缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力

方波，李曉倩，張穎，馬虹

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力

方波*，李曉倩，張穎，馬虹

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

目的探討缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone narrow stromal cells，BMSCs）存活、增殖和遷移能力的影響。方法體外分離培養(yǎng)BMSCs，予以傳代。正常脊髓勻漿培養(yǎng)液組（Normal組）：將BMSCs置于正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)；缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液組（IR組）：將BMSCs置于缺血再灌注損傷大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)；缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液組（IPC組）：將BMSCs置于缺血預(yù)處理后缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀檢測各組BMSCs凋亡率，MTT法檢測BMSCs增殖，Transwell小室檢測BMSCs遷移能力。結(jié)果與Normal組比較，IR組的BMSCs凋亡率增高，增殖能力下降，遷移能力下降；與IR組比較，IPC組的BMSCs凋亡率降低，增殖能力和遷移能力增強(qiáng)。結(jié)論缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力。

缺血預(yù)處理；骨髓基質(zhì)細(xì)胞；缺血再灌注損傷；脊髓；細(xì)胞存活；遷移

脊髓缺血再灌注損傷是胸腹主動脈瘤手術(shù)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可引起截癱，隨著大血管外科的不斷進(jìn)步，通過改進(jìn)手術(shù)以及相關(guān)輔助技術(shù)來提高脊髓保護(hù)效果的空間越來越小，即使是微創(chuàng)的胸主動脈腔內(nèi)修復(fù)術(shù)，截癱率仍高達(dá)3.7%［1］。細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是目前國際研究的熱點(diǎn)。其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）具有容易獲得、體外增殖速度快、耐受免疫反應(yīng)、移植后不易形成腫瘤及可進(jìn)行基因修飾后移植等優(yōu)越性［2］，是細(xì)胞和基因治療的理想種子，在脊髓損傷修復(fù)中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而在缺血再灌注損傷的情況下，無論是內(nèi)源性干細(xì)胞還是移植的外源性干細(xì)胞，都會面臨缺血缺氧的威脅，大部分干細(xì)胞在移植后死亡［3，4］，嚴(yán)重地限制其修復(fù)作用。如何增強(qiáng)干細(xì)胞的生存率是關(guān)鍵問題。在過去的十年中，學(xué)者們進(jìn)行了大量的努力，探討各種體外預(yù)處理提高移植細(xì)胞存活的策略，包括藥物預(yù)處理、細(xì)胞因子預(yù)處理和低氧預(yù)處理［5-8］等。但是上述預(yù)處理骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法都是基于在移植前增強(qiáng)干細(xì)胞耐受缺氧的能力，這需要額外的體外干預(yù)過程，操作復(fù)雜，延誤治療時機(jī)，而且干預(yù)的效果具有很大的不確定性，應(yīng)用于臨床將受到明顯的限制。缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC）是指在缺血損傷前對器官組織實(shí)施短暫的缺血，非但不會加重?fù)p傷，反而增強(qiáng)器官組織對缺血的耐受性，改善受損器官的微環(huán)境，理論上可能會更有利于移植干細(xì)胞的存活。既往研究干細(xì)胞存活的體外實(shí)驗(yàn)是通過低氧或氧糖剝奪模擬移植后的缺血缺氧環(huán)境，存在局限性。本研究制備大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液，培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，將更真實(shí)地模擬骨髓基質(zhì)細(xì)胞在缺血再灌注損傷和缺血預(yù)處理脊髓組織微環(huán)境下的生物學(xué)特性，進(jìn)而觀察缺血預(yù)處理對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力的影響。

材料和方法

1 材料

健康SD大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心），3周齡，雌雄不限。DMEM／F12培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Sigma），倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO）。

2 大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)

取3周齡雄性SD大鼠，頸椎脫臼脫頸處死后置于75%乙醇中浸泡10min。無菌超凈臺內(nèi)完整分離股骨、脛骨，剔凈軟組織，剪去骨骺端，以無菌的DMEM／F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，沖出骨髓并轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打成全骨髓細(xì)胞懸液，離心棄去上清，DMEM／F12培養(yǎng)液重懸，接種至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基含DMEM／F12和20%胎牛血清，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。根據(jù)貼壁生長的特點(diǎn)獲取BMSCs。72h后首次換液，用PBS清洗，除去未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%以上融合后傳代，傳3代純化細(xì)胞。

3 脊髓缺血再灌注損傷模型的建立

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg／kg）麻醉，經(jīng)氣管切開處行氣管內(nèi)插管機(jī)械通氣。直腸內(nèi)置入溫度傳感器，持續(xù)監(jiān)測體溫，應(yīng)用電熱毯維持核心溫度37.5±0.5℃。脊髓缺血再灌注損傷模型參照文獻(xiàn)［4］制作。左頸總動脈置管測量近端動脈血壓，尾動脈置管測量遠(yuǎn)端血壓。擺右側(cè)臥位，于左前肢和肩胛下角間行橫切口，逐層分離暴露肋骨，于第2、3肋之間暴露胸腔，分離并顯露主動脈弓。皮下注射肝素（200IU／kg），于左頸總動脈和左鎖骨下動脈之間夾閉主動脈，阻斷14min后開放動脈夾，造成脊髓缺血再灌注損傷。關(guān)胸，逐層縫合。術(shù)后將動物放置28℃的保溫箱內(nèi)，等待動物蘇醒后回籠飼養(yǎng)。

4 脊髓缺血預(yù)處理

在脊髓缺血再灌注損傷前先短暫阻斷主動脈3min，恢復(fù)灌注10min實(shí)施缺血預(yù)處理，之后阻斷主動脈造成脊髓缺血再灌注損傷。

5 脊髓組織勻漿制備和細(xì)胞培養(yǎng)

取大鼠正常脊髓組織、缺血再灌注損傷脊髓組織和缺血預(yù)處理脊髓組織，分別按脊髓濕質(zhì)量0.1g加1 mL DMEM／F12培養(yǎng)基的比例冰上研磨制備脊髓組織勻漿，模擬病理微環(huán)境，-20℃?zhèn)溆?。取傳代純化后的BMSCs分為3組：①正常脊髓勻漿培養(yǎng)液組（Normal組）：BMSCs置于正常脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)；②缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液組（IR組）：BMSCs置于缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)；③缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液組（IPC組）：BMSCs置于缺血預(yù)處理后缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測。

6 Annexin V-FITC-PI法流式細(xì)胞儀檢測BMSCs凋亡率

收集BMSCs，用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入5μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15min，加入10μl propidium iodide（PI）染色液于2～8℃避光條件下孵育5min。1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Annexin V（+）PI（-）判斷為凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值。

7 M TT法檢測BMSCs增殖

收集BMSCs，接種于96孔板，每孔加入20μl MTT（5mg／ml）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，再加入DMSO 150μl，于搖床上緩慢振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測490nm波長處各孔吸光度（OD）值。

8 Transwell小室檢測BMSCs遷移

將具有8μm孔道的transwell小室用于檢測BMSCs的體外遷移。收集BMSCs，用含2%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／ml。在各上室分別加入200μl細(xì)胞懸液，保證每個小室內(nèi)細(xì)胞為2×104個細(xì)胞。預(yù)先在下室加入600μl含2%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基，其中分別含不同上清液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，將transwell膜上測未遷移的細(xì)胞用棉簽小心擦去，經(jīng)4%多聚甲醛固定15min，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min，在倒置顯微鏡下觀察膜下遷移細(xì)胞。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，隨機(jī)計(jì)數(shù)每個小室5個高倍視野下（200倍）遷移細(xì)胞數(shù)。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)BMSCs的存活能力

Annexin V-FITC-PI法流式細(xì)胞儀檢測顯示，與應(yīng)用正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（Normal組）比較，應(yīng)用缺血大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（IR組）凋亡率顯著增高，而應(yīng)用缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（IPC組）凋亡率雖高于Normal組，但明顯低于IR組（圖1）

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對BMSCs凋亡率的影響。A，Normal組；B，IR組；C，IPC組；D，凋亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Normal組比較，*，0.01＜P＜0.05，**，P＜0.01；與IR組比較，＃，0.01＜P＜0.05Fig.1 Flow cytometrymeasurementof the effectof IPC rat spinal cord homogenatemedium on the apoptosis of BMSCs.A，Normal group；B，IR group；C，IPC group；D，quantitative statistical analysis of the apoptotic rates.*，0.01＜P＜0.05，**，P＜0.01，compared with Normal group；＃，0.01＜P＜0.05，compared with IR group

2 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)BMSCs的增殖能力

MTT法檢測增殖能力結(jié)果顯示，與應(yīng)用正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（Normal組）比較，應(yīng)用缺血大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（IR組）增殖能力顯著下降，而應(yīng)用缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（IPC組）增殖能力雖低于Normal組，但明顯高于IR組（圖2）

圖2 MTT法檢測缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對BMSCs增殖的影響。與Normal組比較，*，0.01＜P＜0.05；與IR組比較，＃，0.01＜P＜0.05Fig.2 MTT detection of the effect of IPC rat spinal cord homogenate medium on the proliferation of BMSCs.*，0.01＜P＜0.05，compared with Normal group；＃，0.01＜P＜0.05，compared with IR group

3 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)BMSCs的遷移能力

Transwell小室檢測檢測遷移能力結(jié)果顯示，與應(yīng)用正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（Normal組）比較，應(yīng)用缺血大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（IR組）遷移能力顯著下降，而應(yīng)用缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs（IPC組）遷移能力雖低于Normal組，但明顯高于IR組（圖3）

圖3 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對BMSCs遷移影響的Transwell小室檢測。A，Normal組；B，IR組；C，IPC組；D，統(tǒng)計(jì)定量分析。與Normal組比較，*，0.01＜P＜0.05；與IR組比較，＃，0.01＜P＜0.05；比例尺，100μmFig.3 Transwell detection of the effectof IPC rat spinal cord homogenatemedium on themigration of BMSCs.A，Normal group；B，IR group；C，IPC group；D，quantitative statistical analysis.*，0.01＜P＜0.05，compared with Normal group；＃，0.01＜P＜0.05，compared with IR group；scale bar，100μm

討 論

干細(xì)胞移植后死亡一直是阻礙干細(xì)胞應(yīng)用的關(guān)鍵問題。既往提高移植細(xì)胞存活的策略多集中在體外預(yù)處理移植細(xì)胞，如低氧預(yù)處理增強(qiáng)干細(xì)胞的生存能力［9，10］。換個角度思考，直接預(yù)處理受損組織，改善干細(xì)胞移植的微環(huán)境，使之更有利于干細(xì)胞的存活等生物學(xué)特性，無疑更適合臨床應(yīng)用。缺血預(yù)處理可顯著減輕缺血灌注引起的組織損傷，增強(qiáng)組織對缺血的耐受性，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。既往研究證實(shí)脊髓缺血預(yù)處理能夠有效保護(hù)缺血再灌注脊髓［11，12］。本研究制備大鼠缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液，培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，觀察缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力的影響，為缺血預(yù)處理增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療脊髓缺血再灌注損傷的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞在缺血再灌注損傷脊髓組織勻漿的病理微環(huán)境中培養(yǎng)，凋亡增加，增殖能力和遷移能力降低，而置入缺血預(yù)處理的脊髓組織勻漿中培養(yǎng)，存活、增殖和遷移能力得到明顯改善，證實(shí)缺血預(yù)處理的脊髓微環(huán)境更有利于骨髓基質(zhì)細(xì)胞生存，同時增強(qiáng)了增殖和遷移能力。

胸腹主動脈瘤等大血管手術(shù)需要阻斷主動脈，引起耐受缺血缺氧能力差的脊髓發(fā)生缺血再灌注損傷。在真正持續(xù)阻斷主動脈前，先短暫夾閉主動脈幾分鐘后開放主動脈恢復(fù)灌注，就可簡單地完成脊髓缺血預(yù)處理，操作過程與胸腹主動脈瘤手術(shù)操作完全接軌，是一種非常有前途的脊髓保護(hù)手段。最近研究［13］表明在心肌缺血模型中缺血預(yù)處理能夠增加早期內(nèi)源性造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞特異性的動員和招募，向缺血心肌組織內(nèi)的移行；而且移行的細(xì)胞數(shù)量與保護(hù)效果成正比。

綜上所述，骨髓基質(zhì)細(xì)胞在大鼠缺血再灌注損傷脊髓組織勻漿中凋亡增加，增殖和遷移能力降低，而缺血預(yù)處理的脊髓勻漿培養(yǎng)液能增強(qiáng)移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞的存活、增殖和遷移能力，這將為臨床應(yīng)用缺血預(yù)處理增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用提供依據(jù)。

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Ischem ic preconditioning rat spinal cord homogenatemedium enhances the viability,proliferation and m igration of bonemarrow stromal cells

Fang Bo*，Li Xiaoqian，Zhang Ying，Ma Hong
（Department of Anesthesiology，the First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China）

Ob jective To investigate the effect of ischemic preconditioning（IPC）rat spinal cord homogenatemedium on the viability，proliferation and migration of bonemarrow stromal cells（BMSCs）.M ethodsBMSCs were isolated and subcultured in vitro. Three groups ofmedia were then prepared for the BMSC passage：normal rat spinal cord homogenatemedium（Normal group），ischemia-reperfusion injured rat spinal cord homogenatemedium（IR group），and ischemia-reperfusion injured rat spinal cord homogenatemedium（IPC group）.The apoptotic rate of BMSCswas detected by flow cytometry，the proliferation by MTT and themigration by Transwell chamber assay.ResultsCompared with the Normal group，the apoptotic rate of BMSCs increased，while the proliferation andmigration decreased in the IR group.Compared with the IR group，the apoptotic rate decreased，while the proliferation andmigration increased in the IPC group.ConclusionIPC rat spinal cord homogenatemedium enhances the survival，proliferation and migration of BMSCs.

Ischemic preconditioning，bonemarrow stromal cells，ischemia-reperfusion injury；spinal cord；cell viability；migration

R744

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.06.006

2016-10-09

2016-12-14

國家自然科學(xué)基金（81401000）；遼寧省博士科研啟動基金項(xiàng)目（20141035）；遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（LK201636）

男（1979年），漢族，副教授

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：drumk0630＠126.com