曹小龍，祖 堯，張慶華，賈 亮，李偉明

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)與資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

斑馬魚報(bào)警反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)育階段的研究

曹小龍，祖 堯，張慶華，賈 亮，李偉明

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)與資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

魚類在遭受捕食后，受損的表皮會釋放大量的化學(xué)信號物質(zhì)，同種其它個(gè)體嗅到這些化學(xué)信號后會作出躲避反應(yīng)，稱為報(bào)警反應(yīng)（alarm response），報(bào)警反應(yīng)通常出現(xiàn)在一定的發(fā)育階段。采用斑馬魚（Dinio rerio）同種碾碎提取物（處理組，質(zhì)量濃度為10－6g·L－1）作為報(bào)警物質(zhì)，并設(shè)3個(gè)對照組：羅非魚碾碎提取物組、雙蒸水組、空白對照組，通過暴露處理實(shí)驗(yàn)，檢測沉底累積時(shí)間（time of bottom）、呆滯累積時(shí)間（time of freezing）兩項(xiàng)指標(biāo)，研究了28 dpf（days post fertilization，受精后天數(shù)）、35 dpf、42 dpf 3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期幼魚的報(bào)警反應(yīng)。結(jié)果顯示：28 dpf時(shí)，處理組與3個(gè)對照組相比，在沉底累積時(shí)間、呆滯累積時(shí)間兩項(xiàng)指標(biāo)上均無顯著差異，這個(gè)時(shí)期處理組有2 ind斑馬魚出現(xiàn)“沉底”，其中1 ind出現(xiàn)“呆滯”；35 dpf時(shí)，處理組與3個(gè)對照組相比，在沉底累積時(shí)間上有顯著差異（P＜0.05），在呆滯累積時(shí)間上無顯著差異，這個(gè)時(shí)期有5 ind斑馬魚出現(xiàn)“沉底”，其中1 ind出現(xiàn)“呆滯”；42 dpf時(shí)，處理組與對照組相比，在沉底累積時(shí)間、呆滯累積時(shí)間兩項(xiàng)指標(biāo)均有顯著差異（P＜0.05），這個(gè)時(shí)期有8 ind斑馬魚出現(xiàn)“沉底”，且8 ind全部出現(xiàn)“呆滯”，與此對應(yīng)的是這個(gè)時(shí)期大部分個(gè)體出現(xiàn)明顯的報(bào)警反應(yīng)。研究表明，斑馬魚報(bào)警反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)育階段為35～42 dfp之間，結(jié)合已知的野外斑馬魚生活史，推測斑馬魚在特定的階段產(chǎn)生報(bào)警反應(yīng)可能與棲息地的遷移有關(guān)。

斑馬魚；報(bào)警反應(yīng)；發(fā)育；棲息地

動物界中，當(dāng)個(gè)體受到捕食者襲擊時(shí)，會主動或被動地向同種其它個(gè)體發(fā)出報(bào)警信號，以躲避潛在的危險(xiǎn)［1－5］。生活在水環(huán)境中的魚類，當(dāng)個(gè)體受傷時(shí)，破損的表皮會向周圍的環(huán)境中釋放化學(xué)信號物質(zhì)，引發(fā)同種其它個(gè)體的反捕食行為［6－8］，稱為報(bào)警反應(yīng)（alarm response），引起報(bào)警反應(yīng)的化學(xué)信號物質(zhì)稱為報(bào)警物質(zhì)（alarm substance）。1938年，VON FRISCH［9］最早在真鱥（Phoxinus phoxinus）中觀察到了魚類的報(bào)警反應(yīng)，并對此做了詳盡的描述，由此開啟了魚類報(bào)警行為研究的先河［9－11］。半個(gè)多世紀(jì)以來，魚類的報(bào)警反應(yīng)研究取得了長足的發(fā)展，涉及到的相關(guān)領(lǐng)域包括行為學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、心理學(xué)、生物化學(xué)等。然而，關(guān)于魚類報(bào)警反應(yīng)產(chǎn)生的時(shí)期卻鮮有報(bào)道。

生命個(gè)體在生活史的早期階段，自我保護(hù)能力較弱，容易受到捕食者的襲擊，因此從自然選擇壓力來講，報(bào)警反應(yīng)應(yīng)該越早出現(xiàn)越好。然而，令人困惑的是，事實(shí)并非如此。已有研究表明，魚類只有到了特定的發(fā)育階段才出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)。例如，真鱥在受精后50 d左右才出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)［11］；斑馬魚（Danio rerio）可能在孵化后32～52 d才出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)［12－13］。這些研究初步界定了報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間，然而，并沒有針對報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)的特定行為（包括沉底、快速游動、呆滯等）進(jìn)行定量分析。此外，前期研究中，實(shí)驗(yàn)用的斑馬魚飼養(yǎng)條件各異，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。近年來，斑馬魚作為模式動物在行為神經(jīng)科學(xué)及行為遺傳學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，另外斑馬魚高度集中化養(yǎng)殖體系得到了進(jìn)一步發(fā)展，形成了相對統(tǒng)一的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。在這樣的背景下，有必要進(jìn)行特征性行為的定量分析從而對斑馬魚報(bào)警反應(yīng)產(chǎn)生時(shí)間做進(jìn)一步的研究。本文通過報(bào)警物質(zhì)暴露處理實(shí)驗(yàn)，比較檢測了28 dpf（days post fertilization，受精后天數(shù)）、35 dpf、42 dpf 3個(gè)不同時(shí)期的斑馬魚幼魚的沉底累積時(shí)間、呆滯累積時(shí)間兩項(xiàng)報(bào)警反應(yīng)指標(biāo)，界定了在目前實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件下的報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間，以期為該研究領(lǐng)域提供基礎(chǔ)資料，并為進(jìn)一步深入研究報(bào)警反應(yīng)的機(jī)制提供有效模式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

AB品系的野生型斑馬魚購自國家斑馬魚模式動物中心（中國上海），在本實(shí)驗(yàn)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中傳代馴化。孵化斑馬魚出膜后轉(zhuǎn)移到3 L魚缸中，每天早晚2次（9∶00，18∶00）喂食草履蟲（Paramecium），3周后，將幼魚轉(zhuǎn)移到循環(huán)系統(tǒng)中喂養(yǎng)，魚缸容積3 L，實(shí)驗(yàn)魚總計(jì)40 ind，每天2次（9∶00，18∶00）喂食初孵鹵蟲（Artemia salina）。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)：光照條件為L∶D＝14 h∶10 h；養(yǎng)殖用水由自來水經(jīng)系統(tǒng)自帶的凈化設(shè)備處理后進(jìn)入養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫（27±1）℃，鹽度4，pH值為7.0±0.5，24 h曝氣。實(shí)驗(yàn)前24 h及實(shí)驗(yàn)過程中停止喂食。

1.2 報(bào)警物質(zhì)制備

本實(shí)驗(yàn)中，報(bào)警物質(zhì)制備參考WALDMAN的制備方法［13］，采取整魚碾碎，具體流程如下：取2 ind健康斑馬魚（♀♂各1 ind），置于冰上麻醉，隨后將其轉(zhuǎn)移至2 mL離心管。用全自動組織勻漿機(jī)（MP Biomedicals，F(xiàn)astprep－24）將斑馬魚均勻打碎30 s，以漿液均勻無顆粒為準(zhǔn)。高速離心機(jī)（Eppendorf，5424R）4℃、12 000 r·s－1離心10 min，取上清液，按1 g體質(zhì)量稀釋至1 L的標(biāo)準(zhǔn)稀釋，以此作為原液。實(shí)驗(yàn)前制備新鮮報(bào)警物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)過程中，將離心管置于冰盒中，可以有效減少報(bào)警物質(zhì)效力的損失。同樣取2 ind健康羅非魚（Oreochromisspp.）（與斑馬魚等重）作為異種對照，按上述流程制備報(bào)警物質(zhì)。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：30 dpf時(shí)，斑馬魚無報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)；40 dpf時(shí)，普遍出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)，因此將報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間初步界定在30～40 dpf之間。

正式實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)共檢測28 dpf、35 dpf、42 dpf 3個(gè)發(fā)育時(shí)期的斑馬魚（來源于同一親本），每個(gè)時(shí)期均設(shè)同種碾碎物提取物處理組，即Conspecific組和3個(gè)對照組：Heterospecific組（羅非魚碾碎提取物）、Water組（雙蒸水）、Blank組（空白對照），共計(jì)4組，每組10 ind斑馬魚。報(bào)警物質(zhì)暴露處理時(shí)將原液按1∶1 000加入檢測缸。

檢測缸長12 cm、寬4 cm、高8 cm（28～42 dpf的幼魚個(gè)體小且游泳速率較慢，因此采用該規(guī)格小缸進(jìn)行檢測）。報(bào)警物質(zhì)暴露處理時(shí)，采取單尾檢測（每個(gè)檢測缸中1 ind斑馬魚）。

實(shí)驗(yàn)前將待檢測斑馬魚轉(zhuǎn)移至檢測缸，適應(yīng)20 min。實(shí)驗(yàn)中采用攝像機(jī)（SONY，HDRPJ390）拍攝視頻記錄：Water組、Heterospecific組及Conspecific組在報(bào)警物質(zhì)暴露處理后拍攝3 min，同時(shí)對Blank組拍攝3 min。

1.4 運(yùn)動軌跡分析

斑馬魚的報(bào)警反應(yīng)是一個(gè)較為復(fù)雜的行為過程，其中沉底和呆滯行為是報(bào)警反應(yīng)的2個(gè)典型特征，本實(shí)驗(yàn)采用SPEEDIE等［14］的行為定量方法，用以下兩項(xiàng)指標(biāo)來表征斑馬魚報(bào)警行為響應(yīng)：（1）缸底累積時(shí)間（time of bottom）；（2）呆滯累積時(shí)間（time of freezing）。以水面高度為準(zhǔn)，將魚缸垂直方向分為頂部、中部、底部3部分（等分），其中底部視為缸底。呆滯界定為：魚體靜止不動，只有眼動和鰓動。用小型動物行為活動軌跡記錄分析系統(tǒng)Ethovision XT 10.1（Noldus，Wageningen，The Netherlands）進(jìn)行視頻信息采集，得到相應(yīng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上采集到的運(yùn)動軌跡數(shù)據(jù)，采用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)分析軟件，在0.05的置信水平對兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法檢驗(yàn)。文章中所有圖形均使用Graphpad 5.0軟件繪制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果與分析

在28 dpf，Conspecific組與其余3組之間在缸底累積時(shí)間和呆滯累積時(shí)間兩項(xiàng)指標(biāo)上，均無顯著性差異（圖1），這個(gè)時(shí)期有2 ind斑馬魚出現(xiàn)“沉底”，其中1 ind出現(xiàn)“呆滯”（圖2）；在35 dpf，Conspecific組與其余3組之間在沉底累積時(shí)間上，有顯著性差異（P＜0.05）（圖3），這個(gè)時(shí)期有5 ind斑馬魚出現(xiàn)“沉底”，其中1 ind出現(xiàn)“呆滯”（圖4）；在42 dpf，Conspecific組與其余3組之間在缸底累積時(shí)間、呆滯累積時(shí)間上，均有顯著性差異（P＜0.05）（圖5），這個(gè)時(shí)期有8 ind斑馬魚出現(xiàn)“沉底”，且8 ind全部出現(xiàn)“呆滯”（圖6）。

圖1 受精后28 d實(shí)驗(yàn)斑馬魚的行為反應(yīng)Fig.1 Behavioral response of 28 dpf Danio rerio

圖2 受精后28 d實(shí)驗(yàn)斑馬魚（熱區(qū)圖）Fig.2 28 dpf Danio rerio（Heatmap）

圖3 受精后35 d實(shí)驗(yàn)斑馬魚的行為反應(yīng)Fig.3 Behavioral response of 35 dp f Danio rerio

圖4 受精后35 d實(shí)驗(yàn)斑馬魚（熱區(qū)圖）Fig.4 35 dpf Danio rerio（Heatmap）

圖5 受精后42 d實(shí)驗(yàn)斑馬魚的行為反應(yīng)Fig.5 Behavioral response of 42 dpf Danio rerio

圖6 受精后42 d實(shí)驗(yàn)斑馬魚（熱區(qū)圖）Fig.6 42 dpf Danio rerio（Heatmap）

3 討論

從結(jié)果分析來看，隨著發(fā)育時(shí)期的推移，Conspecific組中出現(xiàn)“沉底”和“呆滯”的個(gè)體數(shù)量呈現(xiàn)出遞增趨勢，即表明出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)的個(gè)體數(shù)量增加；而對照組則沒有明顯變化。通常對于一個(gè)典型的報(bào)警反應(yīng)可以作如下描述：受試個(gè)體出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)，首先表現(xiàn)為快速潛入缸底，隨后在缸底沿著水平方向進(jìn)行快速的往復(fù)游動，這個(gè)過程通常會持續(xù)十幾秒到幾十秒不等，常見的在15～30 s之間，之后一些個(gè)體會進(jìn)入“呆滯”狀態(tài)，這個(gè)過程持續(xù)數(shù)秒到數(shù)分鐘不等，少數(shù)個(gè)體甚至持續(xù)數(shù)小時(shí)。而未進(jìn)入“呆滯”狀態(tài)的個(gè)體則在隨后的數(shù)分鐘內(nèi)逐漸恢復(fù)常態(tài)。值得注意的是，在35 dpf時(shí)，Conspecific組與3個(gè)對照組相比在“沉底累積時(shí)間”上有顯著性差異（P＜0.05），而在“呆滯累積時(shí)間”這項(xiàng)指標(biāo)上沒有顯著性差異，5 ind出現(xiàn)“沉底”的個(gè)體中，僅有1 ind出現(xiàn)“呆滯”。推測在報(bào)警反應(yīng)過程中“沉底”可能是必然的過程，而“呆滯”則是可能發(fā)生的情況。長期以來報(bào)警反應(yīng)被認(rèn)為是一種恐懼反應(yīng)，筆者認(rèn)為“沉底”發(fā)生在報(bào)警反應(yīng)的開始階段，是一種本能的避險(xiǎn)行為，而“呆滯”則可能是一種重度恐懼的結(jié)果。在42 dpf時(shí)，Conspecific組中8 ind出現(xiàn)“沉底”的個(gè)體，全部出現(xiàn)“呆滯”狀態(tài)，與42 dpf的個(gè)體相比，35 dpf的個(gè)體沉底后更易恢復(fù)常態(tài)。

魚類的報(bào)警反應(yīng)是先天性行為，并非后天習(xí)得［15－16］。本研究發(fā)現(xiàn)，受精后35～42 d的斑馬魚，在首次接受報(bào)警物質(zhì)（成魚提取物）處理時(shí)即表現(xiàn)出報(bào)警反應(yīng)，包括沉底、快速游動、呆滯等。在對其它魚類的研究中，也有類似現(xiàn)象，即報(bào)警行為均出現(xiàn)在一個(gè)特定的發(fā)育階段。例如，真鱥在受精后50 d開始出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)［11］。在早期研究中，一些學(xué)者在斑馬魚中也做過類似實(shí)驗(yàn)，如PFEIFFER［12］發(fā)現(xiàn)在喂食的同時(shí)給予報(bào)警物質(zhì)刺激會導(dǎo)致孵化后32 d的斑馬魚逃避攝食區(qū)域；WALDMAN［13］發(fā)現(xiàn)在對孵化后48～52 d的斑馬魚給予成魚報(bào)警物質(zhì)刺激后，會導(dǎo)致受試群體在檢測缸中的運(yùn)動分布整體下移。這些研究顯示32～52 d的斑馬魚可能已經(jīng)出現(xiàn)報(bào)警反應(yīng)。然而，以往的研究主要是對行為特征的描述，并沒有針對報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)的特定行為（包括沉底、快速游動、呆滯等）進(jìn)行定量分析。此外，在早期的這些研究中，實(shí)驗(yàn)用的斑馬魚飼養(yǎng)條件各異，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，如WALDMAN［13］的研究中，實(shí)驗(yàn)斑馬魚每天僅喂食一次，導(dǎo)致斑馬魚發(fā)育延遲，這可能是導(dǎo)致報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間較晚的原因，表明報(bào)警反應(yīng)可能跟發(fā)育有關(guān)。

斑馬魚報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)在特定的發(fā)育階段，推測原因可能有2種：一種可能是，到了一定的發(fā)育階段，幼魚行使復(fù)雜行為的能力才得到充分發(fā)展和完善；然而，MCHENEY等［17］的研究表明，受精后5 d的斑馬魚已經(jīng)能夠根據(jù)水流波動判斷捕食者的存在，并作出逃避反應(yīng)；此外，實(shí)驗(yàn)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)20 dpf的斑馬魚當(dāng)移動魚缸時(shí)即可表現(xiàn)出類似報(bào)警反應(yīng)的行為模式。由此說明，可能受精后20 d的斑馬魚實(shí)際上已經(jīng)具備行使復(fù)雜行為的能力。因而，這第一種假設(shè)應(yīng)被排除。另一種可能是，到了一定的發(fā)育階段，識別報(bào)警物質(zhì)的嗅覺受體才表達(dá)，亦或是相關(guān)的神經(jīng)通路才發(fā)展形成。已有研究在一定程度上支持了這一假設(shè)，LINDSAY等［18］發(fā)現(xiàn)，受精后3 d的斑馬魚幼魚在給予氨基酸氣味刺激后即表現(xiàn)出游泳活動增加；對報(bào)警物質(zhì)或一些繁殖相關(guān)的信息素的反應(yīng)則出現(xiàn)在較遲的發(fā)育階段［13，19］。剛孵化的斑馬魚嗅球中神經(jīng)元的數(shù)量只占成年個(gè)體的5%，在此后的數(shù)周，數(shù)量逐漸增多［20］，顯示嗅覺系統(tǒng)的發(fā)展是一個(gè)逐步完善的過程，而這一過程歷經(jīng)數(shù)周，同時(shí)可能伴隨著嗅覺功能的發(fā)展和完善。這一點(diǎn)與本研究結(jié)果基本吻合。此外，已知的野外調(diào)查記錄顯示：在野生條件，斑馬魚棲息地，成年斑馬魚通常出現(xiàn)在植被覆蓋的淺灘區(qū)域，或者是溪流中有懸垂植被遮蔽的區(qū)域。在溪流中，成年斑馬魚不得不遭遇它們的捕食者，如一些鱧屬（Channa）的魚類。幼魚和小魚很少在溪流中出現(xiàn)，它們一般生活在淺灘，這些淺灘區(qū)域水流緩慢，或者形成凹形死角，但與溪流相通。在這些區(qū)域，沒有大型的捕食者出現(xiàn)［21－23］。一個(gè)可能的斑馬魚野外生活史：成年斑馬魚主要在溪流生存，雨季洪澇時(shí)節(jié)（每年4～8月，也是野生斑馬魚的產(chǎn)卵季節(jié)），溪流與淺灘連成一片，成魚游到淺灘區(qū)域產(chǎn)卵，這些卵孵化后，在淺灘生長，30～40 dpf時(shí)，這些小魚開始遷移到溪流中生活（可能是因?yàn)槭澄镄枨笤龃螅?，此時(shí)它們將面臨溪流中的捕食者。綜上推測：到了某個(gè)特定的發(fā)育階段，斑馬魚需要適應(yīng)新的棲息地，而那里生活著它們的捕食者，因而需要發(fā)展出更為有效的以化學(xué)信號為基礎(chǔ)的反捕食行為，以適應(yīng)新的生存環(huán)境（這可以視為外界環(huán)境壓力），而與此對應(yīng)的嗅覺受體的表達(dá)或者說相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的發(fā)展形成，則是環(huán)境壓力下生命個(gè)體自身潛在機(jī)能的發(fā)展完善。此外，早期研究一般都是剝?nèi)◆~皮制備報(bào)警物質(zhì)，本研究則是整魚制備。近年來有研究表明，營養(yǎng)狀況良好的個(gè)體與營養(yǎng)狀況稍差的個(gè)體相比，表皮中包含有更多的報(bào)警物質(zhì)［10］。因而，與魚皮相比，用魚體質(zhì)量來衡量報(bào)警物質(zhì)的相對濃度可能更為精確。

本文通過比較檢測28、35、42 dpf 3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期斑馬魚幼魚的報(bào)警反應(yīng)，首次界定了實(shí)驗(yàn)室高密度養(yǎng)殖體系中斑馬魚報(bào)警反應(yīng)出現(xiàn)的發(fā)育時(shí)期，并結(jié)合已知的野外斑馬魚生活史，推測斑馬魚在特定的發(fā)育階段產(chǎn)生報(bào)警反應(yīng)可能與棲息地遷移有關(guān)。這將有利于我們進(jìn)一步理解自然環(huán)境下，報(bào)警反應(yīng)對個(gè)體生存以及提升種群適合度的重要意義。后續(xù)工作將對報(bào)警物質(zhì)的理化性質(zhì)做進(jìn)一步的研究，并同時(shí)開展報(bào)警物質(zhì)的鑒定工作，報(bào)警物質(zhì)對應(yīng)的嗅覺受體也有待進(jìn)一步的研究。

［1］ MACEDONIA JM，EVANSCS.Essay on contemporary issues in ethology：Variation among mammalian alarm call systems and the problem of meaning in animal signals［J］.Ethology，1993，93（3）：177－197.

［2］ SMITH R J F.Evolution of alarm signals：Role of benefits of retaining group members or territorial neighbors［J］.American Naturalist，1986：604－610.

［3］ SHERMAN PW.Nepotism and the evolution of alarm calls［J］.Science，1977，197（4310）：1246－1253.

［4］ KLUMP G M，Shalter M D.Acoustic behaviour of birds and mammals in the predator context；I.Factors affecting the structure of alarm signals.II.The functional significance and evolution of alarm signals［J］.Zeitschriftfür Tierpsychologie，1984，66（3）：189－226.

［5］ ROTTMAN S J，SNOWDOWN C T.Demonstration and analysis of an alarm pheromone in mice［J］.Journal of Comparative and Physiological Psychology，1972，81（3）：483.

［6］ CHIVERS D P，SMITH R J F.Chemical alarm signalling in aquatic predator-prey systems：A review and prospectus［J］.Ecoscience，1998：338－352.

［7］ JACOBSEN H P，STABELL O B.Antipredator behaviour mediated by chemical cues：The role of conspecific alarm signalling and predator labelling in the avoidance response of a marine gastropod［J］.Oikos，2004，104（1）：43－50.

［8］ HAY M E.Marine chemical ecology：Chemical signals and cues structuremarine populations，communities，and ecosystems［J］.Annual Review of Marine Science，2009（1）：193.

［9］ VON FRISCH K.Zurpsychologie des fisch-schwarmes［J］.Naturwissenschaften，1938，26（37）：601－606.

［10］ VON FRISCH K.über einen Schreckstoff der Fischhaut und seine biologische Bedeutung.Z［J］.Journal of Comparative Physiology，1942，29（1）：46－145.

［11］ SMITH R JF.Alarm signals in fishes［J］.Reviews in Fish Biology and Fisheries，1992，2（1）：33－63.

［12］ PFEIFFERW.The fright reaction in North American fish［J］.Canadian Journal of Zoology，1963，41（1）：69－77.

［13］ WALDMAN B.Quantitative and developmental analyses of the alarm reaction in the zebra danio，Brachydanio rerio［J］.Copeia，1982：1－9.

［14］ SPEEDIE N，GERLAIR.Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish（Danio rerio）［J］.Behavioural Brain Research，2008，188（1）：168－177.

［15］ BASS S L S，GERLAIR.Zebrafish（Danio rerio）responds differentially to stimulus fish：The effects of sympatric and allopatric predators and harmless fish［J］.Behavioural Brain Research，2008，186（1）：107－117.

［16］ BLANCHARD D C，GRIEBEL G，BLANCHARD R J.Conditioning and residual emotionality effects of predator stimuli：Some reflections on stress and emotion［J］.Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry，2003，27（8）：1177－1185.

［17］ MCHENRY M J，F(xiàn)EUTL K E，STROTHER JA，etal.Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator＇s strike［J］.Biology Letters，2009：rsbl.2009.0048.

［18］ LINDSAY SM，VOGTR G.Behavioral responses of newly hatched zebrafish（Danio rerio）to amino acid chemostimulants［J］.Chemical Senses，2004，29（2）：93－100.

［19］ DARROW K O，HARRISW A.Characterization and development of courtship in zebrafish，Danio rerio［J］.Zebrafish，2004，1（1）：40－45.

［20］ MACK-BUCHER J A，LI J，F(xiàn)RIEDRICH R W.Early functional development of interneurons in the zebrafish olfactory bulb［J］.European Journal of Neuroscience，2007，25（2）：460－470.

［21］ SPENCE R，F(xiàn)ATEMA M K，REICHARD M，et al.The distribution and habitat preferences of the zebrafish in Bangladesh［J］.Journal of Fish Biology，2006，69（5）：1435－1448.

［22］ ENGESZER R E，PATTERSON L B，RAO A A，et al.Zebrafish in thewild：A review of natural history and new notes from the field［J］.Zebrafish，2007，4（1）：21－40.

［23］ ARIMACHALAM M，RAJA M，VIJAYAKUMAR C，et al.Natural history of zebrafish（Danio rerio）in India［J］.Zebrafish，2013，10（1）：1－14.

Alarm response at specific developmental stage in zebrafish（Danio rerio）

CAO Xiao-long，ZU Yao，ZHANG Qing-hua，JIA Liang，LIWei-ming
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

For many species the injured skin of fish under attack can release alarm substances that alert conspecifics of the presence of a predator and perform alarm response.The alarm substance is thought to be beneficial for the survival of the receiving individual，and to improve the inclusive fitness of releaser.Previous research showed that the alarm response usually appears in a specific developmental stage.In the present study，we tested behavioral response of zebrafish at three developmental stages（28 dpf，35 dpf and 42 dpf）to extracts of crushed conspecific individuals（10－6g body mass·L－1）.Two indicators were measured：percent of time on bottom（time of bottom）and percentof time at freezing state（time of freezing）.Our results showed that，at28 dpf，the responses of treatment group（extracts of crushed conspecific）did not differ from those of various control groups.In this stage，two individuals displayed“bottom”but only one displayed“freezing”.At 35 dpf，the treatment group showed a higher percentage of time spent on bottom than the control groups（P＜0.05）.At this stage，five individuals displayed“bottom”but only one displayed“freezing”.At 42 dpf，the treatment group showed higher percentages of time spent on both bottom and freezing state than control groups（P＜0.05）.At this stage，eight individuals displayed“bottom”and all of them displayed“freezing”.Themajority of individuals in the treatment group at this time started to show the alarm response.We conclude that zebrafish start to display alarm responses between 35－42 dpf.Considering the context of known wild zebrafish life history，we speculate that zebrafish alarm response appears at specific developmental stage when theymigrate to a different habitat.

zebrafish；alarm response；developmental stage；habitat

S 943

A

1004－2490（2016）03－0304－07

2015－10－23

中美海洋研究中心項(xiàng)目（A1－0209－13－0805）；水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（ZF1206）；上海市科委揚(yáng)帆計(jì)劃（15YF1405000）

曹小龍（1988－），男，碩士研究生，研究方向?yàn)轸~類信息素通訊。E-mail：woin99＠126.com

李偉明，教授。E-mail：liweim＠shou.edu.cn