孔祥權(quán), 嚴(yán)　剛, 鄺　淼, 容建華

(暨南大學(xué)材料科學(xué)與工程系, 廣州 510632)

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還原氧化石墨烯-硫化銅納米復(fù)合材料的制備及在癌癥熱療中的應(yīng)用

孔祥權(quán), 嚴(yán)剛, 鄺淼, 容建華

(暨南大學(xué)材料科學(xué)與工程系, 廣州 510632)

摘要通過一步水熱法制備了一種具有光熱性能的納米復(fù)合材料——還原氧化石墨烯-硫化銅(rGO-CuS), 利用傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜、紫外-可見光譜及高分辨透射電子顯微鏡對所合成納米復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行了表征, 并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察其癌癥熱療效果. 結(jié)果表明, 與未復(fù)合的氧化石墨烯(GO)和硫化銅相比, rGO-CuS在近紅外光區(qū)域具有更高效的光熱轉(zhuǎn)換效率; rGO-CuS的光熱治療效果明顯好于GO和CuS.

關(guān)鍵詞氧化石墨烯; 硫化銅; 納米復(fù)合材料; 光熱治療; 癌細(xì)胞

傳統(tǒng)的癌癥治療手段主要包括手術(shù)治療、化學(xué)治療(簡稱化療)和放射治療(簡稱放療). 手術(shù)治療只能針對早期癌細(xì)胞尚未轉(zhuǎn)移的患者; 化療對于癌細(xì)胞和正常細(xì)胞缺乏選擇性殺滅作用; 放療只能針對未分化的腫瘤, 且輻射具有較大毒副作用. 由于手術(shù)治療通常無法根治已有腫瘤轉(zhuǎn)移的晚期病人, 放療和化療對病人的二次傷害又很大[1], 因此, 特異性地殺死腫瘤細(xì)胞而不損傷正常的人體細(xì)胞是目前腫瘤治療的難點(diǎn). 光熱治療(PTT)作為較安全的新型腫瘤治療方法受到了廣泛關(guān)注[2,3]. PTT是指利用納米材料的光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng), 在近紅外激光作用下局部加熱腫瘤部位, 從而殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法. PTT需要具備近紅外光和光熱材料兩大條件. 近紅外光被稱為人體的光學(xué)窗口, 組織穿透性強(qiáng), 能穿透深層組織, 到達(dá)生物體很多部位, 從而可以充分發(fā)揮治療作用; 由于它具有較低的組織吸收率, 所以對正常組織只有較低的殺傷性, 因此近紅外光是腫瘤光熱治療最理想的光源. 光熱材料對近紅外光有高強(qiáng)吸收, 并能將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱量釋放出來.

能夠用于光熱治療的納米材料主要有碳納米材料[氧化石墨烯(GO)[4,5]、還原氧化石墨烯(rGO)[6]、碳納米管[7,8]]、貴金屬納米顆粒(金納米棒[ 9～11 ]、金納米殼[12,13]、金納米籠[14,15]等)、半導(dǎo)體納米顆粒(硫化銅[3,16]、硒化銅[17]等)以及聚合物納米顆粒[18]等. 2011年, Tian等[3]發(fā)現(xiàn)硫化銅能夠在 808 nm 激光的照射下殺死癌細(xì)胞. 這種新型的腫瘤熱療材料具有廉價(jià)、生物相容性好的特點(diǎn). 但是由于硫化銅的光熱轉(zhuǎn)化效率較低, 需要使用高功率的激光(24 W/cm2)才能有效地升溫并殺死細(xì)胞, 這樣高功率的激光對皮膚和正常細(xì)胞都會(huì)造成較大傷害. 因此, 提高硫化銅體系的光熱轉(zhuǎn)化效率成為該研究領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn).

本文利用一步水熱法制備了兼具良好生物相容性和良好光熱轉(zhuǎn)換特性的納米復(fù)合材料——還氧化石墨烯-硫化銅(rGO-CuS), 考察了材料在功率密度為1 W/cm2、波長為980 nm的近紅外激光照射下的升溫速率和癌癥熱療效果.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

天然石墨粉(325目), 上海碳素廠; 鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%)、硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、高錳酸鉀(純度99%)、亞硝酸鈉(純度99%)、過氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)和氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%), 廣州化學(xué)試劑公司; 聚乙烯吡咯烷酮(PVP, 分析純,Mw=30000)、硫化鈉(純度98%)、氯化銅(純度98%)和中性紅, 阿拉丁試劑有限公司; 其它試劑均為分析純. 實(shí)驗(yàn)用水為去離子純水.

Cary5000型紫外-可見光譜儀(UV-Vis, 美國Varian公司); JEM-2100型透射電子顯微鏡(HRTEM, 日本JEOL公司); RM2000型顯微共焦拉曼光譜儀(英國Renishaw公司); Spectrum One 傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR, 美國 Perkin-Elmer公司); 功率可調(diào) 980 nm 激光器(中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所); HT-830 型非接觸式紅外線測溫儀(廣州市宏誠集業(yè)電子科技有限公司); CK X41型熒光顯微鏡(日本Olympus公司).

1.2硫化銅納米片的制備

硫化銅納米片參考文獻(xiàn)[3]方法制備. 具體步驟如下: 向10 mL去離子水中加入2 g PVP, 攪拌均勻后, 加入一定量的氯化銅(0.5 mmol/L), 繼續(xù)攪拌. 將10 mL配制好的硫化鈉溶液(1.5 mmol/L)加入到上述溶液中, 攪拌均勻后, 將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到50 mL不銹鋼水熱反應(yīng)釜(內(nèi)襯為聚四氟乙烯)中, 放入烘箱于180 ℃反應(yīng)12 h. 待反應(yīng)液冷卻至室溫后, 在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心, 洗滌, 以除去多余的表面活性劑, 最后將產(chǎn)品重新分散于去離子水中, 得到綠色的CuS分散液.

1.3rGO-CuS復(fù)合材料的制備

氧化石墨烯采用改進(jìn)的 Hummers法制備[19]. 將制得的GO 超聲處理(600 W)2 h, 再離心(轉(zhuǎn)速10000 r/min)去除大片的GO, 獲得平面粒徑小于500 nm 的單層結(jié)構(gòu), 濃度約為0.5 mg/mL. 將 2 g PVP 分散到10 mL GO分散液中, 攪拌均勻, 后續(xù)操作與CuS的制備過程相同. 最后得到墨綠色的rGO-CuS分散液.

1.4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞分別在含有相同濃度的 GO, CuS 和rGO-CuS 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后, 用磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗除去未被細(xì)胞攝取的納米材料, 再加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h, 使材料能完全進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部. 在980 nm激光下照射5 min(功率密度1 W/cm2)后, 用中性紅對活細(xì)胞進(jìn)行染色.

1.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將大小為1 mm3的移植瘤組織植入20只裸鼠背部皮下, 待腫瘤長至約6 mm3時(shí)將裸鼠隨機(jī)分成5組: 空白對照組、rGO-CuS組、GO+laser組、CuS+laser組和rGO-CuS+laser組, 每組4只. 進(jìn)行瘤內(nèi)注射時(shí), 每組瘤內(nèi)多點(diǎn)注射50 μL相應(yīng)藥液(1 mg/mL). 其中GO+laser組、CuS+laser組和rGO-CuS+laser組用980 nm 激光(功率 1 W/cm2)照射腫瘤部位 5 min. 觀察22 d.

2結(jié)果與討論

2.1rGO-CuS納米復(fù)合材料的制備

Scheme 1為rGO-CuS形成過程示意圖. 向GO分散液中加入CuCl2后, 由于GO表面帶有大量負(fù)電荷和含氧活性基團(tuán), Cu2+可以通過靜電作用吸附到GO表面. 加入Na2S作為硫源, 在180 ℃水熱條件下, Cu2+和S2-在GO表面反應(yīng)生成微小的納米晶, 隨著反應(yīng)時(shí)間的延長, 納米晶逐漸長大成納米片. 在制備過程中所加的PVP在整個(gè)過程中起到調(diào)節(jié)、控制顆粒大小和穩(wěn)定顆粒的作用[3]. 這種基于靜電吸附的方法可以使CuS牢固地生長在GO的表面, 最終實(shí)現(xiàn)rGO-CuS的合成.

Scheme 1　Schematic illustration of the synthesis of rGO-CuS

2.2rGO-CuS納米復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)與形貌表征

圖1(A)為利用水熱法在不添加GO時(shí)制備的CuS納米片的HRTEM照片. 從圖中可以清楚地觀察到CuS呈不規(guī)則的多邊形片狀結(jié)構(gòu), 粒徑為20～100 nm, 納米片的粒徑分布較寬且形狀各異, 與文獻(xiàn)[3,16]中顆粒狀的或花瓣?duì)畹腃uS相同. 圖1(B)和(C)分別為在含有GO的反應(yīng)液中形成的rGO-CuS的TEM和HRTEM照片. 可見, 在含有GO的反應(yīng)液中, CuS納米片可以成功生長在石墨烯的表面, 其顆粒大小更均勻, 約40～50 nm, 且多為四邊形.

由圖1(D)可以明顯看出CuS的晶格條紋, CuS晶片的晶面間距為0.190 nm, 對應(yīng)的是CuS的(110)晶面. 通過CuS納米的快速傅里葉變換圖[FFT, 圖1(D)插圖]可以觀察到清晰的衍射斑點(diǎn), 進(jìn)一步證明了CuS 的單晶結(jié)構(gòu).

Fig.1　TEM images of CuS(A) and rGO-CuS(B), HRTEM images of rGO-CuS at different 　magnifications(C, D)　Inset in (D) shows the FFT pattern of rGO-CuS.

由圖2可以看到, rGO-CuS的部分衍射峰與硫化銅標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS No.65-3929)一致, 產(chǎn)物的晶格參數(shù)為a=b=0.3760 nm,c=1.6200 nm. 部分衍射峰強(qiáng)度不高, 有雜峰, 是由于水熱反應(yīng)時(shí)間和PVP濃度的影響所導(dǎo)致. 通過以上分析可以確定已經(jīng)制備出rGO-CuS復(fù)合材料.

Fig.2　XRD pattern of rGO-CuS nanoparticles

圖3(A)中GO與rGO-CuS 的拉曼光譜圖都顯示出碳材料典型的 D 峰和G峰, 分別位于1350和1600 cm-1. D峰和G峰面積的比值(ID/IG)是反映石墨烯還原程度的重要參數(shù). rGO-CuS的ID/IG值為 1.15, 而未經(jīng)過水熱處理的GO的ID/IG值為0.95, 這說明在水熱過程中, GO已經(jīng)被部分還原成rGO[19]. 相對于GO, rGO在近紅外區(qū)的吸收得到明顯增強(qiáng), 光熱轉(zhuǎn)化的效率也更高, 已被證實(shí)能夠更高效地殺死腫瘤細(xì)胞[6].

Fig.3　Raman(A), FTIR(B), UV-Vis-NIR(C) spectra and photothermal heating curves(D) of GO(a), 　rGO-CuS(b) and CuS(c)　(D) The samples were dispersed in 200 μL of water respectively with a concentration of 1 mg/mL.

圖3(C)是濃度均為1 mg/mL的CuS和rGO-CuS水分散液的紫外-可見-近紅外吸收光譜圖. 可見, rGO-CuS納米復(fù)合材料在整個(gè)光譜區(qū)(400～1100 nm)的吸收值都明顯高于CuS, 其在980 nm的吸收值是CuS的1.5倍. rGO-CuS 在近紅外區(qū)的強(qiáng)吸收特性預(yù)示其能更有效地將近紅外光轉(zhuǎn)換成熱量而用于光熱治療.

測試了相同濃度 GO, CuS 和 rGO-CuS 在近紅外光照射下的升溫速率, 結(jié)果如圖3(D)所示. 可見, 在功率密度1 W/cm2的980 nm 激光照射下, 5 min后GO水溶液溫度升至42 ℃, 相比其它2個(gè)樣品, 溫度上升幅度最低, 這與GO在近紅外區(qū)的吸收較弱相一致. CuS 的升溫效應(yīng)比較明顯, 光照5 min后溫度能升至約50 ℃; rGO-CuS的升溫效果更明顯, 光照5 min后溫度能升高到65 ℃. rGO-CuS良好的升溫效率是由于其在近紅外區(qū)光的吸收更高, 可以把更多的光能轉(zhuǎn)化為熱能.

2.3細(xì)胞毒性分析

為了評估GO, CuS和rGO-CuS作為光熱材料的可行性, 采用MC3T3細(xì)胞測試了3種材料的細(xì)胞毒性. 圖4為分別采用濃度為50, 100和200 μg/mL的GO, CuS, rGO-CuS培養(yǎng)基培養(yǎng)后MC3T3細(xì)胞存活率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

由圖4可知, 3種材料對MC3T3細(xì)胞均無毒性, 即使?jié)舛雀哌_(dá)200 μg/mL的材料與細(xì)胞培養(yǎng)后, 細(xì)胞的存活率仍高于100%, 符合材料無毒性的標(biāo)準(zhǔn).

Fig.4　Cytotoxicity evaluation test of MC3T3 cells 　with different concentrations of GO, CuS　and rGO-CuS

2.4納米復(fù)合材料對癌細(xì)胞的光熱治療

將HeLa細(xì)胞分別在含有GO, CuS 和rGO-CuS 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后, 分別在不采用激光照射和在980 nm激光下照射5 min, 然后用中性紅對活細(xì)胞進(jìn)行染色. 如圖5(A1)～(D1)和(A2)～(D2)所示, 在無激光照射下, 對照組、GO組、CuS組和rGO-CuS組的細(xì)胞都無死亡, 中性紅進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)發(fā)出明亮的紅色熒光, 說明藥物對細(xì)胞沒有抑制作用.

如圖5(A3)～(D3)和(A4)～(D4)所示, 對照組細(xì)胞在激光照射下死亡率很低, 中性紅進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)發(fā)射出明亮的紅色熒光, 并且維持良好的細(xì)胞形態(tài). CuS和GO組中細(xì)胞出現(xiàn)了部分死亡, CuS組比GO組細(xì)胞死亡的數(shù)目多, 但仍有細(xì)胞存活. rGO-CuS孵育過的HeLa細(xì)胞在激光照射下大部分都已經(jīng)死亡, 細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了改變, 由貼壁狀態(tài)良好的紡錘形變成了圓形. 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 相對于GO和CuS, rGO-CuS對癌細(xì)胞具有更好的光熱殺滅效果.

Fig.5　Fluorescence microscope images of HeLa cells staind by neutral red without the irradiation of laser(A1—D1, A2—D2) and after treated by the irradiation of 980 nm laser with the power density of 1 W/cm2 over 5 min(A3—D3, A4—D4) for 100 μg/mL rGO-CuS(A1—A4), 100 μg/mL CuS(B1—B4) and 100 μg/mL GO(C1—C4) and control(D1—D4)(A1—D1), (A3—D3) Dark field; (A2—D2),(A4—D4) bright field.

2.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測試

Fig.6　Quantitative measurement of tumor volumes 　after treatment　a. DI water; b. rGO-CuS; c. GO+laser;　 d. CuS+laser; e. rGO-CuS+laser.

采用在裸鼠皮下種植HeLa宮頸癌腫瘤, 然后向瘤內(nèi)注射納米材料的方式評價(jià)材料的腫瘤消融效果. 圖6為經(jīng)過光熱治療后小鼠腫瘤體積隨時(shí)間的變化圖. 可見, 激光照射22 d后, 未被激光照射的去離子水空白對照組和rGO-CuS組的腫瘤從最初的1250 mm3增長到3000 mm3; 而激光照射的3組腫瘤體積明顯減小, GO+laser組、CuS+laser組和rGO-CuS+laser組的腫瘤體積從最初的1250 mm3分別減小到670, 375和0 mm3. 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 經(jīng)不同條件處理后, rGO-CuS+laser組治療小鼠腫瘤的效果最好, 表明rGO-CuS是一種更加高效的可用于光熱治療的納米復(fù)合材料.

綜上所述， 采用一步水熱法制備了還原氧化石墨烯-硫化銅納米復(fù)合材料, 測試了其在功率密度為1 W/cm2的980 nm紅外光照射下的升溫實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞熱療實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn). 結(jié)果表明, 在相同功率激光的照射下, rGO-CuS殺滅癌細(xì)胞的效果要明顯好于未復(fù)合的 CuS 納米片和GO, 并且在小鼠腫瘤內(nèi)注射rGO-CuS并經(jīng)激光照射后腫瘤體積為0 mm3; 而注射CuS和GO組的腫瘤經(jīng)激光照射后仍存在, 體積分別為375和670 mm3. 表明rGO-CuS 是一種更加高效的可對癌癥進(jìn)行光熱治療的復(fù)合納米材料.

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Preparation of Reduced Graphene Oxide-Copper Sulfide Composite as

Efficient Photothermal Agents for Ablation of Cancer?

KONG Xiangquan, YAN Gang, KUANG Miao, RONG Jianhua*

(DepartmentofMaterialScience&Engineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

AbstractA novel reduced graphene oxide-copper sulfide nanoplates(rGO-CuS) composite with photothermal property was synthesizedviaone-pot hydrothermal method. Structure and morphology of the as-synthesized rGO-CuS nanocomposite were confirmed by transmission electron microscopy(TEM), UV-Vis-NIR and Raman spectroscopy. The rGO-CuS nanocomposite showed enhanced optical absorbance in near infrared region and higher photothermal conversion efficiency than graphene oxide(GO) and CuS nanoplates. The rGO-CuS nanocomposite was further used to photothermal ablation of cancer cells and cancer tissue under a 980 nm laser irradiation and showed improved performance than CuS nanoplates and GO.

KeywordsGraphene oxide; Copper sulfide; Nanocomposite; Photothermal treatment; Cancer cell

(Ed.: S, Z, M)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21344001).

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 21344001)資助.

收稿日期:2015-07-08. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-20.

中圖分類號O614.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

doi:10.7503/cjcu20150526 10.7503/cjcu20150644

聯(lián)系人簡介: 容建華, 女, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事高分子材料和生物醫(yī)用材料研究. E-mail: trong@jnu.edu.cn