趙孟孟，馮松林，王文佳，邢 星，馮嘉萍，張桂紅＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，

廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，鄭州450046；4.廣西欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，欽州535008）

Nsp9基因在Marc－145細(xì)胞上對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的影響

趙孟孟1，2，馮松林2，王文佳3，邢 星4，馮嘉萍2，張桂紅2＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，

廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，鄭州450046；4.廣西欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，欽州535008）

摘 要：試驗(yàn)旨在驗(yàn)證Nsp9基因是否影響豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的復(fù)制。構(gòu)建含有Nsp9全長基因的質(zhì)粒pIRES2－EGFP－Nsp9，并轉(zhuǎn)染到Marc－145細(xì)胞中，接毒之后分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting方法測定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Nsp9基因的Marc－145細(xì)胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上顯著高于未轉(zhuǎn)染Nsp9基因的對(duì)照組（P＜0.05），是對(duì)照組的1.5倍，同時(shí)轉(zhuǎn)染Nsp9基因后的Marc－145上PRRSV N蛋白水平也明顯高于對(duì)照組。隨著劑量的增加，N蛋白的表達(dá)量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上結(jié)果初步可知，Nsp9基因可以在Marc－145細(xì)胞上促進(jìn)PRRSV的復(fù)制，Nsp9基因與其復(fù)制密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；Nsp9基因；Marc－145細(xì)胞；復(fù)制

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒目（Nidovirales）、動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）、動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）成員［1－3］，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，同屬的還有馬動(dòng)脈炎病毒（EAV）、鼠乳酸脫氫酶病毒（LDV）及猴出血熱病毒（SHFV）。其基因組長度為15kb，包含有10個(gè)開放閱讀框（ORFs）。從5′端到3′端依次為ORFla、ORFlb和ORF2－ORF7，每個(gè)ORF和其相鄰的ORF部分重疊。在其5′端和3′端分別有一非編碼區(qū)，5′端非編碼區(qū)前有一個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)，3′端非編碼區(qū)后有多聚腺苷酸（poly A）尾巴［4－6］。ORF2－ORF7編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其中ORF2－ORF5編碼病毒的糖基化蛋白，ORF6編碼膜基質(zhì)蛋白（M），ORF7編碼核衣殼蛋白（N）。ORF1占病毒基因組的80%，編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，Nsp），參與病毒的復(fù)制。ORF1a可繼續(xù)水解為Nsp1a、Nsp1b、Nsp2－Nsp6、Nsp7a、Nsp7b及Nsp8，ORFlb水解為Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12。

Nsp9基因位于ORFlb中，編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp），RdRp在所有正鏈RNA病毒中都編碼，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)錄復(fù)制混合物的亞單位結(jié)構(gòu)［7］。有報(bào)道稱，Nsp9基因與宿主蛋白視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白、膜聯(lián)蛋白A2、DEAD－box RNA解旋酶相互作用促進(jìn)病毒復(fù)制［8－10］，針對(duì)Nsp9基因的siRNA及化合物會(huì)抑制病毒復(fù)制［11－16］，并且Nsp9基因相對(duì)其他病毒蛋白高度保守［17－18］，但Nsp9基因本身是否可以促進(jìn)病毒復(fù)制鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過過表達(dá)Nsp9基因來驗(yàn)證其是否可以促進(jìn)病毒復(fù)制，為研究Nsp9基因的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒 BHK細(xì)胞、pIRES2－EGFP載體和pMD18－T－Nsp9模板均由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清、培養(yǎng)細(xì)胞所用DMEM均購自Gibco公司；雙抗購自廣州展晨公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 Premix Ex Taq DNA聚合酶、內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ、DL2000DNA Marker、SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司；凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司；總RNA提取試劑TRIzol?Reagent購自Invitrogen公司；瓊脂糖購自Biowest公司；溴化乙錠（EB）購自寶泰克生物科技（北京）有限公司；EZNA Endo－free Plasmid Mini KitⅠ購自O(shè)mega公司；裂解液RIPA購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PRRSV Nsp9蛋白單克隆抗體、PRRSV N蛋白單克隆抗體均由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；GAPDH購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)PRRSV Nsp9基因序列特征，應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：上游引物（Nsp9P3－F）：5′－AGCT GTCGATTTAAACTGCTAGCCGCCAGCG－3′；下游引物（Nsp9P4－R）：5′－ATAGGATCC CTCATGATTGGACCCTGAGTTTTTC－3′，下劃線部分分別為XhoⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)。PRRSV N蛋白實(shí)時(shí)熒光定量引物：qN－F：5′－AAACCAGTCCAGAGGCAAGG－3′；qN－R：5′－GCAAACTAAACTCCACAGTGTAA－3′。GAPDH實(shí)時(shí)熒光定量引物：GAPDH－F：5′－CTGCCGCCTGGAGAAACCT－3′；GAPDH－R：5′－GCTGTAGCCAAATTCATTGTCG－3′。引物均由上海立菲生物科技有限公司合成。

1.2.2pIRES2－EGFP－Nsp9真核表達(dá)載體的構(gòu)建以pMD18－T－Nsp9質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50μL：Premix Ex Taq DNA聚合酶25μL，上、下游引物（10pmol／μL）各1μL，cDNA 2μL，去離子水21μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5μg／mL EB）電泳檢測后純化回收。將PCR產(chǎn)物與pIRES2－EGFP空載體分別用XhoⅠ、HindⅢ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物使用T4DNA連接酶連接后構(gòu)建pIRES2－EGFP－Nsp9真核表達(dá)載體。

1.2.3轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞并通過菌液PCR電泳篩選出陽性克隆送往上海立菲生物科技有限公司測序。序列測定為陽性的菌液參照Endo－free Plasmid Mini說明書進(jìn)行去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒的抽提。參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書將構(gòu)建的pIRES2－EGFP－Nsp9真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Marc－145細(xì)胞中。

1.2.4Western blotting 將轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞樣品棄去上清，用PBS清洗細(xì)胞3次，用100μL RIPA裂解液進(jìn)行裂解，之后加入25μL上樣緩沖液，沸水中加熱10min，13 000r／min離心10min，取上清進(jìn)行SDS－PAGE蛋白膠電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠。采用半干轉(zhuǎn)膜方法，15V電壓轉(zhuǎn)移60min，5%脫脂奶粉封閉1h，過夜封閉一抗（Nsp9單克隆抗體），洗膜3次，每次5min，用TBST緩沖液按1∶8 000稀釋的IRDye 800CW Goat Antimouse IgG（H＋L）37℃孵育1h，洗膜3次，每次5min，放入雙色激光分析系統(tǒng)Odyssey（LI－COR公司生產(chǎn)），設(shè)置適當(dāng)?shù)膮?shù)后拍照記錄。

1.2.5Marc－145細(xì)胞的接毒 Marc－145細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h之后，以MOI＝1的劑量接種PRRSV XH－GD毒株，24h后采集樣品。

1.2.6N蛋白mRNA的表達(dá)水平 接毒后24h，將病變細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，4℃、12 000r／min離心10min，取上清液250μL置于DEPC水處理過的1.5mL滅菌離心管中，按照Trizol?Reagent RNA提取試劑的使用說明書提取病毒總RNA。參照M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系20μL：RNA 9.5μL，RNase Inhibitor 0.5μL，5×MLV Buffer 4.0μL，dNTPs 4.0μL，M－MLV 1.0μL，反轉(zhuǎn)錄引物1.0μL。混勻后，置42℃水浴1h，冰浴2min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）直接進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)或－20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組。

以反轉(zhuǎn)錄完的樣品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系20μL：SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10μL，上、下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，DNA模板2μL，ddH2O 6.8μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.7Western blotting驗(yàn)證N蛋白的表達(dá)水平

具體操作步驟參照1.2.4，其中一抗為N蛋白或GAPDH抗體。

1.2.8TCID50的測定 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種Marc－145細(xì)胞，待細(xì)胞生長達(dá)到85%以上時(shí)即可用樣品進(jìn)行接種。每個(gè)樣品做10倍倍比稀釋（即10－1至10－8倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種8孔，100μL／孔）。接毒后，將細(xì)胞板置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5h。孵育完畢后棄去病毒液，補(bǔ)入含2%新生牛血清的DMEM，然后置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀察2～7d，記錄每個(gè)稀釋度樣品發(fā)生細(xì)胞病變的孔數(shù)，重復(fù)3次求其平均值，并按照Reed－Muench法計(jì)算各個(gè)樣品的TCID50。

1.2.9劑量變化對(duì)N蛋白表達(dá)影響 在Marc－145細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同的劑量（500、200、100ng）的質(zhì)粒，接毒后分別參照1.2.6和1.2.7方法在mRNA和蛋白水平上檢測N蛋白的表達(dá)變化。

1.2.10數(shù)據(jù)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用GraphPad軟件進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算方法采用2－ΔΔCt，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1pIRES2－EGFP－Nsp9重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以克隆質(zhì)粒pMD18－T－Nsp9為模板，PCR擴(kuò)增獲得Nsp9基因的目的片段，產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，目的片段在1 900bp左右，與理論值相符，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1　PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 pIRES2－EGFP－Nsp9重組質(zhì)粒的鑒定

對(duì)PCR純化產(chǎn)物及pIRES2－EGFP空載體進(jìn)行XhoⅠ、HindⅢ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑菌進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，重組質(zhì)粒經(jīng)過XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后出現(xiàn)1 900和5 600bp左右的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明載體構(gòu)建成功。

圖2　pIRES2－EGFP－Nsp9重組質(zhì)粒的雙酶切Fig.2 Double enzyme digestion of pIRES2－EGFP－Nsp9

2.3轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證，一抗為Nsp9單抗。由圖3可知，得到100ku的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說明質(zhì)粒在Marc－145細(xì)胞中得到了有效的表達(dá)。

圖3　質(zhì)粒在Marc－145細(xì)胞上的表達(dá)Fig.3 Plasmid expressed in Marc－145cells

2.4N蛋白表達(dá)水平變化

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測N蛋白在mRNA表達(dá)水平上的變化，Western blotting檢測在蛋白水平上的表達(dá)量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，轉(zhuǎn)染Nsp9基因的Marc－145細(xì)胞中病毒N蛋白的表達(dá)量在mRNA和蛋白水平均顯著高于轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞（P＜0.05）。

圖4　N蛋白表達(dá)水平的變化Fig.4 Expression change of N protein

2.5TCID50變化

轉(zhuǎn)染結(jié)束之后接毒，進(jìn)行TCID50測試，結(jié)果見圖5。由圖5可知，轉(zhuǎn)染Nsp9的細(xì)胞中病毒滴度顯著高于轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞（P＜0.05），與mRNA和蛋白水平結(jié)果一致。

圖5　病毒滴度的差異Fig.5 Variance of viral titer

2.6劑量變化對(duì)N蛋白的mRNA表達(dá)水平變化

在Marc－145細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同劑量的質(zhì)粒，接毒之后進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著質(zhì)粒劑量的增加，PRRSV病毒N蛋白的表達(dá)量在mRNA和蛋白水平上也有所增加。

圖6　不同劑量下N蛋白水平的變化Fig.6 Expression change of N protein at different dose

3 討 論

RNA病毒傳播迅速，常給動(dòng)物和人類造成巨大危害。許多RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面已日趨完善。相比之下，就非結(jié)構(gòu)蛋白所做的研究較少，存在許多未知問題。在這些非結(jié)構(gòu)蛋白中，病毒自身編碼的RdRp對(duì)病毒的復(fù)制起關(guān)鍵作用［19］。對(duì)RdRp進(jìn)行研究可以進(jìn)一步闡明RNA病毒復(fù)制機(jī)理，為研制新的抗病毒靶標(biāo)和診斷試劑提供可能。

PRRSV屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科，是一種專嗜在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長、有囊膜、單股正鏈RNA病毒［20］。病毒基因組全長約15kb，包括10個(gè)ORFs，其中ORF1a和ORF1b位于基因組的5′端，占據(jù)整個(gè)基因組的80%，編碼RNA聚合酶和相關(guān)的蛋白酶，為非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1－Nsp12）。ORF2－ORF7位于基因組的3′端，編碼主要和次要的結(jié)構(gòu)蛋白。核苷酸序列分析表明，非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9在不同PRRSV間同源性超過99.0%，具有較高的保守性。Nsp9為病毒復(fù)制酶，與其他動(dòng)脈炎病毒一樣，有1個(gè)核心氨基酸三體SDD和4個(gè)保守性的單股正鏈RNA病毒所共有的基序，突變其中的關(guān)鍵核心氨基酸三體SDD對(duì)病毒均為致死突變［21］。報(bào)道稱，Nsp9不僅與毒力密切相關(guān)［22－23］，還與細(xì)胞免疫、抗藥性存在關(guān)聯(lián)［24－26］。

已經(jīng)有報(bào)道稱針對(duì)Nsp9的siRNA可以抑制病毒的復(fù)制，針對(duì)Nsp9的化合物也可以抑制病毒復(fù)制，從側(cè)面證明了Nsp9對(duì)病毒復(fù)制的影響。本試驗(yàn)在過表達(dá)Nsp9基因后，研究N蛋白在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，研究其是否對(duì)PPRSV復(fù)制起關(guān)鍵作用。結(jié)果顯示，Nsp9基因過表達(dá)后，N蛋白在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均增加，且隨著劑量的不斷增加，N蛋白mRNA表達(dá)量有增加的趨勢，說明Nsp9在體外就可以促進(jìn)病毒復(fù)制，這前人研究結(jié)果一致。NCBI上預(yù)測Nsp9的活性區(qū)域在1 000～1 075nt，本研究克隆的是Nsp9基因全長，包括活性區(qū)域，而是否只表達(dá)活性區(qū)域就可以促進(jìn)病毒的復(fù)制，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

Nsp9在PRRSV發(fā)生、發(fā)展中的具體作用尚不明確，同時(shí)該病毒Nsp9蛋白的提取較為困難，因此，用外源基因插入真核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)成為有效方法之一。本研究前期利用pIRES2－EGFP載體表達(dá)Nsp9基因，通過IFA和Western blotting方法均得到驗(yàn)證，同時(shí)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，與軟件預(yù)測結(jié)果保持一致。

構(gòu)建目的基因真核表達(dá)載體是開展基因治療及進(jìn)行相應(yīng)的基礎(chǔ)理論研究的關(guān)鍵因素。在本研究中所使用的pIRES2－EGFP真核表達(dá)載體，進(jìn)入靶細(xì)胞后以附加體的形式存在，具有安全性好、容量大等特點(diǎn)。pIRES2－EGFP在多克隆位點(diǎn)與EGFP基因區(qū)之間有IRES區(qū)，可以使外源基因和EGFP基因同步表達(dá)，用于基因功能的研究。由于EGFP作為報(bào)告基因具有直觀、及時(shí)、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，因而在基因整合、細(xì)胞分選及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中是其他報(bào)告基因所無法比擬的。另一方面，有報(bào)道指出將真核質(zhì)粒pIRES2－EGFP直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，在注射部位會(huì)有其攜帶基因的表達(dá)。因此，本研究中所構(gòu)建的pIRES2－EGFP－Nsp9可以作為Nsp9蛋白生理功能研究的重要工具。

目前PRRSV呈世界性廣泛分布，在主要養(yǎng)殖國家如美國、英國、中國、荷蘭、德國等都有流行［27－29］。其長時(shí)間持續(xù)感染和抗體依賴性增強(qiáng)效應(yīng)使得豬場的凈化十分困難。而Nsp9對(duì)病毒的復(fù)制有至關(guān)重要的作用，設(shè)計(jì)針對(duì)該聚合酶基因的抑制劑可能是未來防制藍(lán)耳病的一個(gè)方向。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIRES2－EGFP－Nsp9，并將其轉(zhuǎn)染至Marc－145細(xì)胞中，通過Nsp9基因過表達(dá)研究PPSRV N蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，Nsp9基因過表達(dá)使N蛋白表達(dá)量在mRNA和蛋白水平上增加，促進(jìn)了病毒的復(fù)制，證明Nsp9基因參與病毒的復(fù)制，為進(jìn)一步研究該基因的聚合酶活性與作用奠定了基礎(chǔ)。

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中國特色社會(huì)主義道路自信是在探索民族解放和國家發(fā)展之道的過程中形成的。道路自信是對(duì)中國特色社會(huì)主義發(fā)展方向和未來命運(yùn)的自信，也是對(duì)黨領(lǐng)導(dǎo)中國人民走過的革命、建設(shè)和改革道路的自信。不論是“農(nóng)村包圍城市、武裝奪取政權(quán)”的新民主主義革命道路，還是“一個(gè)中心，兩個(gè)基本點(diǎn)”改革開放道路，都具有鮮明的、適合中國國情的中國特色?！白咦约旱穆贰睙o疑是中國共產(chǎn)黨最大的道路自信；帶領(lǐng)中華民族走出一片廣闊天地，進(jìn)一步強(qiáng)化了這種道路自信。中國特色社會(huì)主義道路的開創(chuàng)，對(duì)推進(jìn)世界社會(huì)主義運(yùn)動(dòng)和發(fā)展中國家走向現(xiàn)代化的都具有重大意義。中國共產(chǎn)黨的道路自信，不僅改變了中國，而且影響著世界。

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（責(zé)任編輯 姚倩倩）

中圖分類號(hào)：Q785

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3114－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.005

收稿日期：2016－02－16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金：豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9功能研究（31272564）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201203039）；國家生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS－36）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016YFD0500707）

作者簡介：趙孟孟（1986－），男，河南汝州人，博士，研究方向：豬繁殖與呼吸綜合征病毒的致病機(jī)理，E－mail：zhaomengmeng502＠163.com

通信作者：＊張桂紅（1968－），女，黑龍江哈爾濱人，博士，教授，研究方向：動(dòng)物傳染病，E－mail：guihongzh＠scau.edu.cn

Effect ofNsp9Gene on Replication of PRRSV in Marc－145Cells

ZHAO Meng－meng1，2，F(xiàn)ENG Song－lin2，WANG Wen－jia3，XING Xing4，F(xiàn)ENG Jia－ping2，ZHANG Gui－h(huán)ong2＊
（1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.KeyLaboratoryofZoonosisPreventionandControlofGuangdongProvince，CollegeofVeterinary andNationalEngineeringResearchCenterforBreedingSwineIndustry，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China；3.SchoolofPharmaceuticalEngineering，HenanUniversityof AnimalHusbandryandEconomy，Zhengzhou450046，China；4.GuangxiQinzhouFreeTradePort AreaEntry－exitInspectionandQuarantineBureau，Qinzhou535008，China）

Abstract：In order to evaluate whether Nsp9could enhance the replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），pIRES2－EGFP－Nsp9plasmid containing whole Nsp9 genome were transfected into Marc－145cells，Real－time PCR and Western blotting were used to evaluate the expression of N protein after PRRSV was inoculated.The results showed that the level of N protein in the Nsp9transfected cells was significantly higher than control group（P＜0.05），which was 1.5times higher.Meanwhile，the expression at protein level had the same trend as the mRNA level.When the dose of plasmid was increasing，the expression of N protein both at the mRNA and protein levels were increased.In conclusion，Nsp9gene could enhance the replication of PRRSV in Marc－145cells.

Key words：PRRSV；Nsp9gene；Marc－145cell；replication