孫騰達(dá)綜述，張　超審校（重慶容光醫(yī)院泌尿外科，重慶401123）

陽離子通道在精子生理及男性生育中的作用研究進(jìn)展

孫騰達(dá)綜述，張超審校
（重慶容光醫(yī)院泌尿外科，重慶401123）

離子通道；精子/生理學(xué)；精子獲能；不育，男（雄）性；綜述

在哺乳動(dòng)物的精子中表達(dá)6個(gè)跨膜螺旋重復(fù)單位的離子通道樣蛋白被命名為精子陽離子通道蛋白。目前，已報(bào)道的該家族成員有4個(gè)：CatSper1、CatSper2、CatSper3、CatSper4［1-2］。CatSper1基因定位于人染色體11q12.1，CatSper2基因定位于人染色體 15q15.3，Cat Sper3基因定位于人染色體5q31.1，CatSper4基因定位于人染色體 1p35.3。CatSper1最早是在鈣（calcium，Ca2+）電壓門控通道的同源測序的研究中被發(fā)現(xiàn)的，隨后發(fā)現(xiàn)了其他3個(gè)成員［1］。4個(gè)蛋白具有高度同源性及相對較低的跨膜區(qū)基因序列相似性，相似度為16%～22%。精子陽離子通道基因表達(dá)模式表明其在精子生理和生育中具有重要作用。Balderas等［3］研究表明，CatSper1、CatSper2、CatSper3、CatSper4 mRNA表達(dá)特異性限于小鼠和人類睪丸組織。采用原位雜交方法研究4個(gè)成員的動(dòng)態(tài)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CatSper2轉(zhuǎn)錄發(fā)生在生精過程早期（粗線期精母細(xì)胞），而CatSper1、CatSper3、CatSper4僅在生精過程末期轉(zhuǎn)錄（精細(xì)胞）。采用一種更加敏感的檢測技術(shù)，如實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)也證實(shí)了該種表達(dá)模式，顯示CatSper2在出生后第8天表達(dá)，CatSper3、CatSper4在出生后第15天表達(dá)，CatSper1在出生后第18天表達(dá)［3］。

1　CatSper基本結(jié)構(gòu)

通常情況下一個(gè)完整的離子通道是由具有成孔作用的蛋白亞基和一個(gè)甚至多個(gè)輔助性亞基構(gòu)成。目前，CatSper亞基尚未被深入研究。由于4個(gè)CatSper成員均需要功能性堿性化激活電流的激活作用，因此，其微孔通道被認(rèn)為是4個(gè)CatSper成員形成的四聚體。此外該通道復(fù)合體還包含多重跨膜蛋白CatSperB（之前稱為CatSperβ）［4］。Chávez等［5］還鑒定了一種新發(fā)現(xiàn)的單跨膜蛋白CatSperG，與CatSper復(fù)合體相關(guān)聯(lián)。因此，CatSper蛋白復(fù)合體至少由3種跨膜蛋白組成，即具有成孔作用和6個(gè)跨膜螺旋重復(fù)單位的CatSper1～4，一個(gè)具有雙重跨膜結(jié)構(gòu)的 CatSperB及具有單一跨膜結(jié)構(gòu)的CatSperG。此種結(jié)構(gòu)與其他離子通道，如電壓門控性鈣離子通道、電壓門控性鈉離子通道、電壓門控性鉀離子通道等具有高度的相似性。蛋白純化后在含有CatSper1蛋白復(fù)合體中未鑒定出其他主要蛋白。提示其他蛋白在復(fù)合體中或許具有某種功能，但其與CatSper1的結(jié)合強(qiáng)度較弱，因此，在蛋白純化時(shí)被丟失。

2　CatSper基因敲除動(dòng)物模型相關(guān)研究

為明確CatSper基因丟失所帶來的效應(yīng)，現(xiàn)有研究已構(gòu)建了4種CatSper基因敲除小鼠模型。應(yīng)用CatSper1缺失小鼠精子的研究結(jié)果顯示，精子的超活化作用發(fā)生重要損害而導(dǎo)致不育的表型，此外還導(dǎo)致了去極化作用誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的缺失［6］。Chávez等［5］在一項(xiàng)最初的研究中證實(shí)，CatSper蛋白是維持正常精子運(yùn)動(dòng)和穿透卵細(xì)胞過程所必須的。其制備了CatSper-/-純合子模型并在光學(xué)顯微鏡下近距離觀察了精子運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)了正常野生型精子和基因缺失精子之間的巨大差異。正常小鼠精子尾部呈有力的鞭打樣及持續(xù)前向運(yùn)動(dòng)；相反CatSper基因敲除小鼠精子則表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩及極少定向運(yùn)動(dòng)。尤其突出的是該類精子尾部缺乏有力鞭打樣運(yùn)動(dòng)和彎曲度。計(jì)算機(jī)輔助精子運(yùn)動(dòng)分析顯示，基因敲除小鼠精子的重要運(yùn)動(dòng)參數(shù)，如平均路徑速度、直線速度、曲線速度等均明顯受損，表明CatSper基因缺失可導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力顯著降低。該研究同時(shí)在體外受精實(shí)驗(yàn)中檢測了CatSper缺失精子的受精能力，CatSper缺失精子不能使卵子受精，反之未敲除CatSper基因精子可使81%卵子受精。盡管有些CatSper缺失精子可黏附在卵子上，但似乎并不能穿透透明帶，可能與其運(yùn)動(dòng)性能降低有關(guān)。在正常自然受精過程中精子需穿透卵子透明帶蛋白的外周層并與卵細(xì)胞質(zhì)膜相結(jié)合。為檢測基因敲除精子是否保留了與卵子質(zhì)膜相結(jié)合及激活受精作用的能力，將基因敲除精子及未敲除基因精子與用酶去除透明帶的卵細(xì)胞一起孵育，在此種條件下2種精子均可使卵子受精，說明CatSper對精子穿透卵子的外層是非常必需的，但對卵子的激活并非必須。

用基因敲除小鼠進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CatSper1及CatSper2對精子超活化至關(guān)重要［7］。雄性小鼠不管是CatSper1基因缺失還是CatSper2基因缺失均會(huì)導(dǎo)致生育功能的完全喪失。且CatSper1、CatSper2缺失的精子在獲能環(huán)境下均不能超活化。與此相似，CatSper3、CatSper4缺失的成年純合子雄性小鼠與成年野生型雌性小鼠交配并未生產(chǎn)任何后代，盡管其擁有正常的交配行為。然而其同窩出生的雜合子小鼠卻能產(chǎn)生正常數(shù)量的子代和具有正常的產(chǎn)仔間隔［8］。CatSper3-/-、CatSper4-/-缺失的純合子小鼠也完全不育，盡管其精子計(jì)數(shù)及最初運(yùn)動(dòng)功能均正常。在獲能介質(zhì)中未敲除CatSper2基因精子在室溫孵育30 min后發(fā)生超活化作用，而CatSper3 或CatSper4缺失的精子在孵育2 h后仍表現(xiàn)為最初的運(yùn)動(dòng)形式。提示在精子獲能過程中功能性CatSper3、CatSper4蛋白是精子超活化所必需的［9］。有趣的是當(dāng)未敲除CatSper2基因精子置于無Ca2+介質(zhì)中時(shí)15 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)便消失，而CatSper3、CatSper4基因缺失精子仍然表現(xiàn)為較弱的最初運(yùn)動(dòng)，提示CatSper3、CatSper4缺失時(shí)精子的最初運(yùn)動(dòng)可在胞外無Ca2+時(shí)仍然得以維持。

在對基因敲除小鼠的詳盡評估后作者歸納了導(dǎo)致雄性不育的3條重要因素：（1）運(yùn)動(dòng)性快速喪失，明顯減低了CatSper3、CatSper4蛋白缺失精子到達(dá)輸卵管壺腹部與卵子相遇的數(shù)量；（2）CatSper3、CatSper4缺失精子不能穿過黏液介質(zhì)，提示這些基因突變的精子在雌性生殖道的黏液內(nèi)不能有效行進(jìn)，因此，抵達(dá)卵子所在部位的精子量將會(huì)大大減少；（3）超活化的缺失將使突變精子在受精過程中難以產(chǎn)生足夠前進(jìn)動(dòng)力以穿透卵丘細(xì)胞和透明帶［10-11］。這一發(fā)現(xiàn)提示，功能性CatSper3、CatSper4蛋白是維持精子運(yùn)動(dòng)能力和產(chǎn)生穿透卵細(xì)胞外層的動(dòng)力來源所必需的。

如上所述，在CatSper3-/-、CatSper4-/-純合子小鼠中精子運(yùn)動(dòng)功能的喪失與CatSper1-/-、CatSper2-/-純合子小鼠極為相似?？梢?種CatSper蛋白的任何一種缺失均會(huì)在獲能環(huán)境中呈現(xiàn)超活化運(yùn)動(dòng)缺乏和最初運(yùn)動(dòng)能力的快速喪失。在小鼠中缺失4種CatSper通道蛋白中任何一種均出現(xiàn)幾乎相同的表型［12］。其高度同源的結(jié)構(gòu)域及相似的精子鞭毛定位均提示CatSpers 1～4形成一個(gè)陽離子通道聚合體，該陽離子通道聚合體是精子在雌性生殖道中激發(fā)超活化運(yùn)動(dòng)所必需的。有趣的是Sutovsky［13］研究已表明，4種CatSper蛋白事實(shí)上是相互關(guān)聯(lián)的，且可形成四聚體；另一方面CatSpers基因缺失的雌性小鼠則具有正常的生育功能，且與未敲除雌性小鼠比較，未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔間隔的差異。

3　CatSper可能扮演孕酮（黃體酶）受體角色

在輸卵管內(nèi)包繞卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞釋放的孕酮可使人精子Ca2+水平急速上升。孕酮誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，進(jìn)入精子內(nèi)，引起精子的獲能、超活化及趨化作用和頂體反應(yīng)［6，14-15］。利用膜片鉗技術(shù)分析人類成熟精子結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納摩爾濃度的孕酮就能顯著提高CatSper的通道能力，證明孕酮能強(qiáng)力激發(fā)精子鞭毛上的主要鈣離子通道——CatSper，從而使其鞭毛擺動(dòng)加快。作為一種卵巢激素，孕酮通常經(jīng)孕酮核受體調(diào)節(jié)基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。然而孕酮在轉(zhuǎn)錄沉默的精子方面的效應(yīng)尚未得到解釋，相信是通過一種特異的非基因組的膜孕激素受體而發(fā)揮作用［14］。在人精子中孕酮激活的Ca2+內(nèi)流并不涉及通過核受體的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模式。目前，已發(fā)現(xiàn)了多種孕酮可能的膜受體包括一種新近發(fā)現(xiàn)的G偶聯(lián)的孕酮受體和一個(gè)單通道受體（孕酮受體膜成分）。非基因組孕酮受體的下游通路推測涉及腺苷環(huán)磷酸和鳥苷環(huán)磷酸、蛋白激酶A和G、細(xì)胞內(nèi)池內(nèi)Ca2+的釋放、細(xì)胞內(nèi)池操控的Ca2+通道和鳥苷環(huán)磷酸激活通道。

CatSper通道也許扮演了一種新型孕酮受體的角色，調(diào)控孕酮在精子質(zhì)膜層面上快速的、非基因組水平的效應(yīng)。具體而言，CatSper收到孕酮信號后與孕酮結(jié)合，通道打開，這樣Ca2+就可進(jìn)入精子內(nèi)，從而引發(fā)鞭毛擺動(dòng)加快。孕酮是從卵細(xì)胞周圍釋放出來的，因此，隨著孕酮的釋放，這種信號就形成一個(gè)濃度梯度，精子通過Cat Sper接收信號，越靠近卵子，孕酮水平越高，精子游動(dòng)越快，最后到達(dá)卵細(xì)胞，與卵細(xì)胞融合。這種濃度梯度為精子的準(zhǔn)確定位提供了可靠信息。

已有研究顯示，人CatSper的效應(yīng)可被前列腺素激活增強(qiáng)，顯然這是通過孕酮結(jié)合位點(diǎn)以外的結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮作用的；CatSper或一種與其直接關(guān)聯(lián)的蛋白充當(dāng)精子上非基因組的孕酮受體，該受體是精子特異性的，結(jié)構(gòu)上不同于基因組孕酮受體。這一發(fā)現(xiàn)代表了一種開發(fā)新型非激素類避孕藥物的有前景的新靶點(diǎn)［16］。根據(jù)使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)的研究結(jié)果顯示，具有較弱電壓依賴性和PH敏感性的CatSper是唯一出現(xiàn)于鼠和人精子中具有穩(wěn)定活性的Ca2+的“調(diào)度者”。通過CatSper的Ca2+內(nèi)流激活精子超活化作用，CatSper也通常被認(rèn)為具有控制精子趨化性的作用，因?yàn)橐龑?dǎo)精子朝著卵細(xì)胞的“趨化運(yùn)動(dòng)”依賴于Ca2+內(nèi)流入鞭毛而激發(fā)的非對稱性鞭毛運(yùn)動(dòng)。由CatSper通道介導(dǎo)的鞭毛Ca2+內(nèi)流甚至導(dǎo)致精子頭部Ca2+水平升高（可能是由于位于精子頸部細(xì)胞內(nèi)池的Ca2+依賴性的Ca2+釋放），由此而促成Ca2+依賴性頂體反應(yīng)［17］。

4　CatSper基因突變的相關(guān)研究

在人類中的CatSper基因突變研究較少，僅有的Cat Sper2基因突變的研究已證實(shí)，與無癥狀的男性不育有關(guān)。人類其他的CatSper基因突變尚有待于進(jìn)一步研究。周密設(shè)計(jì)人類研究將可能鑒定不育個(gè)體中究竟是這種還是其他CatSper基因發(fā)生了突變。正如前所述，Cat Sper不僅為精子運(yùn)動(dòng)和超活化所必需的，且在精子對卵細(xì)胞的穿透過程中不可或缺。因此，不管是弱精癥或正常精子不育個(gè)體均是人類基因突變研究的理想載體。因?yàn)橛稍型せ畹腃atSper通道可引起所有3種Ca2+依賴性反應(yīng)，即超活化、趨化作用及頂體反應(yīng)［18］。CatSper通道抑制劑的鑒定將極大促進(jìn)精子Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究及進(jìn)一步幫助確定孕酮和CatSper的生理學(xué)作用。反過來，在不育人群中對CatSper基因突變的鑒定可進(jìn)一步促進(jìn)CatSper抑制劑的開發(fā)。

5　小結(jié)與展望

離子通道對精子運(yùn)動(dòng)、精子活化、頂體反應(yīng)及受精過程中的趨卵運(yùn)動(dòng)十分重要。CatSper基因在精子超活化中的作用已有較好的研究。但每個(gè)家族的特定通道的特定角色和特點(diǎn)功能尚不明確。精子陽離子通道的無效突變動(dòng)物模型已建立，其大部分表現(xiàn)為生育能力降低包括運(yùn)動(dòng)能力減低、超活化喪失或受精能力丟失，盡管其擁有正常的精液參數(shù)。動(dòng)物模型研究已證實(shí)，陽離子通道不可或缺的作用，但像CatSper2基因那樣的不育人群的突變篩選研究并未引起足夠的重視。陽離子通道在正常和非正常精子的生精、成熟、獲能和頂體反應(yīng)過程中的分子信號傳遞過程尚需進(jìn)一步研究。將有助于明確那些病因不明的不育人群的病因。此外陽離子通道家族的確定角色及其配體/信號分子尚有待于進(jìn)一步確定。在該類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中陽離子通道角色的確定可進(jìn)一步理解精子生理和確定受孕時(shí)間或避孕。分子特征的描述和不育個(gè)體中離子通道的篩選將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步說明其在男性不育中的準(zhǔn)確意義。弱精癥和精子正常不育個(gè)體因?yàn)槠渚涌赡苡邢鄳?yīng)的功能缺失而成為理想的篩選個(gè)體［19-22］。對精子陽離子通道引導(dǎo)精子運(yùn)動(dòng)和決定其生育的研究可為發(fā)現(xiàn)男性避孕藥物和治愈不孕提供最重要的研究方向。

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