丁麗艷，宋　斌，韓永勝，李同豹，丁得利

(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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分子育種技術(shù)及其在家禽育種中應(yīng)用的研究進(jìn)展

丁麗艷，宋斌，韓永勝，李同豹，丁得利

(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

摘要：分子育種技術(shù)從一誕生就受到了科學(xué)家們普遍關(guān)注，現(xiàn)已大量應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、動物學(xué)等領(lǐng)域，其中，在家禽育種中的應(yīng)用，也取得了一定的成果。家禽主要以分子標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種為主。筆者就分子育種的方法及其在家禽育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀和展望作以綜述。

關(guān)鍵詞：家禽；分子育種技術(shù)；研究進(jìn)展

1分子育種的概念

分子育種指DNA分子標(biāo)記輔助育種，是一種利用DNA水平上的分子標(biāo)記對生物群體進(jìn)行遺傳改良的技術(shù)，也就是將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于育種中，在分子水平上進(jìn)行育種。

2分子育種的方法

2.1分子標(biāo)記輔助育種

2.1.1基因定位

就是將基因定位于某一特定的染色體上，以及測定基因在染色體上線性排列的順序和距離，也就是準(zhǔn)確地控制表型性狀的基因在基因組中的位置。

2.1.2分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)

分子標(biāo)記輔助選擇是指與特定的數(shù)量性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記為工具，以標(biāo)記信息作為輔助信息，對該數(shù)量性狀進(jìn)行選擇，以便在育種中獲得較大的遺傳進(jìn)展。

1983年，Soller和Backman[1]提出了“標(biāo)記輔助選擇”。MAS充分利用了遺傳標(biāo)記、表型和系譜的信息，具有比常規(guī)評定方法更大的信息量和準(zhǔn)確性，是家禽品種改良的有效方法。

2.1.3分子標(biāo)記輔助導(dǎo)入(MAI)

將供體群中少數(shù)優(yōu)良目的基因(QTL) 導(dǎo)入到受體群，MAS既可用于跟蹤鑒別目的基因，又可加速受體基因組(背景基因) 的恢復(fù)。

MAI實(shí)質(zhì)上是在標(biāo)記QTL 輔助下進(jìn)行的雜交，可使受體群在目標(biāo)性狀得到提高的同時(shí)，盡量保留原有的遺傳背景。

2.2遺傳修飾育種

遺傳修飾育種即轉(zhuǎn)基因育種，就是將基因工程應(yīng)用于育種工作中，通過基因?qū)耄瑥亩嘤鲆欢ㄒ蟮男缕贩N的育種方法。轉(zhuǎn)基因育種方法主要有顯微注射法、精子介導(dǎo)法、體細(xì)胞核移植方法。

2.2.1顯微注射法

在顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針(直徑1～2μm)直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。

應(yīng)用這種方法外源基因的導(dǎo)入整合效率較高，不需要載體，可以直接轉(zhuǎn)移目的基因，實(shí)驗(yàn)周期短。但需要貴重精密儀器，技術(shù)操作較難，并且外源基因的整合位點(diǎn)和整合的拷貝數(shù)都無法控制，容易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應(yīng)的性狀改變或致死。

2.2.2精子介導(dǎo)法

直接用精子作為外源基因的載體的基因轉(zhuǎn)移方法。家禽的精子進(jìn)入體內(nèi)后，要24h之后才能達(dá)到受精部位，而且大部分精子將在輸卵管貯精腺體中保存下來，在3周之內(nèi)都有受精能力。應(yīng)用此方法的成本較低，但由于精子在母體內(nèi)長期停留而造成外源基因的丟失等原因，利用精子作為載體，可能會更容易發(fā)生實(shí)驗(yàn)的不可預(yù)測性和不可重復(fù)性。

2.2.3體細(xì)胞核移植法

先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)?，篩選獲得帶轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，然后，將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。重構(gòu)胚胎經(jīng)移植到母體中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。

通過轉(zhuǎn)基因操作可以將作用顯著的激素和生長因子的基因?qū)爰仪莸幕蚪M或剔除某些生產(chǎn)性能不利的基因，從而大大提高生產(chǎn)性能。1987年，Salter等[2]用禽白血病病毒感染早期的雞胚制作了轉(zhuǎn)基因雞；1994年Naito等[3]應(yīng)用顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因雞。

3在家禽育種中的應(yīng)用

家禽育種起步于二戰(zhàn)時(shí)期，經(jīng)歷了表型選擇、育種值選擇和分子育種三個(gè)階段。隨著遺傳學(xué)理論的不斷發(fā)展，分子育種已經(jīng)成為家禽育種的主要手段。

3.1在家禽品種遺傳多樣性評估中的應(yīng)用

家禽品種資源的遺傳多樣性可以為研究其品種起源和分化作重要參考。分子生物技術(shù)能夠準(zhǔn)確地揭示家禽品種間及品種內(nèi)差異和品種的遺傳結(jié)構(gòu)，為家禽品種的保護(hù)和合理利用提出重要依據(jù)。

微衛(wèi)星多太性反映著物種進(jìn)化歷史，不同品種在同一微衛(wèi)星座位上等位基因數(shù)目和頻率的差異表現(xiàn)出其遺傳的差異，并由此可區(qū)分品種的類型，同時(shí)對目標(biāo)基因在保種群世代傳遞過程中的分離和重組進(jìn)行跟蹤，通過有意識地選留，防止目標(biāo)基因因遺傳漂變而丟失。左正宏等[4]用40個(gè)隨機(jī)引物對金定鴨等十個(gè)品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性分析，證明鴨品種間存在遺傳差異，而且品系內(nèi)個(gè)體間也存在差異。

3.2在改良家禽重要經(jīng)濟(jì)性狀中的應(yīng)用

長期以來，家禽育種的目標(biāo)主要集中在提高經(jīng)濟(jì)性狀上，各種資源被最大限度地用來增強(qiáng)與經(jīng)濟(jì)利益相關(guān)的生產(chǎn)性能。

3.2.1在改良家禽肉質(zhì)中的應(yīng)用

脂肪酸結(jié)合蛋白基因(EX-FABPs gene)在雞胚、心肌和大血管平滑肌中表達(dá)。王啟貴等(2001)[5]以雞的細(xì)胞外EX-FABPs基因作為影響雞脂肪性狀的主要基因，以明星肉雞和絲毛烏骨雞雜交產(chǎn)生的F2代雞群為實(shí)驗(yàn)材料，針對該基因的5'調(diào)控區(qū)進(jìn)行了PCR-SSCR分析，結(jié)果表明檢測到的基因位點(diǎn)與體脂沉積有關(guān)。孟和等(2001)[6]以雞的激素核受體α基因(PPAR-α)作為影響雞脂肪性狀的主效基因，采用PCR-SSCR法分析了該基因編碼區(qū)位點(diǎn)突變，結(jié)果表明該基因的單堿基突變產(chǎn)生的等位基因的不同基因型個(gè)體間腹脂重和腹脂率差異顯著。

3.2.2在改良家禽生產(chǎn)性能中的應(yīng)用

矮小型雞與普通雞相比，體重減少1/3，單位空間飼養(yǎng)量可增加20%、節(jié)省飼料30%[7]、產(chǎn)蛋量提高15%[8]，且抗病性和適應(yīng)性都強(qiáng)，成活率提高。應(yīng)用分子育種技術(shù)研究可知，隱性伴性矮小基因dw基因?qū)﹄u體健康無害，且對人體有利的隱性突變基因。Hutt(1959)[9]研究發(fā)現(xiàn)了dw基因，位于性染色體的z染色體上，呈伴性隱性遺傳。我國科學(xué)家于1993年利用RFLP技術(shù)，證明了性連鎖性矮小雞生長激素受體基因編碼受體蛋白胞內(nèi)的第十個(gè)外顯子發(fā)生了1775個(gè)核苷酸的缺失突變，給雞性連鎖矮小基因的分子遺傳基礎(chǔ)研究得出了明確的結(jié)論。

1968年法國最先將含dw基因的雞應(yīng)用于肉雞配套系中，育成了矮腳雜交肉雞。美國、加拿大、荷蘭、中國先后應(yīng)用矮小雞dw基因培育出了自己本國的肉雞品種。隨后美國、中國又將含dw基因的雞應(yīng)用到蛋雞的培育中，獲得產(chǎn)蛋量高的蛋雞。

家禽生長激素(GH)基因由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞合成和分泌。GH可通過刺激骨、軟骨細(xì)胞的生長和分化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝從而促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育[10]。1988年研究者[11-12]對鴨和雞完成了生長激素基因的測序研究；Stephen(2004)[13]在此基礎(chǔ)之上，完成了雞GH全基因組的測序；1990年Foster等[14]完成了火雞生長激素基因的測序工作；敖金霞(2004)[15]公布了鵝GH部分基因的基因序列。而且經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GH的表達(dá)水平和位置依據(jù)家禽的品種和品系的不同，而有所區(qū)別。蛋雞垂體GH受體mRNA水平高于肉雞，而肝臟GH受體mRNA水平卻低于肉雞[16]；鵝GH基因只在垂體和下丘腦中表達(dá)，在心臟、肺、肝臟等部位都不表達(dá)[15]，朗德鵝垂體中GH mRNA表達(dá)顯著高于皖西白鵝[17]。

3.2.3在改良家禽羽色和快慢羽中的應(yīng)用

3.2.3.1在改良家禽羽色中的應(yīng)用

羽色是禽類一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，研究羽色遺傳對于探討禽類起源、演化、標(biāo)記品種和品系的特征、進(jìn)行禽類育種和生產(chǎn)及開展實(shí)驗(yàn)動物研究等方面都具有重要意義。由于羽色基因(s/S)是伴性基因，所以在育種中可以應(yīng)用伴性性狀進(jìn)行家禽羽色自別雌雄。

研究表明，禽類的羽色主要由黑色素的種類和分布不同產(chǎn)生的不同的表現(xiàn)型的結(jié)果[18]。在禽類的黑色素合成和羽色表達(dá)過程中，有多種基因和酶類參加其中，主要有黑色素皮質(zhì)受體Ⅰ(MCIR)、酪氨酸酶(TYR)和刺鼠相關(guān)蛋白(AGRP)。其中雞的羽色具有多樣性，色素原基因CC和氧化酶基因OO互相作用產(chǎn)生的不同的羽色，雞的羽色性狀涉及到15個(gè)基因位點(diǎn)[19]。利用羽色伴性基因培育能自別雌雄的家雞品系，鑒別準(zhǔn)確率可達(dá)100%?，F(xiàn)在根據(jù)市場對不同羽色雞的需求，對特定的羽色或羽色基因進(jìn)行選擇和剔除，培育出了特定羽色基因的純系。

家鴨的羽色遺傳主要由9個(gè)基因座控制[20]，這些基因座交互作用，產(chǎn)生了多種羽色。研究者較多研究的是鴨白羽遺傳，Jaap[21]最早提出家鴨白羽由常染色體上的隱性基因(c/c)控制，Gong等[22]研究得出鴨白羽是由兩個(gè)常染色體基因座C和T控制，隱性t與連城白鴨的白羽有關(guān)，顯性等位基因T和C交互作用產(chǎn)生灰羽。

3.2.3.2在改良家禽快慢羽中的應(yīng)用

羽速基因(K/k)位于雞的z染色體上，為伴性基因，控制禽類羽毛生長速度。根據(jù)羽速基因的伴性遺傳規(guī)律，在雞育種中可以選育羽速自別雌雄的配套系。

應(yīng)用分子PCR技術(shù)檢測雞染色體K座位上是否包括有HaeⅢ酶切位點(diǎn)的Urb序列來判斷快慢羽雞。有則為快羽雞，沒有則為慢羽雞[23]。生產(chǎn)上將快羽公雞與慢羽母雞交配，所得后代公雛為慢羽，母雛為快羽，出殼后即可自別雌雄，克服傳統(tǒng)翻肛慢，且對雞易造成損傷等缺點(diǎn)，在生產(chǎn)上應(yīng)用價(jià)值較高。國內(nèi)外學(xué)者培育的快慢羽雞配套系有：海蘭雞、羅曼蛋雞、伊沙B-380、星紅褐、明星肉雞、成都白雞、杏花雞、洛島紅雞、濱白雞等[24]。

3.3在家禽抗病育種中的應(yīng)用

在家禽育種中人們長期關(guān)注經(jīng)濟(jì)性狀的提高，卻忽略了家禽的抗病能力，導(dǎo)致家禽的疾病抵抗能力下降，引發(fā)大量疾病，用常規(guī)的防疫措施已無法抵擋疾病的發(fā)生，給家禽業(yè)帶來巨大的損失，因此人們開始在分子水平探索防疫途徑。

目前，分子育種技術(shù)已經(jīng)深入到家禽多種疾病的研究中。國內(nèi)外的許多研究者都發(fā)現(xiàn)雞的許多疾病都與慢羽基因K有關(guān)。慢羽雞對淋巴血病、大腸桿菌病、ALV等病毒感染率比快羽雞高，但對馬立克氏病病毒無差別。Bacon(1988)[25]應(yīng)用分子技術(shù)證實(shí)慢羽基因K與內(nèi)源病毒ev21是緊密連鎖的，這種病毒能夠減弱慢羽雞的免疫系統(tǒng)，從而對慢羽雞個(gè)體產(chǎn)生一系列不良后果[26]。

人們又開始將轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)應(yīng)用到改良家禽抗病育種中。將兩個(gè)或多個(gè)抗病毒基因克隆到同一個(gè)載體上，然后導(dǎo)入動物體內(nèi)，這樣不同病毒功能基因可以協(xié)同作用。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病品種雞取得了一定的成果：利用微修飾發(fā)病的ALV作為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的載體生產(chǎn)對ALV具有高度抗性轉(zhuǎn)基因蛋雞；用封閉細(xì)胞受體法培育抗淋巴白血病的雞種；通過利用反義基因阻礙病原蛋白的轉(zhuǎn)譯法，克隆了新城疫(ND)、法氏囊病毒(IBD)、馬立克氏病(MD)、傳染性支氣管炎(IB)和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)等的基因片段，為雞的抗病育種提供了試驗(yàn)材料。

4展望

由于分子育種是直接在DNA水平上對性狀基因型進(jìn)行選擇，選擇準(zhǔn)確性更高，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用還能根據(jù)市場需求創(chuàng)造出新的畜禽品種，未來的發(fā)展，分子育種技術(shù)已經(jīng)成為家禽育種的一個(gè)重要方法。但就目前而言，分子育種技術(shù)較常規(guī)育種方法相比，耗費(fèi)資金多，效益性價(jià)比低，相信隨著人們對該項(xiàng)技術(shù)深入的研究與應(yīng)用，同時(shí)分子育種技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合，必將加快禽類育種的進(jìn)程，取得更多研究成果，獲得更大效益。

參考文獻(xiàn)：

[1] Soller M,Beckmann JS.Genetic polymorphism in varietal identification and genetic improvement. Tag Theoretical And Applied Genetics,1983,67(1):25-33.

[2]Salter DW, Smith EJ, Hughes SH, Wright SE, Crittenden LB. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chicken germ line. Virology 1987,157(1):236-240.

[3] Natio M., Sasakl E., Ohtaki M. et al. Introdution of exogenous DNA into somatic and germ cells of chickens by microinjection into the germinal disc of fertilized ova[J].Mol.Reprod.Dev.1994,37:167-171 .

[4] 左正宏，陳奕欣，呂良炬.金定鴨遺傳多樣性及分子標(biāo)記的研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，43(2)：256-259.

[5] 王啟貴，李寧，鄧學(xué)梅，等.雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白基因單核苷酸多太性與腹脂性狀的相關(guān)研究[J].中國科學(xué)C輯，2001，31(3)：266-270.

[6] 孟和，李志輝，于赫，等.白羽肉雞雙向選擇系雜交效果研究[J].中國家禽，2001，23(14)：11-13.

[7] Burgess 著.夏國良，等譯.新型的矮小型雞[J].國外畜牧科技，1989，16(2)：9-10.

[8] 李東.dw雞在肉雞育種和生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].國外畜牧科技，1990，17(4)：11-12.

[9] Hutt F B,Lamoreux W F.Genetics of the fowl:Ⅱ.A linkage map of sex chromosomes[J].J Hered,1959，940,31:231-235.

[10] 孫遜，朱尚權(quán).生長激素的結(jié)構(gòu)與功能[J].國外醫(yī)學(xué)、生理、病理科學(xué)與臨床分冊，1999，19(1)：6-9.

[11] Huang-Tsu Chen,Fu-Ming Pun,Wen-Chang chang.Purification of duck growth homone and cloning of the complemetary DNA[J].Biochimica et Biophysica Acta,949(2):247-251.

[12] Lan C.Lamb,Donna M,Galehouse,Douglas N,Foster. Chicken growth hormone cDNA sequence[J].Nucleic Acids Research,16(19):93-99.

[13] Stephen C,Y. Ip, Joanna S,Lau,W,L.Au,et al.Characterizution of the 5'-flanding transcriptional regulatory region of chicken growth hormone gene[J].Experinental biology and medicine,2004,229:640-649.

[14] Douglas N.Foster,Sung U.Kim,John J.Engeart,et al.Nucleotide sequence of the complementary DNA for turkey growth hormone [J].Biochemical and Biophysical research communications,1990,1973(3)：967-975.

[15] 敖金霞，李輝，王啟貴，等．鵝生長激素基因的克隆和組織表達(dá)[J].農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2004,12(5):552-555.

[16] 趙茹茜，E.Muehl bauer,陳杰，等.雞垂體GH及其肝臟GH受體基因表達(dá)的比較研究[A].生命科學(xué)與生物技術(shù)：中國科協(xié)第三屆青年學(xué)術(shù)年會論文集，1998.

[17] 朱楓橋，周杰，鄭智勇，等.皖西白鵝與朗德鵝垂體中GH基因表達(dá)的研究[J].水禽世界，2008，6：32-34.

[18] 鄧素華，高軍，任軍，等.黑素皮質(zhì)素受體Ⅰ(MCIR)基因與豬毛色表型號的研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(10)：949-954.

[19] 趙興波.分子診斷與動物分子育種[M].北京：科學(xué)出版社，2011.

[20] 張細(xì)權(quán)，李加琪，楊關(guān)福.動物遺傳標(biāo)記[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997.

[21] Jaap R G, Inheritance of white sporting in ducks[J].Poultry Science, 1933,12:233-241.

[22] Gong Y, Yang Q, Li S, et at. Grey plumage coloration in the duck is genetically determined by alleles on two different interacting [J]. Anim Genet, 2010，41(1)：105-108.

[23] 肖兵南，燕海峰，吳曉林.PCR-RFLP和測交方法對進(jìn)口祖代蛋雞異體個(gè)體間的遺傳同質(zhì)性檢測[J].生命科學(xué)研究，2000，4(3)：250-254.

[24] 宋素芳，康湘濤，竹學(xué)軍. 羽速基因在養(yǎng)雞業(yè)中的應(yīng)用[J].中國家禽，2003，25(18)：18-21.

[25] Bacon ED. Association of the slowfeathering(k) and the Z chromosome of chickens. Poultry Sci, 1998,87:191-197.

[26]李寧，吳常信.雞性連鎖矮小基因的研究進(jìn)展[J].中國家禽，2003，4：30-31.

來改善飼料礦物質(zhì)含量，提高飼養(yǎng)水平。

文章編號：2095-9737(2016)02-0057-03

中圖分類號：S814

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

作者簡介：丁麗艷(1971-)，女，黑龍江綏化人，碩士，研究方向?yàn)榉肿佑N。

收稿日期:2015-09-14