELT K A, UTLEY M, KRIVAN H C, et al. Specific phospholipids enhance the activity of β-lactamantibiotics againstPseudomonasaeruginosa[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2000, 46: 377-384.

[3]ZHANG H L, XU X Y, GAJEWIAK J, et al. Dual activity lysophosphatidic acid receptor Pan-Antagonist/Autotaxininhibitor reduces breast cancer cell migration in vitro and causes tumor regression in vivo [J]. Cancer Research, 2009, 69: 5441.

[4]SCHLEICHER S M, THOTALAL D K. Autotaxin and LPA receptors represent potential molecular targets for the radiosensitization of murine glioma through effects on tumor vasculature [J]. PLoS ONE, 2011, 6(7): e22182.

[5]NIKITOPOULOU I, KAFFE E, SEVASTOU I, et al. A metabolically-stabilized phosphonate analog of lysophosphatidic acid attenuates collagen-induced arthritis [J]. PLoS ONE, 2013, 8(7): e70941.

[6]JIANG G, XU Y, FUJIWARAY, et al. Alpha-substituted phosphonate analogues of lysophosphatidic acid (LPA) selectively inhibit production and action of LPA [J]. ChemMedChem, 2007, 2(5): 679-690.

[7]陳家華, 張延?xùn)|. 酯鍵溶血磷脂酸和醚鍵溶血磷脂酸的全合成[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2003, 39(2): 151-157.

[8]HARA Y, SEKI M, MATSUOKA S, et al. Involvement of PlsX and the acyl-phosphate dependent sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase PlsY in the initial stage of glycerolipid synthesis inBacillussubtilis[J]. Genes Genet Syst, 2008, 83(6):433-442.

[9]LUY J, ZHANG Y M, GRIMES K D, et al. Acyl-phosphates initiate membrane phospholipid synthesis in gram-positive pathogens [J]. Molecular Cell, 2006, 23: 765-772.

[10]孟兆玲, 齊元英, 柳仁民. 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2006, 15(6):99-102.

[11]TANGKIJVANICH P, MELTON A C, SANTISKULVONG C. Rho and p38 MAP kinase signaling pathways mediate LPA-stimulated hepatic myofibroblast migration [J]. Journal of Biomedical Science, 2003,(10): 352-358.

[12]DUNLOP M, MUGGLI E, CLARK E. Association of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1 in neonatal cells after mitogenic stimulation by lysophosphatidic acid [J]. BiochemBiophys Res Commun, 1996, 218: 132-136.

[13]MURPH M, MILLS G B. Targeting the lipids LPA and SIP and their signaling pathways to inhibit tumour progression [J]. Expert Reviews in Molecular Medicine, 2007,(9): 1-18.

[14]張兆輝, 衛(wèi)濤濤, 余紹祖, 等. 溶血磷脂酸損傷小腦顆粒神經(jīng)元并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[J]. 卒中與神經(jīng)疾病, 2004, 11(6): 321-324.

[15]HIRAOKA H, ASAKA O, ANO T, et al. Characteristics ofBacillussubtilisRB14, coproducer of peptide antibiotics iturin A and surfactin [J]. Journal of General and Applied Microbiology, 1992, 38(6): 635-640.

[16]SANAHUJA G, BANAKAR R, TWYMAN RM, et al.Bacillusthuringiensis: a century of research, development and commercial applications [J]. Plant Biotechnology Journal,2011, 9:283-300.

(責(zé)任編輯：林海清)

Screening Lysophosphatidic-acid-producingBacillusUsing HPLC and Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry

ZHENG Xue-fang, CHEN Zheng, LIU Bo*, ZHU Yu-jing, SHI Huai

(AgriculturalBio-ResourcesInstitute，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003，China)

Lysophosphatidic acid (LPA) is an important extracellular signal transmitter and intracellular secondary messenger. Metabolites in the supernatants of liquid culture media for 34 strains ofBacilluswere determined by using HPLC and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. It was found that the onlyB.subtilisstrain that produced LPA was FJAT-8784. The obtained LPA showed a matching score of 96.73 according to the Metlin database. It had a molecular weight of 438.2758, and a mass to charge ratio of 439.2819. Consequently, the chemical formula for the isolated LPA was assumed to be C21H43O7P. In the supernatant, the total metabolites contained approximately 1.32% LPA.

Bacillus; lysophosphatidic acid; HPLC/quadrupole time-of-flight mass spectrometry

2016-05-23初稿；2016-09-08修改稿

鄭雪芳(1977-)，女，博士，副研究員，主要從事植物病害生物防治的研究(E-mail:zhengxuefangfz@163.com) *通訊作者：劉波(1957-)，男，博士，研究員，主要從事微生物生物技術(shù)及農(nóng)業(yè)生物藥物研究(E-mail：Fzliubo@163.com)

國(guó)家自然科學(xué)基金(31370059)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015J01103)；福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1018-8)

Q 545

：A

：1008-0384(2016)11-1252-05

鄭雪芳，陳崢，劉波，等.高效液相色譜/四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法篩選產(chǎn)溶血磷脂酸芽胞桿菌[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(11)：1252-1256.

ZHENG X-F，CHEN Z，LIU B，et al.Screening Lysophosphatidic-acid-producingBacillusUsing HPLC and Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1252-1256.