袁桂陽 曹寧寧 王少伯 龔大剛 文廷勇 何艷茹

(1.四川省南充蠶種場，四川 南充 637000；2.四川省閬中蠶種場，四川 閬中 637400)

實(shí)驗(yàn)研究

四川省現(xiàn)行主推家蠶品種資源對BmNPV的抗性研究

袁桂陽1曹寧寧1王少伯1龔大剛2文廷勇1何艷茹1

(1.四川省南充蠶種場，四川 南充 637000；2.四川省閬中蠶種場，四川 閬中 637400)

BmNPV(核型多角體)病毒病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見、危害最嚴(yán)重的一類蠶病，選育對BmNPV高抗力的家蠶品種是家蠶品種選育的主要攻關(guān)課題之一。為了摸清四川現(xiàn)行蠶品種資源對BmNPV的抗性以及和國內(nèi)高抗BmNPV蠶品種的差異，本文通過人工經(jīng)口添食BmNPV病毒的方法對川山、蜀水等20多個(gè)四川省主要家蠶品種的抗BmNPV性能進(jìn)行了檢測，旨在掌握不同品種對BmNPV抗性差異，篩選對BmNPV高抗性的育種素材，為選育BmNPV高抗病品種奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：不同品種對BmNPV抗性存在顯著差異，其中 871C、872C對BmNPV的半數(shù)致死濃度(LC50)均達(dá)109p/mL以上，對BmNPV的抗性顯著。其它品種對BmNPV的半數(shù)致死濃度(LC50)分布在104～105p/mL范圍內(nèi)，對BmNPV的抗性差異不明顯。

蠶病 核型多角體 抗性 半數(shù)致死濃度

在影響?zhàn)B蠶生產(chǎn)的眾多因素中，蠶病是最大的影響因素，往往導(dǎo)致大量病死蠶的發(fā)生，甚至絕收，嚴(yán)重影響?zhàn)B蠶效益和養(yǎng)蠶積極性，進(jìn)而影響產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。據(jù)蠶病普查結(jié)果，養(yǎng)蠶損失中，70%來自蠶病，因家蠶病毒病所造成的損失約占總蠶病損失的70%～80%，而BmNPV病毒病又占到病毒病的60%以上。BmNPV病毒病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見、危害最嚴(yán)重的一類蠶病。特別是20世紀(jì)80年代以來，BmNPV病毒病已成為我國主要蠶區(qū)危害最嚴(yán)重的蠶病。提高家蠶抗病性，培育高抗病蠶品種已成為家蠶育種的重要課題和蠶桑產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障[1]。其中，BmNPV流行規(guī)律以及家蠶對BmNPV的抗性遺傳規(guī)律研究是培育對BmNPV高抗病蠶品種，提高家蠶抗病性的理論基礎(chǔ)。目前，對于BmNPV的傳播流行規(guī)律已基本探明。隨著家蠶基因組的破譯，家蠶對BmNPV抗性遺傳規(guī)律的研究也將取得更大突破。已有研究證明，不同蠶品種對BmNPV的抵抗性存在差異，為選育抗病品種奠定基礎(chǔ)[2～3]。研究發(fā)現(xiàn)，家蠶對BmNPV的抗性為不完全顯性遺傳，既受常染色體上的主效基因控制，又受性染色體上相關(guān)基因的影響[4]。我們對我省現(xiàn)行主要品種資源進(jìn)行了BmNPV抗性鑒定試驗(yàn)，測定了不同品種資源對BmNPV的半數(shù)致死濃度(LC50)，對于進(jìn)一步研究BmNPV抗性遺傳機(jī)制，選育抗BmNPV家蠶品種，抵御蠶病風(fēng)險(xiǎn)，促民增收和維持蠶桑產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 蠶品種及來源

川山B、夏芳、932、芙蓉、871A、菁松A、限1、秋豐、蒼松、碧海、蜀繡、蜀水B、秋白、7532、湘暉、872A、皓月A、限2、854B、日新、星月、渝春由四川省南充蠶種場繁育保存，871C、872C由中國蠶業(yè)研究所引進(jìn)繁育。

1.1.2 核型多角體病原

原始BmNPV病原由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，由我場對原始病原進(jìn)行復(fù)壯、擴(kuò)繁。

1.1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)

四川省南充蠶種場蠶品種改良研究室試驗(yàn)組。

1.1.4 試驗(yàn)時(shí)間

BmNPV病原的復(fù)壯于2016年4月進(jìn)行，BmNPV病原的擴(kuò)繁于2016年5月進(jìn)行，參試品種半致死濃度(LC50)測定于2016年6月進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 病毒復(fù)壯及擴(kuò)繁

病原復(fù)壯采用經(jīng)口添食的方法進(jìn)行，家蠶3齡餉食第2次給桑時(shí)添食原始病毒。添食初始病毒濃度：1×107p/mL，采用25 mm打孔器打孔桑葉，打孔后的桑葉用塑料勺子將初始病毒BmNPV 50 uL均勻涂抹在桑葉上，給桑，采用常規(guī)飼育操作飼養(yǎng)，觀察添食病毒蠶的生長發(fā)育情況。收集典型膿病病死蠶，先用研缽將其磨碎，用雙層紗布過濾2次。然后將收集的過濾液，4000 rpm離心10 min，去上清；重復(fù)離心3次，收集沉淀，4℃保存，備用。

病毒擴(kuò)繁采用注射方式進(jìn)行，5齡餉食第2次給桑后，將以上復(fù)壯后的NPV病毒注射到家蠶腹部8～9環(huán)節(jié)，每頭家蠶注射2 uL。接種病毒4、5d后，待大批發(fā)病時(shí)，收集病蠶，用解剖剪將蠶腹足全部剪掉，將蠶放于雙層紗布上自然流出蠶血并進(jìn)行過濾，濾去雜質(zhì)，將收集的蠶血，800 rpm離心10 min，去沉淀，重復(fù)離心3次。將收集的上清液4000 rpm離心10 min，去上清；加入純凈水，攪拌，再用4000 rpm離心10 min。重復(fù)離心3次，去上清，收集沉淀，4℃保存，備用。

1.2.2 病毒計(jì)數(shù)

用血球計(jì)數(shù)器對制備病毒樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，4℃保存，備用。要求病毒濃度達(dá)到1.0×109p/mL以上，病毒使用前要重新進(jìn)行計(jì)數(shù)，誤差要求控制在相同數(shù)量級范圍之內(nèi)。

1.2.3 不同品種對BmNPV半數(shù)致死濃度(LC50)測定

區(qū)組設(shè)置。先用蒸餾水稀釋病毒，確保病原溶液分散混勻，每個(gè)品種添食BmNPV病毒多角體1×105p/mL、1×106p/mL、1×107p/mL、1×108p/mL、1×109p/mL，共設(shè)5級濃度，先配兌高濃度病毒，然后依次逐級向低濃度稀釋(取1份病毒，加蒸餾水9份)。每處理3個(gè)重復(fù)，共15區(qū)，每試驗(yàn)區(qū)定蠶100頭。為保證數(shù)蠶時(shí)不傷蠶體，采用加網(wǎng)后連同蠶網(wǎng)數(shù)蠶的方法，將記好數(shù)的蠶連同蠶網(wǎng)用剪刀剪下備用。

添食時(shí)間。2齡起蠶餉食添毒，一次性添食完畢，之后飼喂正常桑葉，自然溫濕度條件下飼養(yǎng)，正常眠起處理。

添食病毒。選擇同品種、同葉齡、無蟲眼、折疊的完好桑葉，用打孔機(jī)打成25 mm圓形桑葉。用200 uL移液槍吸取配好的NPV 0.3 mL均勻涂抹于6片桑葉背面(以6片桑葉為單位一字排開，每片0.05 mL)，涂抹過程中用塑料勺均勻展開在全葉面。涂抹病原按照由低濃度到高濃度的順序進(jìn)行。每次吸取病原液時(shí)搖動數(shù)次，確保病原濃度一致。涂抹桑葉稍微涼干后，每區(qū)喂6片桑葉，待添食病毒桑葉食完后，下次給桑改喂正常桑葉。

病蠶診斷。添食病毒后，每天早上8:30觀察記錄蠶的生長發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)病死蠶要及時(shí)挑出，以免交叉感染，并對病蠶進(jìn)行檢驗(yàn)。從感染后48 h開始，每天調(diào)查血液型膿病發(fā)病蠶數(shù)量，至4齡起蠶后調(diào)查結(jié)束[5-6]。血液型膿病病癥判定方法：以血色呈乳白色，鏡檢有核型多角體為標(biāo)準(zhǔn)[7]。

2 結(jié)果分析

2.1 不同品種不同病毒濃度處理后病死蠶統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)以上試驗(yàn)方法，對每天的發(fā)病蠶進(jìn)行鏡檢并記錄，統(tǒng)計(jì)不同品種不同病毒濃度處理的發(fā)病蠶頭數(shù)，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 各品種不同病毒濃度處理的發(fā)病蠶統(tǒng)計(jì)結(jié)果

蠶品種NPV濃度(p/mL)供試蠶頭數(shù)(頭)發(fā)病數(shù)(頭)發(fā)病率(%)限11×1091001001001×1081001001001×10710094941×10610069691×1051002828秋豐1×1091001001001×1081001001001×10710093931×10610076761×1051005656蒼松1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610089891×1051003636碧海1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610084841×1051004949蜀繡1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610080801×1051003434蜀水B1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610091911×1051003636秋白1×1091001001001×1081001001001×10710095951×10610071711×1051004242

蠶品種NPV濃度(p/mL)供試蠶頭數(shù)(頭)發(fā)病數(shù)(頭)發(fā)病率(%)75321×1091001001001×1081001001001×10710096961×10610074741×1051002828湘暉1×1091001001001×1081001001001×10710094941×10610068681×1051002020872A1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610080801×1051003737皓月A1×1091001001001×1081001001001×10710099991×10610078781×1051004444限21×1091001001001×1081001001001×10710099991×10610075751×1051005050854B1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610079791×1051003939日新1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610097971×1051004848

蠶品種NPV濃度(p/mL)供試蠶頭數(shù)(頭)發(fā)病數(shù)(頭)發(fā)病率(%)星月1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610092921×1051003737渝春1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610081811×1051004040872C1×10910042421×10810014141×107100441×106100111×10510000

從表1中可以看出：除871C、872C外，其它品種經(jīng)口添食相同濃度的BmNPV，發(fā)病率均相對較高，特別是在添食1×108p/mL～1×109p/mL高濃度BmNPV條件下，發(fā)病率均接近100%。而871C、872C即使在添食1×109p/mL高濃度BmNPV條件下仍有50%左右未發(fā)病，對BmNPV抗性非常顯著。

2.2 不同品種對BmNPV的抗性測定結(jié)果

根據(jù)表1統(tǒng)計(jì)得到的各品種感染BmNPV累計(jì)發(fā)病數(shù)，運(yùn)用SPSS 13.0軟件，計(jì)算各品種對BmNPV的抗性，以半數(shù)致死濃度(LC50)作為判斷品種抗性強(qiáng)弱的指標(biāo)。BmNPV對家蠶不同品種的毒力測定運(yùn)算結(jié)果見表2。

表2 BmNPV對家蠶不同品種的毒力測定運(yùn)算結(jié)果

從表2中可以看出：871C、872C對BmNPV的半致死濃度(LC50)達(dá)到109p/mL，相比較其它品種高出4～5個(gè)數(shù)量級，對BmNPV的抗性非常顯著。其它品種之間相差不大，對NPV的半數(shù)致死濃度均分布在104～105p/mL范圍內(nèi)，其中菁松A、秋豐對NPV的半數(shù)致死濃度相比其它品種略低，分別為7.4×104p/mL、7.9×104p/mL，剩余品種對NPV的半數(shù)致死濃度均為105p/mL，對NPV抗性差異不明顯。

3 結(jié)論與討論

3.1 871C、872C對BmNPV的抗性顯著高于其它參試品種，其它供試蠶品種之間對BmNPV的抵抗性差異不大

從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，871C、872C對BmNPV的半致死濃度(LC50)均達(dá)到109p/mL，而其它供試家蠶品種對BmNPV的半致死濃度(LC50)僅為104～105p/mL，兩者相差4～5個(gè)數(shù)量級，抗性差異非常明顯。其它供試的四川省主要蠶品種，除個(gè)別品種對BmNPV的半致死濃度(LC50)為104p/mL外，其余均為105p/mL，對BmNPV的抗性差異不明顯。

3.2 本試驗(yàn)為四川抗BmNPV品種選育提供參考數(shù)據(jù)

通過本次試驗(yàn)，建立了成熟的家蠶品種抗BmNPV性能檢測技術(shù)，為完善家蠶品種抗病鑒定體系奠定基礎(chǔ)。同時(shí)掌握了四川部分主要家蠶品種對BmNPV抗性的第一手資料，填補(bǔ)了數(shù)據(jù)空白。同時(shí)，試驗(yàn)表明，選育適合四川氣候特點(diǎn)的抗BmNPV家蠶新品種，如果僅限以四川現(xiàn)行推廣品種資源為親本幾乎不可能，必須引進(jìn)高抗BmNPV家蠶育種素材。

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Appraisal Study on the Resistance of Main PushBombyxmoriBreed to BmNPV

Yuan Guiyang1Cao Ningning1Wang Shaobai1Gong Dagang2Wen Tingyong1He Yanru1

(1SichuanProvinceNanchongSilkwormEggsFarm,NanchongSichuan637000,China;2SichuanProvinceLangzhongSilkwormEggsFarm,LangzhongSichuan637400,China; )

BmNPV is one of the most common and serious silkworm disease. Breeding of BmNPV-high resistance of the silkworm variety is the main research topic of current variety breeding. In order to grasp the difference between different silkworm varieties of BmNPV resistance and the difference of BmNPV-high resistance between varieties in domestic, we had tested the BmNPV resistance of current main silkworm varieties in Sichuan province like Chuanshan and Shushui through artificial mouth lick. The aim of this study was to investigate different resistance of silkworm varieties to BmNPV, and to screen breeding materials with high resistance to BmNPV, which laid the foundation of BmNPV high resistant varieties breeding. The test results showed that the resistance to BmNPV between different varieties was significant and 50% lethal concentration of 871c and 872c to BmNPV was 109p/ml. The differences between the other varieties of the resistance to BmNPV was not significant, and the median lethal concentration (LC50) ranged from 104to 105p/ mL.

Bombyxmoridiseases; Nuclear polyhedrosis virus; Resistance; 50% lethal concentration

袁桂陽(1964-)，男，高級農(nóng)藝師，從事蠶桑生產(chǎn)工作。