● 姚 勇 江 巍 李玉山 黃德斌 萬 星▲

紅黑二丸甾醇提取物通過非鈣依賴磷脂酶A2介導(dǎo)的抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷研究※

● 姚 勇1*江 巍1李玉山2黃德斌2萬 星2▲

目的：探討紅黑二丸甾醇提取物抗心肌細(xì)胞H/R損傷的作用與機(jī)制。方法：western blot檢測(cè)不同H/R時(shí)間點(diǎn)iPLA2蛋白的表達(dá)，確定H/R的時(shí)間點(diǎn)；在H/R的基礎(chǔ)上，用不同濃度梯度的紅黑二丸甾醇提取物處理細(xì)胞，western blot 檢測(cè)iPLA2蛋白表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，試劑盒檢測(cè)LDH、SOD、MDA、TNF-α的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。結(jié)果：H60min/R30min，iPLA2蛋白表達(dá)最高(P<0.01)，紅黑二丸甾醇提取物量效依賴地降低了其蛋白表達(dá)，同時(shí)降低H/R時(shí)LDH、MDA、TNF-α的含量，減少凋亡，提高SOD的活性及細(xì)胞的存活率(P<0.05)。結(jié)論：紅黑二丸甾醇提取物能通過iPLA2量效依賴地抗心肌細(xì)胞H/R損傷。

紅黑二丸 甾醇 缺氧復(fù)氧 非鈣依賴磷脂酶A2

心肌缺血再灌注(I/R)損傷是一個(gè)復(fù)雜的多因素參與的病理過程，鈣超載、氧自由基、能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)等均參與了損傷過程[1，2，3]。非鈣依賴磷脂酶A2(iPLA2)水解膜磷脂生成花生四烯酸(AA)和溶血磷脂(LPC)[4]。AA繼而介導(dǎo)下游一系列的炎癥反應(yīng)，LPC則能夠作用離子通道，如L-型鈣通道、RyR2等[5]發(fā)揮效應(yīng)。故本文用缺氧復(fù)氧(H/R)模擬心肌I/R時(shí)，以iPLA2為藥物研究靶點(diǎn)。早期對(duì)I/R損傷的治療主要針對(duì)鈣超載上，單方面治療效果不甚理想，因此需開發(fā)更為有效的藥物。紅黑二丸(RhizomaetHerbaBegoniaeSinensis，RHBS)是中華秋海棠植物的根莖，中華秋海棠為民間中草藥，其味甘苦，具有活血止血、清熱解毒的功效，常用于跌打損傷、痢疾腸炎腹痛等疾患[6]。有關(guān)此藥的研究甚少，目前報(bào)道的藥理功能有：改善微循環(huán)、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌和降血脂[7-9]。本文選取紅黑二丸甾醇提取物，探討其抗心肌H/R損傷的作用及靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及主要儀器 ①材料與試劑：H9C2心肌細(xì)胞株(ATCC，美國)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國)；iPLA2rabbit polyclonal antibody(Abcam，英國)；乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、丙二醛試劑盒(南京建成生物公司，中國)；大鼠TNF-αElisa試劑盒(R&D，美國)；MTT(Amresco，美國)；AnnexinⅤ PE/PI凋亡試劑盒(Biolegend，美國)。②主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)；核酸蛋白測(cè)定儀(BIO-RAD，德國)；垂直電泳儀(BIO-RAD，德國)；多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)；流式細(xì)胞儀(Beckman，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型的制作 組別包括正常組、H/R組、DMSO溶劑組(10-3M)、紅黑二丸甾醇提取物低、中、高劑量組。紅黑二丸甾醇提取物低、中、高劑量分別為：0.11g/kg，0.22g/kg，0.66 g/kg，所需濃度均由10-3M DMSO稀釋。H/R組：即缺氧時(shí)換用缺氧液后置缺氧箱中37℃密閉培養(yǎng)，后換用培養(yǎng)基按常規(guī)培養(yǎng)條件復(fù)氧。實(shí)驗(yàn)過程中，缺氧液、缺氧盒和培養(yǎng)器皿均用氮?dú)獬浞诛柡?，以?qū)逐空氣。正常組：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間與H/R總時(shí)程一致。DMSO溶劑組和藥物組：缺氧液和復(fù)氧液中給予相應(yīng)濃度的藥物，其他條件同H/R組。缺氧液成分：NaCl 8.01g，KCl 0.894g，MgC12·6H2O 0.1g，CaCl20.1g，HEPES 0.953g，Na lactate 2.24mL；加ddH2O至1000mL，調(diào)pH值至6.2。

1.3 紅黑二丸甾醇類物質(zhì)提取 將藥材洗凈晾干，粉碎后過60目篩，以料液比1：24加入萃取溶劑乙酸乙酯進(jìn)行萃取，提取溫度55℃，提取時(shí)間52min，然后將萃取部位超聲處理1h，最后抽濾取清液，并測(cè)定甾醇的含量[7]。

1.4 Western blot檢測(cè)iPLA2[10]心肌細(xì)胞株接種至直徑7cm的培養(yǎng)皿中，待鋪滿皿底，給予相應(yīng)處理后，每皿加100μL裂解液(10mmol/LTris-buffered saline，1mmol/LEDTA，2mmol/Lsodium orthovanadate，0.2 mmol/LPMSF，2μg/mLleupeptin，2μg/mLaprotinin，and 1% Triton X-100)冰上裂解30min，12000r/min、4℃離心收集上清液。BCA法測(cè)蛋白濃度。配制相應(yīng)濃度的SDS-PAGE分離膠，以60V、15min轉(zhuǎn)至100V、1h條件電泳，100V，75min濕轉(zhuǎn)。用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉1h，一抗預(yù)敷，4℃過夜，iPLA2一抗稀釋比為V(iPLA2抗體)：V(TBST)=1∶500。次日，TBST洗膜3次，每次10min，二抗室溫孵育2h，iPLA2二抗稀釋比為V(羊抗兔二抗)：V(TBST)=1∶40000，再洗膜3次，每次10min。滴加V(過氧化物)∶V(Luminol/增強(qiáng)劑)=1∶1的Ecl化學(xué)發(fā)光試劑，暗室曝光。

1.5 LDH、SOD、MDA、TNF-α的測(cè)定 細(xì)胞接種至直徑7cm的培養(yǎng)皿，H/R或相應(yīng)處理后，用PBS清洗干凈，加330μL裂解液破碎細(xì)胞，12000r/min、4℃離心15min收集上清液，SOD上樣30μL，按試劑盒說明操作，MDA上樣135μL，按說明書計(jì)量減半操作。LDH、TNF-α測(cè)定時(shí)，則將細(xì)胞接種在24孔板，取復(fù)氧后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，按ELISA說明檢測(cè)。

1.6 MTT法測(cè)細(xì)胞存活率 將培養(yǎng)至3～5代的細(xì)胞以0.125%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶消化，接種至96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)成1×105/孔，待細(xì)胞融合至70%時(shí)，按上述分6組，等細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，置培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 150μL，室溫避光振蕩15min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，每組取平均值。

1.7 AnnexinⅤ PE/PI測(cè)細(xì)胞早晚期凋亡 細(xì)胞以一定密度接種至6孔板，48h鋪滿皿底后，按上述分組進(jìn)行造?；蛘呓o藥處理后，每孔加1mL胰酶消化，離心后去上清，加PBS洗凈再離心去上清，加100μL AnnexinⅤ Binding Buffer重懸，轉(zhuǎn)移至5mL的EP管。加5μL AnnexinⅤPE，10μL PI，輕輕混勻，室溫(25℃)避光孵育15min，每管加400μL AnnexinⅤ Binding Buffer，混勻，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 不同H/R時(shí)間iPLA2蛋白的表達(dá) 隨著缺氧時(shí)間增加，iPLA2蛋白逐漸增加，至H60min/R30min時(shí)，其表達(dá)最高(P<0.01)，后逐漸降低至正常。見圖1。

圖1 心肌H/R時(shí)iPLA2蛋白的時(shí)效關(guān)系(western blot條帶圖和對(duì)應(yīng)的灰度比)(n=6)

注：與正常組比*P<0.05，**P<0.01。

2.2 紅黑二丸甾醇提取物對(duì)H/R損傷的影響 心肌細(xì)胞H60min/R30min時(shí)，LDH、MDA、TNF-α顯著性增高，SOD活性及細(xì)胞存活率下降，早期凋亡細(xì)胞增多(P<0.01)，低中高濃度的紅黑二丸甾醇提取物干預(yù)后，量效依賴地降低了LDH、MDA、TNF-α的表達(dá)，提高了SOD的活性，提高細(xì)胞存活率，減少早期凋亡的產(chǎn)生(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。

表1 紅黑二丸甾醇提取物對(duì)LDH、SOD、MDA、TNF-α的影響(n=6)

注：與H60min/R30min組比較，*P<0.05；與正常組比較，**P<0.01。

圖2 紅黑二丸甾醇提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響(n=6)

圖3 紅黑二丸甾醇提取物對(duì)細(xì)胞早晚期凋亡的影響(n=6)

2.3 紅黑二丸甾醇提取物對(duì)iPLA2的影響 心肌細(xì)胞H/R時(shí)，iPLA2顯著性增高(P<0.01)，低中高濃度的紅黑二丸甾醇提取物干預(yù)后，量效依賴地降低了iPLA2的表達(dá)(P<0.05)。見圖4。

圖4 紅黑二丸甾醇提取物對(duì)iPLA2蛋白的影響(western blot條帶圖和對(duì)應(yīng)的灰度比)(n=6)

注：與H60min/R30min組比較，*P<0.05；與正常組比較，**P<0.01。

3 討論

心肌缺血再灌注(I/R)損傷是一個(gè)復(fù)雜的多因素參與的病理過程，早期對(duì)I/R損傷的治療主要針對(duì)鈣超載上，單方面治療效果不甚理想，因此，需開發(fā)更為有效的藥物。天然藥物作為重要的藥物資源越來越受到重視。本文選擇紅黑二丸甾醇為研究對(duì)象，旨在開發(fā)更為有效的抗I/R損傷的藥物。用心肌細(xì)胞H9C2H/R模擬心肌I/R損傷，檢測(cè)紅黑二丸對(duì)LDH、SOD、MDA、TNF-α、細(xì)胞存活率及凋亡的影響。結(jié)果表明：紅黑二丸甾醇提取物量效依賴地降低了H/R時(shí)LDH、MDA、TNF-α的含量，提高SOD的活性，提高細(xì)胞存活率并減少凋亡發(fā)生。提示紅黑二丸甾醇能保護(hù)心肌細(xì)胞抗H/R損傷。

心肌缺血時(shí)，心肌肌膜的破損導(dǎo)致細(xì)胞功能錯(cuò)亂，會(huì)進(jìn)一步加重?fù)p傷的發(fā)生，而iPLA2在磷脂的維持和修復(fù)程度上發(fā)揮關(guān)鍵作用[11～13]；同時(shí)，炎癥反應(yīng)也是心肌缺血的一個(gè)重要病理機(jī)制，iPLA2水解膜磷脂產(chǎn)生的AA是最重要的的炎癥因子，AA會(huì)激發(fā)下游一系列炎癥通路放大炎癥效應(yīng)，已有文獻(xiàn)報(bào)道iPLA2參與了心肌I/R損傷。所以結(jié)合紅黑二丸的抗炎作用，本文選擇iPLA2作為其靶點(diǎn)(復(fù)氧時(shí)間固定為30min短時(shí)間，是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間復(fù)氧，凋亡加重，caspase-3會(huì)酶切iPLA2[14])，觀察紅黑二丸能否抑制其表達(dá)，結(jié)果表明：紅黑二丸甾醇提取物量效依賴地降低了iPLA2蛋白的表達(dá)，提示iPLA2可能是紅黑二丸抗H/R損傷的作用靶點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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國家自然科學(xué)基金(NO.81360654)

姚勇，男，副主任醫(yī)師，主要從事疼痛介入研究。

▲通訊作者 萬星，E-mail：504810759@qq.com

1.湖北省恩施州中心醫(yī)院(445000)；2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(445000)