閆寶琪，董書偉，王東升，那立冬，2，桑夢(mèng)琪，楊洪早，2，張世棟＊，嚴(yán)作廷＊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州，730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州，730070）

黃藤素對(duì)山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的體外毒性研究

閆寶琪1，董書偉1，王東升1，那立冬1，2，桑夢(mèng)琪1，楊洪早1，2，張世棟1＊，嚴(yán)作廷1＊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州，730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州，730070）

摘 要：為了探究黃藤素的體外細(xì)胞毒性，采用不同濃度的黃藤素作用山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EECs）后，采用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；瑞氏—姬姆薩染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并通過測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）含量檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性。結(jié)果顯示，當(dāng)黃藤素的濃度為10～227μg／mL時(shí)，黃藤素對(duì)EECs有促增殖的作用；當(dāng)濃度大于227μg／mL時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象，藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)增殖抑制率（IC50）為360μg／mL；瑞氏—姬姆薩染色結(jié)果顯示，100、200μg／mL的黃藤素作用于EECs時(shí)均未對(duì)其細(xì)胞核、細(xì)胞漿的形態(tài)產(chǎn)生影響；LDH結(jié)果顯示，藥物濃度≥250μg／mL時(shí)細(xì)胞LDH的釋放量極顯著高于正常細(xì)胞組（P＜0.01）。綜上所述，黃藤素作用于山羊EECs后呈現(xiàn)一定的毒性作用，且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴效應(yīng)，作用于EECs的安全劑量范圍為≤250μg／mL。

關(guān)鍵詞：黃藤素；子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；細(xì)胞毒性；膜通透性

黃藤素（palmatine）又名掌葉防己堿、巴馬汀、棕櫚堿、非洲防己堿等，是從防己科植物黃藤的干燥藤莖中提取精制而得［1］。黃藤素的藥理和生物活性十分廣泛，主要被用來治療胃腸道細(xì)菌感染引起的菌痢，還被廣泛應(yīng)用到治療呼吸道感染、外科感染和婦科炎癥等方面［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃藤素具有抑制多種革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的效果，尤其對(duì)真菌敏感，還具有抗病毒、提高白細(xì)胞吞噬功能、提高機(jī)體免疫力及抗心率失常等作用［3］。子宮內(nèi)膜炎（endometritis）是雌性哺乳動(dòng)物的常見病之一，多發(fā)生于產(chǎn)后，是病原菌感染子宮內(nèi)膜引起的炎癥，常導(dǎo)致動(dòng)物的繁殖障礙綜合征，嚴(yán)重影響動(dòng)物養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益［4－5］。黃藤素有較好的抑菌抗炎效果，具有抗多種病原微生物的藥理活性，對(duì)動(dòng)物疾病治療有較好的應(yīng)用前景［6－7］。然而，應(yīng)用黃藤素治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的子宮內(nèi)膜炎還鮮有報(bào)道［8］。本試驗(yàn)采用山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EECs）作為試驗(yàn)材料，研究黃藤素的體外細(xì)胞毒性，為臨床應(yīng)用黃藤素治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物子宮內(nèi)膜炎的研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系（EECs）由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院靳亞平教授惠贈(zèng)。

1.1.2藥品及試劑 黃藤素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%），用細(xì)胞培養(yǎng)液將其稀釋到所需要的濃度；DMEM／F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司；0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）及MTT均購(gòu)自Sigma公司；瑞氏—姬姆薩染料購(gòu)自Solarbio公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.3主要儀器 Memmert CO2培養(yǎng)箱；HeaL ForceB2型生物安全柜；SW－CJ－1CU型超凈工作臺(tái)；倒置顯微鏡（Leica DMI6000B）；MDC M2e型多功能酶標(biāo)儀。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將永生化EECs從液氮中取出，37℃快速?gòu)?fù)蘇，低速離心后添加含10%FBS、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的DMEM／F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞分組與處理

取100μL濃度為5×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，24h后棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度黃藤素的完全培養(yǎng)液100μL，黃藤素的終濃度分別為：0、20、40、60、80、100、120、150、180、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650μg／mL，每個(gè)濃度設(shè)置8個(gè)復(fù)孔。

1.4MTT法檢測(cè)黃藤素對(duì)EECs的增殖作用

繼續(xù)培養(yǎng)48h后，觀察細(xì)胞增殖情況。棄去舊培養(yǎng)基，加入5mg／mL的MTT 20μL，孵育4h。棄去多余的MTT，每孔加入200μL二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，檢測(cè)各孔D570nm值，計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)增殖抑制率（IC50）［9－11］。IC50＝（A2－A0）／（A1－A0）×100%，式中，A0，藥物處理前D570nm值；A1，對(duì)照組D570nm值；A2：藥物處理48h后D570nm值。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞相對(duì)存活率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

1.5瑞氏—姬姆薩染色法觀察黃藤素對(duì)EECs形態(tài)的影響

取1mL濃度為5×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液接種于12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后棄去舊培養(yǎng)基，加入含黃藤素終濃度為0、100、200μg／mL的完全培養(yǎng)液1mL，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞（1 200r／min離心5min），加入500μL的無菌PBS重懸細(xì)胞，涂片，晾干，放入預(yù)冷的甲醇溶液中固定15～30min。接著滴加2～3瑞氏染液，染色2～3min后滴加等量的姬姆薩染液，染色10min。每張涂片計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)［12－14］。

1.6EECs細(xì)胞膜完整性的檢測(cè)

取0.5mL濃度約為5×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，棄去舊培養(yǎng)基。分別加入含黃藤素終濃度為20、60、100、150、200、250、300、350μg／mL的完全培養(yǎng)液0.5mL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞上清液，6 600r／min離心10min，嚴(yán)格按照LDH檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組上清液中LDH的含量。

1.7數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SAS 9.30軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Excel繪圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1黃藤素對(duì)EECs的增殖影響

由圖1可知，當(dāng)黃藤素的濃度處在10～227μg／mL時(shí)，對(duì)EECs有促增殖的作用。當(dāng)黃藤素濃度在10～100μg／mL時(shí)，隨著藥物濃度的增加促增殖作用越明顯，濃度達(dá)到100μg／mL時(shí)促增殖作用最大，且黃藤素濃度與細(xì)胞增殖率之間呈線性關(guān)系（y＝0.0056x＋1.3492，R2＝0.9729）；當(dāng)黃藤素濃度在100～227μg／mL時(shí)，隨著藥物濃度的增加促增殖作用減弱，且黃藤素濃度與細(xì)胞增殖率之間也呈線性關(guān)系（y＝－0.007x＋2.5916，R2＝0.9959）；由圖2可知，當(dāng)濃度大于227μg／mL時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象，且黃藤素的濃度與細(xì)胞增殖抑制率之間呈線性關(guān)系（y＝－0.0017x＋1.113，R2＝0.9688）；由此可計(jì)算，當(dāng)細(xì)胞的增殖抑制率為50%時(shí)（IC50）黃藤素的作用濃度為360μg／mL。

圖1　0～227μg／mL黃藤素對(duì)EECs的促增殖作用Fig.1 Proliferation effect of palmatine on EECs at 0to 227μg／mL assayed by MTT

圖2　227～600μg／mL黃藤素對(duì)EECs的增值抑制作用Fig.2 Proliferation inhibitory effect of palmatine on EECs at 227to 600μg／mL assayed by MTT

2.2黃藤素對(duì)EECs的細(xì)胞形態(tài)影響

正常的山羊EECs多數(shù)為梭形，少數(shù)呈三角形，核圓居中，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞交織成網(wǎng)狀。細(xì)胞貼壁良好，體積較大，折光性好，形態(tài)大小均勻一致（圖3A）；經(jīng)100μg／mL黃藤素處理48h后，EECs的密度明顯增大，且倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖3B）；當(dāng)黃藤素濃度達(dá)到200μg／mL時(shí)，作用相同時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的增殖密度低于100μg／mL黃藤素處理組，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞間存在少許細(xì)胞碎片，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有明顯變化（圖3C）。

圖3　不同濃度黃藤素作用48h后對(duì)EECs生長(zhǎng)狀態(tài)的影響（大圖100×；小圖400×）Fig.3 The growth state of EECs treated with palmatine for 48h（big figure，100×；small figure，400×）

2.3黃藤素對(duì)EECs細(xì)胞核形態(tài)的影響

染色結(jié)果顯示正常組和經(jīng)100、200μg／mL的黃藤素作用48h的細(xì)胞胞質(zhì)和胞核界限清晰，胞核完整，胞漿均勻，細(xì)胞邊緣完整，視野內(nèi)未出現(xiàn)死亡細(xì)胞及形態(tài)異常的細(xì)胞（圖4）。

圖4　不同濃度黃藤素作用48h后對(duì)EECs形態(tài)的影響（大圖100×；小圖400×）Fig.4 Morphology of EECs treated with palmatine for 48h（big figure，100×；small figure，400×）

2.4黃藤素對(duì)EECs細(xì)胞膜完整性的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，當(dāng)黃藤素的濃度大于250μg／mL時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量極顯著升高（P＜0.01）；100μg／mL的黃藤素作用EECs后培養(yǎng)液中LDH的含量極顯著低于正常細(xì)胞組（P＜0.01）；20、60、150、200μg／mL的黃藤素作用細(xì)胞后與正常細(xì)胞組相比LDH含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖5　不同濃度的黃藤素對(duì)EECs中LDH釋放量的影響Fig.5 Effect of different concentration of palmatine on LDH release from EECs

3 討 論

蘭世平等［15］研究表明，黃藤素可能通過抑制NF－κB的活化下調(diào)支氣管哮喘急性發(fā)作期患者的炎癥水平。李馨雅［16］通過臨床試驗(yàn)研究證實(shí)，與單純西藥治療相比，黃藤素對(duì)治療人慢性子宮內(nèi)膜炎有明顯作用。研究表明，黃藤素在臨床上主要用于婦科盆腔炎、霉毒性陰道炎、宮頸糜爛與泌尿道感染等疾病的治療［17－18］。廣大科研人員在黃藤素提取工藝、人工合成技術(shù)、定量檢測(cè)技術(shù)、藥理作用等領(lǐng)域開展了深入研究，也取得了大量的研究成果。但黃藤素臨床應(yīng)用相對(duì)滯后，特別是在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用鮮有報(bào)道［19］。研究黃藤素對(duì)細(xì)胞的毒性作用是闡明其臨床用藥安全性的前提條件。且研究表明，通過陰道給藥治療婦科炎癥具有可避免口服給藥的首關(guān)效應(yīng)和血藥濃度的谷峰現(xiàn)象，避免藥物對(duì)于胃腸道的刺激、注射給藥的疼痛與心理恐懼，通過“子宮首關(guān)效應(yīng)”能夠?qū)⑺幬锇邢騻鬟f到子宮內(nèi)膜組織［20］，因此，生物利用度高、藥效顯著［21］。本試驗(yàn)開展黃藤素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外的毒性研究，旨在為黃藤素治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物子宮內(nèi)膜炎的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。甲臜被溶解后所測(cè)得的光密度值越小，說明細(xì)胞存活率越低［22－23］。本研究中MTT的結(jié)果表明，黃藤素對(duì)EECs增殖的促進(jìn)或抑制作用與其濃度成一定的關(guān)系，在低于360μg／mL的劑量范圍內(nèi)對(duì)EECs無顯著毒性作用。LDH是活細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)廣泛存在的酶，正常情況下LDH不能透過細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞膜受損或細(xì)胞死亡導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變時(shí)，則會(huì)釋放到培養(yǎng)液中，釋放的LDH與細(xì)胞膜的損傷程度或細(xì)胞死亡數(shù)成正比［24］。檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH含量可判斷細(xì)胞膜的受損程度。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)黃藤素濃度大于250μg／mL時(shí)細(xì)胞釋放的LDH含量極顯著升高，說明該劑量的黃藤素可引起細(xì)胞膜通透性顯著增大，這可能與藥物被細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收相關(guān)聯(lián)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究；250～360μg／mL的黃藤素雖然沒有顯著的細(xì)胞毒性，但對(duì)細(xì)胞活力和膜通透性有顯著影響。此外，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和瑞氏—姬姆薩染色結(jié)果顯示，200μg／mL的黃藤素對(duì)細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)無明顯影響，表明黃藤素的劑量在250μg／mL以內(nèi)時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞膜通透性和形態(tài)結(jié)構(gòu)均無顯著影響。

4 結(jié) 論

黃藤素對(duì)山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的安全劑量為≤250μg／mL，該劑量范圍內(nèi)藥物對(duì)細(xì)胞活力和形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響；大于該劑量的黃藤素可顯著增大子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的膜通透性，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。本試驗(yàn)結(jié)果可為黃藤素治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的子宮內(nèi)膜炎臨床應(yīng)用提供一定參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 姚倩倩）

中圖分類號(hào)：R282.71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3239－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.023

收稿日期：2016－05－31

基金項(xiàng)目："十二五"國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)課題（2012BAD12B03）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS－ASTIP－2014－LIHPS－03）；甘肅省自然科學(xué)基金（1506RJYA146）

作者簡(jiǎn)介：閆寶琪（1991－），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士，研究方向：奶牛疾病，E－mail：m15624955865＠163.com

通信作者：＊張世棟（1983－），男，甘肅張掖人，博士，助理研究員，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)與藥理學(xué)，E－mail：zhangshidong＠caas.cn嚴(yán)作廷（1962－），男，甘肅武威人，副研究員，研究方向：獸醫(yī)診斷與藥物研發(fā)，E－mail：yanzuoting＠caas.cn

The Study on the Cytotoxicity of Palmatine on Goat Endometrial Epithelial Cellsinvitro

YAN Bao－qi1，DONG Shu－wei1，WANG Dong－sheng1，NA Li－dong1，2，SANG Meng－qi1，YANG Hong－zao1，2，ZHANG Shi－dong1＊，YAN Zuo－ting1＊
（1.Engineering＆TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince，LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalSciences，ChineseAcademyof AgriculturalSciences，Lanzhou730050，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China）

Abstract：To explore the cytotoxicity of palmatineinvitro，goat endometrial epithelial cells（EECs）were stimulated by different concentrations of palmatine，then the growth curve of cell was drew by MTT assay which could detect the cell proliferation.The cell growth state was observed by inverted microscope，and Wright－Giemsa staining was used to observe morphological changes of the cells while LDH test was used to check the membrane permeability of EECs.The results showed that when the concentration was 10to 227μg／mL，palmatine had a role in promoting proliferation of the EECs，while when the concentration was more than 227μg／mL，cell proliferation was inhibited，and 50%inhibitory rate of proliferation（IC50）of this drug on EECs was 360μg／mL.Wright－Giemsa staining results showed that themorphology of the nucleus and cytolymph were not significantly changed when 100and 200μg／mL palmatine effected EECs.LDH results showed that when the palmatine concentration was more than 250μg／mL，LDH content was extremely significantly higher than that of normal cell group（P＜0.01）.In conclusion，palma－tine presented certain toxic effect on EECs with a significant dose－response effect，and the safe dose range of palmatine was less than 250μg／mL.

Key words：palmatine；endometrial epithelial cells；cytotoxicity；membrane permeability