超高效液相色譜法測定青藤散中青藤堿含量

王銳　李陳雪　胡月　郭玉巖　李永吉

摘要：目的 建立超高效液相色譜法（UPLC）測定青藤散中青藤堿含量的方法。方法 采用UPLC，色譜柱為ACQUITY UPLC HSS C18（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m），流動相為乙腈-水-乙二胺（50∶50∶0.25），流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為2 ?L，于檢測波長283 nm處對青藤堿進(jìn)行含量測定。結(jié)果 出峰時(shí)間在1 min左右，青藤堿在34.2～2188.0 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)論 本研究所建立的方法簡便快速、穩(wěn)定可靠，可用于青藤散中青藤堿的含量測定。

關(guān)鍵詞：青藤散；青藤堿；超高效液相色譜法；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.024

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）03-0089-03

Abstract： Objective To establish an UPLC method for the determination of sinomenine in Sinomenine External Applied Powder. Methods The UPLC method was carried out on a C18 column by using acetonitrile-water-ethylene diamine （50：50：0.25） as mobile phase. The flow rate was 0.2 mL/min； the sample quantity was 2 ?L； the detection wavelength was 283 nm. Results The peak time was within 1 min or so. The calibration curve of sinomenine was in the linear range of 34.2–2188.0 ng. Conclusion The method is simple， rapid， stable and reliable， which can be used for the determination of sinomenine in Sinomenine External Applied Powder.

Key words： Sinomenine External Applied Powder； sinomenine； UPLC； content determination

青藤散是以青風(fēng)藤提取物青藤堿（sinomenine）為原料，以糊精等為輔料制備的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的外用經(jīng)皮給藥制劑。青藤堿是青風(fēng)藤抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕作用的主要有效成分[1]。目前，青藤堿的含量測定大多采用高效液相色譜法（HPLC），流動相主要為甲醇-水，出峰時(shí)間在10 min左右，這就使進(jìn)樣周期延長，有可能出現(xiàn)樣品穩(wěn)定性存在差異等問題[2]。超高效液相色譜法（UPLC）的速度、靈敏度、分離度分別是HPLC的9、3、1.7倍，縮短了分析時(shí)間，同時(shí)減少了溶劑用量，降低了分析成本[3]。本試驗(yàn)采用UPLC建立青藤散的質(zhì)量控制方法，為青藤堿相關(guān)的制劑研發(fā)、質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class超高液相系統(tǒng)，（上海）Waters 公司，包括四元泵、TUV可變波長紫外檢測器、Empower色譜工作站；AB265-S型分析天平，瑞士梅特勒，拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司。

青藤散，課題組自制，批號20140310、20140311、20140312；青藤堿對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號110774-200206；青藤堿原料藥（純度≥98%），成都曼斯特生物科技有限公司，批號12101704；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙二胺，天津市啟邦化工產(chǎn)品銷售有限公司；水為屈臣氏蒸餾水；甲醇，西隴化工股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取青藤堿對照品約34.20 mg，精密稱定，加甲醇溶解，并定容至25 mL容量瓶中，作為對照品溶液，質(zhì)量濃度為1.368 mg/mL。

2.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m）；流動相：乙腈-水-乙二胺（50∶50∶0.25）；流速：0.2 mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 ?L。理論板數(shù)按青藤堿計(jì)算應(yīng)不少于2000。取“2.1”項(xiàng)下對照品溶液2 ?L，注入U(xiǎn)PLC儀，在上述色譜條件下測定，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，青藤堿的出峰時(shí)間在1 min左右，且峰形尖銳良好。

2.3 供試品溶液的制備

取青藤散30 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 mL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液2 ?L，注入U(xiǎn)PLC儀，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測定，色譜圖見圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取青藤堿對照品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成對照品質(zhì)量分別為34.2、136.8、273.6、1094.4、1368.0、2188.0 ng的青藤堿對照品系列溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，分別以峰面積值為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=9452.6X+7639.1（r=0.999 7）。結(jié)果表明，青藤堿對照品質(zhì)量在34.2～2188.0 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取高（1.368 0 mg/mL）、中（0.547 2 mg/mL）、低（0.017 1 mg/mL）3個(gè)濃度的對照品溶液，精密吸取2 μL，注入超高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果高、中、低濃度青藤堿峰面積RSD分別為1.38%、1.02%、0.75%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批的青藤堿原料藥，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，計(jì)算青藤堿峰面積的RSD，結(jié)果RSD=0.94%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試品溶液放置于4 ℃冰箱中，精密量取同一容量瓶中的供試液溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣2 μL進(jìn)行測定，結(jié)果青藤堿峰面積的RSD=1.31%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知量的樣品9份，加入青藤堿對照品溶液0.1、0.3、0.5 mL各3份，按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1，表明本方法回收率較好。

2.9 樣品含量測定

取3批青藤散樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后測定其中青藤堿的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法測定青藤堿的含量[4]。目前所使用的流動相系統(tǒng)大多可分為2大類：其一，采用甲醇-水為流動相，出峰時(shí)間一般在10 min左右[5]，使進(jìn)樣周期延長，試驗(yàn)效率大大降低；其二，采用甲醇-磷酸鹽緩沖液為流動相，除了出峰時(shí)間長以外，緩沖鹽對色譜柱的傷害大，若沖洗不干凈極易堵塞柱子。

本試驗(yàn)選擇更為精密、快速的UPLC進(jìn)行測定，以乙腈-水為流動相進(jìn)行分離。結(jié)果表明，以乙腈-水（50∶50）為流動相時(shí)，保留時(shí)間適宜。今后也可根據(jù)試驗(yàn)的不同要求調(diào)節(jié)流動相比例，以改變保留時(shí)間。

本試驗(yàn)對自制青藤散中的青藤堿進(jìn)行了含量測定，所采用的方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，對青藤堿其他劑型制劑（微乳、脂質(zhì)體等）的質(zhì)量控制也具有指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉強(qiáng)，周莉玲，李銳，等.青藤堿的研究概況[J].中草藥，1997，28（4）：247.

[2] 郭玉巖，李敏，史磊，等.HPLC法測定鹽酸青藤外敷散中鹽酸青藤堿含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（11）：42.

[3] 傅曉燕，黃巧玲.HPLC與UPLC法對比測定兩種川芎藥材中阿魏酸的含量[J].中藥材，2011，34（7）：1070.

[4] 沙振方，孫文基.青風(fēng)藤中青藤堿HPLC法測定[J].中藥材，1989， 12（10）：34.

[5] 潘細(xì)貴，羅順德，張先洲，等.高效液相色譜法測定青藤堿片中青藤堿的含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2001，12（7）：593.

（收稿日期：2015-04-27；編輯：陳靜）