梅敏敏，梁國智，黃雯晶，李曉文，黃淑堅

（佛山科學技術(shù)學院生命科學學院，佛山528231）

新型鴨呼腸孤病毒σB蛋白的原核表達及其多克隆抗體制備

梅敏敏，梁國智，黃雯晶，李曉文，黃淑堅＊

（佛山科學技術(shù)學院生命科學學院，佛山528231）

為制備新型鴨呼腸孤病毒（new－type duck reovirus，NDRV）XX株σB蛋白的多克隆抗體，試驗經(jīng)RT－PCR擴增NDRV XX株σB基因編碼序列，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET－32a（＋）－σB，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞后，經(jīng)IPTG誘導獲得His－σB重組蛋白。SDS－PAGE顯示成功表達出約55ku的融合蛋白，主要以包涵體形式存在，其表達時的最佳誘導時間、IPTG誘導濃度分別為3h和0.25mmol／L。經(jīng)Ni2＋柱親和層析純化獲得可溶性重組蛋白，將蛋白經(jīng)Western blotting和蛋白質(zhì)譜鑒定為高純度的σB重組蛋白，將純化后σB重組蛋白按合理免疫程序免疫家兔，獲得多抗隆抗體經(jīng)Western blotting分析顯示出特異性的反應(yīng)。本試驗結(jié)果為NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

新型鴨呼腸孤病毒；σB蛋白；原核表達；多克隆抗體

禽源呼腸孤病毒（avian reovirus，ARV）近年來已呈現(xiàn)出宿主多樣性的特點，自然感染不僅局限于傳統(tǒng)的雞和火雞，已經(jīng)引起各種水禽不同程度的發(fā)病死亡，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟損失［1］。番鴨呼腸孤病毒（muscovy duck reovirus，MDRV）能夠引起番鴨產(chǎn)生番鴨呼腸孤病毒?。ㄋ追Q“肝白點病”、“花肝病”等），死亡率為10%～50%。迄今為止，MDRV感染在南非、法國、以色列、意大利、德國和中國都有報道［2－4］，其臨床癥狀主要為軟腳，病理變化主要為肝臟、脾臟表面有多量白色壞死點，無肝臟出血病變［5－8］。自2005年冬季以來，福建、浙江等省雛番鴨、雛半番鴨、麻鴨群中發(fā)生一種新的重大疫病，俗稱“鴨新肝病”、“鴨壞死性肝炎”，發(fā)病率5%～32.5%，病死率差異較大，為4%～20%，但鴨日齡愈小，發(fā)病率、病死率愈高。最近研究表明，該病原體是一種新型鴨呼腸孤病毒（new－type duck reovirus，NDRV），該病引起的主要病變?yōu)楦闻K不同程度點／斑塊狀出血和壞死、脾臟腫大壞死、心臟和法氏囊出血等，然而病鴨不軟腳［7－8］。

NDRV屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬。在負染電鏡下，病毒粒子呈球形、正二十面體立體對稱、無囊膜、雙層衣殼的dsRNA病毒［9］。與其他正呼腸孤病毒一樣，NDRV病毒基因組的SDS－PAGE電泳圖顯示有10個RNA片段［9－10］。σB蛋白由S3基因編碼（MDRV－89026和MDRV－89330由S2基因編碼），為外衣殼的主要組分［10］。σB蛋白與鴨呼腸孤病毒（duck reovirus，DRV）的感染、致病性和免疫保護等方面相關(guān)，其攜帶群特異性中和抗原決定簇，能誘導細胞融合并產(chǎn)生群特異性中和抗體［1112］。σB可通過σC作用來提高感染細胞的能力，并在病毒的致病性上起著一定的作用［13］。

本研究擬對NDRV XX株的σB蛋白基因進行克隆，利用pET－32a（＋）原核表達系統(tǒng)表達σB蛋白，并制備特異性的兔抗σB蛋白多克隆抗體，為研制σB蛋白相關(guān)疫苗提供依據(jù)，也為進一步研究σB蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、載體及試驗動物

NDRV XX株于2011年采自于廣東新興某鴨場患鴨，由佛山科學技術(shù)學院預(yù)防獸醫(yī)學實驗室分離保存。大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞、原核表達載體pET－32a（＋）均由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院獸醫(yī)微生物學研究室保存。5月齡健康雌性新西蘭大白兔購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 主要試劑

Trizol Reagent、pMD18－T載體連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SacⅠ、T4DNA連接酶、IPTG均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司；一站式His標記蛋白純化套裝購自北京天恩澤基因科技有限公司；抗His標簽鼠單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG均購自北京康為公司；底物DAB、低分子質(zhì)量蛋白標準均購自上海碧云天生物有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

利用GenBank上已有的DRVσB蛋白基因序列（登錄號：GQ888710）設(shè)計1對擴增σB蛋白基因完整編碼區(qū)的特異性引物，引物序列為：S3F：5′－CGGGGTACCATGGAGGTGCGTGTGCCAAACTT－3′（下劃線為KpnⅠ酶切位點）；S3R：5′－CGAGCTCTTACCACCTACACTCCAGGAAGGAC－3′（下劃線為SacⅠ酶切位點），預(yù)期擴增的片段大小為1 104bp。引物由上海英駿生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴增與表達載體的構(gòu)建

用保存的病毒尿囊液采取傳統(tǒng)法抽提總RNA，具體操作參見Trizol Reagent說明書。反轉(zhuǎn)錄按照Trizol Reverse Transcriptase M－MLV說明書進行。RT－PCR擴增σB完整編碼區(qū)片段，PCR反應(yīng)體系25μL：Primix ExTaqTM酶12.5μL，上、下游引物（10μmol／L）各1.0μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表達載體pET－32a（＋）經(jīng)KpnⅠ和SacⅠ雙酶切的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收的酶切產(chǎn)物與σB基因片段，按照T4DNA連接酶使用說明書，16℃連接過夜，連接體系為：pET－32a（＋）1.0μL，Ligase Buffer 2.0μL，目的基因片段5.0μL，T4DNA連接酶1.0μL。取5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取白色單克隆菌落接種于含氨芐青霉素（Amp＋）的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r／min培養(yǎng)6h。取菌液進行PCR鑒定后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至上海英駿生物技術(shù)有限公司（廣州）測序。

1.5 重組蛋白的誘導表達

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑陽性單菌落擴大培養(yǎng)。將過夜菌液按1∶100接種新鮮LB培養(yǎng)基（Amp＋），37℃、220r／min振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6左右。取1.0mL菌液作未誘導的對照組，其余加終濃度為1.0mmol／L IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h后取1mL菌液以12 000r／min離心30s，收獲菌體。用無菌去離子水將菌體吹散混勻，通過SDSPAGE電泳檢測外源蛋白的表達情況。

1.6 重組蛋白的SDS－PAGE檢測

分別取上述方法獲得的樣品10μL進行檢測。分離膠濃度為12%，積層膠濃度為5%。將樣品加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3～5min，12 000r／min離心1min，取上清作SDS－PAGE分析。電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍染色，4～6h后脫色攝像，凝膠可保存于雙蒸水或7%乙酸溶液中。

1.7 誘導表達條件的優(yōu)化

誘導時間的優(yōu)化：按照上述誘導表達的步驟進行，分別加IPTG至終濃度為1.0mmol／L，然后37℃誘導培養(yǎng)0、1、2、3、4、5和6h，收集菌體，樣品處理后經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測蛋白表達情況。

IPTG誘導濃度的優(yōu)化：按上述誘導表達的步驟在最佳時間誘導，分別加IPTG至終濃度為0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mmol／L，然后37℃誘導培養(yǎng)3h，收集菌體，樣品處理后經(jīng)SDSPAGE電泳檢測蛋白表達情況。

1.8 表達產(chǎn)物的鑒定

1.8.1 重組蛋白的Western bloting鑒定 將誘導表達的菌液處理經(jīng)SDS－PAGE電泳后進行轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜后，轉(zhuǎn)入含5%脫脂乳的TBST，4℃封閉過夜。棄封閉液，TBST洗膜后，轉(zhuǎn)入1∶1 000稀釋的抗His標簽鼠單克隆抗體，室溫平穩(wěn)搖動2h。棄一抗，TBST洗膜后，再轉(zhuǎn)入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG，室溫平穩(wěn)搖動1h，TBST洗膜后，加入DAB顯色液，避光至出現(xiàn)條帶即放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

1.8.2 蛋白質(zhì)譜鑒定 將誘導表達的菌液處理進行SDS－PAGE電泳，考馬斯亮藍染色與脫色后，切下目的條帶送往蘇州普泰生物技術(shù)有限公司進行Nano－LC－ESI－MS／MS蛋白質(zhì)分析鑒定。

1.9 重組蛋白的可溶性分析和純化

按最佳誘導條件大量誘導表達后，離心收集菌體，4℃、12 000r／min離心10min，PBS洗滌后，用原液10%體積的PBS重懸菌體于冰浴中進行超聲波裂解，至菌液變清亮，4℃、12 000r／min離心20min，分別收集產(chǎn)物上清及沉淀進行SDSPAGE，對蛋白的可溶性進行分析。同時，收集最佳誘導條件的菌體，采用His標記蛋白純化套裝純化重組蛋白。取上述純化的融合蛋白置Millipore超濾管中濃縮，4 000r／min離心10min，20倍體積濃縮，使蛋白終濃度達到1mg／mL。

1.10 多克隆抗體的制備及鑒定

先后4次皮下多點注射免疫新西蘭大白兔，免疫用量為500μL／只，首免取已純化的蛋白加等量的完全弗氏佐劑，超聲破碎儀乳化后免疫。14d后二免，純化的蛋白與不完全弗氏佐劑等量乳化后免疫，以后每間隔7d加強免疫，均使用弗氏不完全佐劑，最后一次免疫后的14d，耳靜脈采血收集血清。Western blotting檢測血清抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 σB基因的擴增與重組表達質(zhì)粒pET－32a（＋）－σB的鑒定

PCR擴增得到NDRV XX株的σB基因，其大小約為1 104bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SacⅠ進行雙酶切，可見大小約為5 800和1 104bp的片段，與預(yù)期目的條帶大小相符（圖2）。測序結(jié)果與GenBank中公布的σB蛋白基因序列同源性達98.1%，進一步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 目的片段PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of target fragment

圖2 重組表達質(zhì)粒酶切產(chǎn)物Fig.2 Enzyme digestion products of the recombinant plasmid

2.2 表達產(chǎn)物的SDS－PAGE鑒定

2.2.1 重組蛋白的SDS－PAGE檢測 重組表達質(zhì)粒在宿主菌中誘導表達后，表達產(chǎn)物進行SDS－PAGE，結(jié)果可知表達產(chǎn)物在約55ku處出現(xiàn)一條目的條帶，未誘導的重組質(zhì)粒的表達產(chǎn)物在此處無條帶出現(xiàn)（圖3）。

圖3 重組表達質(zhì)粒的表達產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.3 SDS－PAGE analysis products of the recombinant plasmid

2.2.2 誘導表達條件的優(yōu)化 依單一變量原則分別對IPTG最佳誘導時間、誘導濃度進行優(yōu)化。3h后蛋白表達量不再明顯增加，確定最佳誘導時間為3h（圖4）。不同濃度的IPTG表達量無明顯差異（圖5），考慮到經(jīng)濟和IPTG的細胞毒性，采用低濃度的IPTG（0.25mmol／L）即可。

圖4 不同誘導時間下表達產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis products with different induction times

圖5 不同IPTG誘導濃度下表達產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.5 SDS－PAGE analysis products with different inducer IPTG concentrations

2.3 蛋白質(zhì)譜鑒定

表達產(chǎn)物SDS－PAGE電泳后，將目的蛋白條帶切下進行蛋白質(zhì)譜鑒定，經(jīng)分析其對應(yīng)于GenBank中公布的DRVσB蛋白氨基酸序列（圖6），表明表達的蛋白為σB蛋白。

圖6 σB蛋白質(zhì)譜鑒定Fig.6 Protein mass spectrometry analysis of sigma B protein

2.4 重組蛋白的可溶性分析和純化

在IPTG誘導濃度為0.25mmol／L，誘導時間為3h的條件下誘導表達菌液，分別收集超聲破碎菌體的沉淀和上清進行SDS－PAGE電泳分析，結(jié)果可見表達的蛋白主要以不溶性包涵體形式存在，經(jīng)蛋白純化試劑盒純化，獲得了可溶性的重組蛋白（圖7）。

2.5 重組蛋白σB和多克隆抗體的Western blotting鑒定

SDS－PAGE完畢后，將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)過Western blotting鑒定顯示，重組蛋白σB可被抗His的單抗特異性識別，且分子質(zhì)量符合預(yù)期大?。▓D8）。將制備的多克隆抗體經(jīng)過Western blotting鑒定顯示，多克隆抗體與重組蛋白σB有效結(jié)合，特異性較好（圖9）。

圖7 重組蛋白的可溶性分析及純化Fig.7 Purification and soluble analysis of the recombinant protein

圖8 重組蛋白Western blotting分析Fig.8 Western blotting analysis of the recombinant protein

圖9 抗血清特異性檢測Fig.9 Specificity detection of antiserum

3 討 論

NDRV是近年來危害水禽健康的重要病原，流行趨勢漸強。NDRV感染宿主后能損傷免疫器官，導致免疫抑制，往往繼發(fā)其他病原的感染，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，該病的宿主范圍和致病性均強于DRV和MDRV。NDRVS3基因編碼σB蛋白，σB蛋白為病毒外衣殼的重要組成部分，是重要的結(jié)構(gòu)蛋白。目前，已經(jīng)有許多學者對ARV和MDRV具有免疫原性的蛋白結(jié)構(gòu)功能做了大量研究，王全溪［14］建立了檢測DRV抗體的間接ELISA方法；孫陳莉［15］對σB蛋白進行了原核表達，并建立了間接ELISA方法；Yin等［16］制備了ARV的σB和σC蛋白的單克隆抗體，并對抗σB單克隆抗體鑒定了兩個最小抗原線性表位；陳海鵬［17］、畢莊莉等［18］分別針對N－MDRV和NDRVσC重組蛋白構(gòu)建了間接ELISA檢測法；朱二鵬等［19］對MDRV的σNS蛋白進行原核表達并制備了多克隆抗體；但缺乏NDRVσB蛋白結(jié)構(gòu)功能報道，如NDRVσB蛋白具體結(jié)構(gòu)與功能是否與ARV和MDRV相似，是否也能誘導細胞產(chǎn)生型特異性中和抗體等。因此，NDRVσB蛋白結(jié)構(gòu)與功能，尤其是免疫學上的功能值得深入研究。

大腸桿菌為常用的外源蛋白表達宿主，具有遺傳背景清楚、載體受體系統(tǒng)完備、生長迅速、培養(yǎng)簡單等優(yōu)勢，但也存在重組蛋白可溶性差、表達量低等不足。然而對特定蛋白的功能結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)分析，需獲得大量目的蛋白。由于來源成分復(fù)雜、理化性質(zhì)不同及結(jié)構(gòu)功能的多樣性，表達蛋白的產(chǎn)量低及其純化難一直是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中遇到的瓶頸問題，使得后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析和功能驗證受到嚴重限制［20］。近年來，人們發(fā)現(xiàn)親和標簽與目標蛋白融合表達，可大大提高重組蛋白的產(chǎn)量，增強重組蛋白的可溶性，促進重組蛋白的正確折疊，而常用的親和標簽有His、GST、MBP、GBP等。

本試驗將NDRV XX株的σB蛋白在含His標簽的pET32a（＋）表達載體中表達并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）細胞，在構(gòu)建原核表達載體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了有效的蛋白原核表達系統(tǒng)，對表達的重組σB蛋白再進行純化、鑒定和多克隆抗體的制備。經(jīng)IPTG的誘導表達高產(chǎn)量的目的蛋白，為后續(xù)的純化提供有力的條件。而重組蛋白主要以包涵體形式存在，純化方便。通過改變誘導劑IPTG的濃度對蛋白的表達產(chǎn)量影響甚微，這可能與σB基因中存在稀有密碼子有關(guān)。將包涵體變性裂解后純化蛋白，蛋白免疫印跡試驗證明該蛋白具良好免疫原性，可用作診斷抗原或候選蛋白，純化蛋白經(jīng)免疫新西蘭大白兔制備的抗σB蛋白的多克隆抗體特異性較好，為今后蛋白功能的深入研究及相關(guān)基因工程疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗成功表達出約55ku的NDRVσB融合蛋白，主要以包涵體形式存在，其表達時的最佳誘導時間為3h，IPTG誘導濃度為0.25mmol／L。Ni2＋柱親和層析純化后獲得高純度的σB重組蛋白。

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（責任編輯 晉大鵬）

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation ofσB Protein of New－type Duck Reovirus

MEI Min－min，LIANG Guo－zhi，HUANG Wen－jing，LI Xiao－wen，HUANG Shu－jian＊
（CollegeofLifeScience，F(xiàn)oshanUniversity，F(xiàn)oshan528231，China）

To prepare polyclonal antibodies againstσB protein of new－type duck reovirus（NDRV）XX strain，the encoding sequence ofσBgene of NDRV XX strain was amplified by RT－PCR and successfully inserted to expression plasmid pET－32a（＋），and transformed inEscherichiacoliBL21（DE3）.The His－σB recombinant protein was achieved with IPTG induction.SDS－PAGE result showed that the molecular weight of the expression on fusion protein was about 55ku，was major insoluble fractions.IPTG induced time and concentration were 3hand 0.25mmol／L，respectively.The solubleσB recombinant protein was highly purified which was purified using Ni2＋affinity chromatography and verified by Western blotting and protein mass spectrometry.Then the polyclonal antibodies could be obtained from the rabbits which had immunized by the purifiedσB recombinant protein with the reasonable procedure.The Western blotting result showed that they had the specific reaction.The results built a foundation of the further study of the NDRVσB protein function and the research of genetic engineering vaccine.

new－type duck reovirus；σB protein；prokaryotic expression；polyclonal antibody

S852.65＋9.4

A

1671－7236（2016）12－3149－07

10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.010

2016－05－23

廣東省家禽重大傳染病控制技術(shù)研究（2012A020100001）

梅敏敏（1993－），女，湖南郴州人，碩士，研究方向：禽傳染病學，E－mail：15899840301＠163.com

＊通信作者：黃淑堅（1966－），男，廣東梅州人，博士，教授，研究方向：畜禽傳染病學，E－mail：sjhuang.foshan＠163.com