巫靈鮮 蔣玲 張家會(huì)

彭州市人民醫(yī)院眼耳鼻喉科 四川省彭州市 611930

miRNA對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變新生血管因子的調(diào)控作用研究進(jìn)展

巫靈鮮 蔣玲 張家會(huì)

彭州市人民醫(yī)院眼耳鼻喉科 四川省彭州市 611930

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是致盲的重要原因，新生血管因子在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，對(duì)新生血管因子的作用進(jìn)行調(diào)控，有可能成為治療DR的靶點(diǎn)。微小RNA(miRNAs)是一類(lèi)高度保守、非編碼的小分子RNA，通過(guò)與靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。近年發(fā)現(xiàn)miRNAs與眼內(nèi)新生血管的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文就miRNAs的功能以及未來(lái)作為治療的可能手段的前景作為綜述。

微小RNA；糖尿病性視網(wǎng)膜病變；新生血管因子

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其主要的特征是視網(wǎng)膜微血管功能障礙，最嚴(yán)重的后果是導(dǎo)致失明，它已成為大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家工作年齡人群致盲的首要原因。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者比非糖尿病患者發(fā)生視力損害的危險(xiǎn)性高 25倍, 每年僅在美國(guó)就有1,2000－2,4000例患者因DR而失明。DR的發(fā)病率隨著糖尿病發(fā)病率及病程的增加而增加。據(jù)估計(jì)，美國(guó)40歲以上的成年人高達(dá)40%的人群患有某種類(lèi)型的糖尿病，其中8%的患者因DR引起視覺(jué)損害。由于DR的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其確切有效的治療方法也沒(méi)有最終明確。學(xué)者們普遍認(rèn)為早期有效控制血糖、血壓和血脂是治療DR的關(guān)鍵措施；而激光光凝術(shù)是手術(shù)治療DR、預(yù)防新生血管形成的有效措施，但這一治療措施終究是一種破壞性的治療手段，而且并不能完全有效控制DR造成的視力損害。最近有研究表明miRNAs在血管性疾病、炎癥和新生血管形成等方面也發(fā)揮著重要作用。miRNAs可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，對(duì)其分化、增殖和新生血管形成產(chǎn)生一定的影響，有望成為治療DR的新靶點(diǎn)。

1. miRNAs概述

microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼小RNAs，最初發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性miRNAs是lin-4和lin-7，它參與基因表達(dá)后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，通過(guò)與靶向mRNAs的3' -UTRs（3'端非編碼區(qū)）或編碼區(qū)結(jié)合，通過(guò)在翻譯水平抑制基因表達(dá)或在轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA的方式參與基因調(diào)控與蛋白表達(dá)。miRNAs的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生過(guò)程有關(guān)的基因的表達(dá)。此外miRNAs可以作為觸發(fā)RNA干擾（RNA interference, RNAi）的分子參與細(xì)胞增殖、死亡、凋亡和脂肪代謝。另外，miRNAs還可能與轉(zhuǎn)座的抑制、基因重組有關(guān)，可能參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控，因此認(rèn)為miRNAs可能與高等真核生物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。許多人類(lèi) miRNAs已經(jīng)確定具有進(jìn)化保守性，并且miRNAs靶向作用于人類(lèi)三分之一的基因，隨著對(duì)miRNAs的深入研究，有利于對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理和治病機(jī)理的理解。

2. DR發(fā)病機(jī)制

DR早期的病理改變有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜增厚，周細(xì)胞喪失，毛細(xì)血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能失代償，隨后出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損害，血液成分滲出，毛細(xì)血管閉塞，導(dǎo)致廣泛的視網(wǎng)膜缺血，引起視網(wǎng)膜水腫。早期的病變進(jìn)一步發(fā)展將導(dǎo)致視網(wǎng)膜廣泛缺血缺氧，使視網(wǎng)膜中刺激血管生成的因子和抑制血管生成的因子分泌失衡，引起視網(wǎng)膜新生血管形成，從而發(fā)展成為晚期的增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR)。新生血管形成是造成PDR患者視力損害和玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫落、新生血管性青光眼等眼部并發(fā)癥的主要原因。關(guān)于DR的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，學(xué)者們認(rèn)為除了蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的堆積、蛋白激酶C激活、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、細(xì)胞因子的作用、腎素-血管緊張素及內(nèi)皮系統(tǒng)的異常等對(duì) DR的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要作用以外，糖尿病病程及其血糖控制情況亦是視網(wǎng)膜病變發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。然而，許多臨床觀察顯示：有些患者即使代謝控制良好也不能完全預(yù)防其發(fā)生，有些患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)卻不發(fā)生視網(wǎng)膜病變；有些患者在糖尿病早期就出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變，而有些患者糖尿病病程長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年卻不發(fā)生視網(wǎng)膜病變，這就表明遺傳因素在DR的發(fā)生、發(fā)展中起了關(guān)鍵性作用。因此，對(duì)DR的易感基因進(jìn)行干擾，有可能為DR的治療提供一種新的思路。

3.miRNAs對(duì)新生血管因子的調(diào)控作用

3.1 miRNAs對(duì)VEGF/VEGFR基因的表達(dá)調(diào)控

VEGF是一種有效的血管生成因子，通過(guò)與其特異性的受體VEGFR結(jié)合而發(fā)揮作用，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、移行、增殖和管腔形成，對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞也有促增殖作用，并可增加血管滲透性。VEGF廣泛分布于人和動(dòng)物體內(nèi)的腦、腎、肝、眼等多種組織。正常情況下，視網(wǎng)膜周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)存在較低水平的VEGF，這對(duì)維持眼部血管的完整性是必要的，然而VEGF的過(guò)度表達(dá)將促進(jìn)血管的增殖。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，在DR個(gè)體眼內(nèi)特別是視網(wǎng)膜局部存在高水平的VEGF，隨著DR病程的延長(zhǎng)，其表達(dá)量有逐漸增加的趨勢(shì)，其表達(dá)范圍也明顯擴(kuò)大。VEGF是促進(jìn)DR新生血管形成的重要因子之一，其作為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的促有絲分裂素與表面相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，造成內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，最終形成新生血管。此外，VEGF/VEGFR基因亦是DR的易感基因，用于編碼VEGF、VEGFR，如對(duì)該易感基因進(jìn)行調(diào)節(jié)將有助于為DR的防治提供新的策略。

近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)miRNAs調(diào)節(jié)VEGF/VEGFR基因的功能已經(jīng)進(jìn)行了初步研究。低氧是誘導(dǎo)新生血管形成的重要刺激因素之一。在低氧狀態(tài)下，血管生成因子如VEGF等表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成。Hua等發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下，多種miRNAs都可以直接調(diào)控VEGF的表達(dá)，它們通過(guò)協(xié)同和競(jìng)爭(zhēng)的方式共同作用于 VEGF基因。隨后，F(xiàn)ish等發(fā)現(xiàn)miR-126可以調(diào)節(jié)VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管完整性、新生血管形成和創(chuàng)傷修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。Wang等發(fā)現(xiàn)敲除大鼠miR-126基因后，由于血管完整性受損和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、新生血管形成等功能障礙，從而引起血管通透性增加，出血，甚至造成一部分胚胎死亡。miR-126先天缺失所導(dǎo)致的血管的病理改變和抑制血管生成因子如：VEGF和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等所導(dǎo)致的病理改變是一樣的，由此可見(jiàn) miR-126可以通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)的 Spred-1（細(xì)胞內(nèi)一種新生血管信號(hào)抑制劑）的表達(dá)加強(qiáng) VEGF和 FGF的作用，從而促進(jìn)血管形成。miR-126基因缺失或功能障礙可能導(dǎo)致一系列的病理性血管形成和功能障礙，這一研究結(jié)果有助于為各種異常新生血管形成和血管滲漏導(dǎo)致的疾病提供一種新的治療方法。此外，Shilo等應(yīng)用抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Dicer酶的方法阻斷miRNAs的成熟過(guò)程，從而觀察miRNAs對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化還原反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，阻斷miRNAs的成熟后，可以降低人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的活性產(chǎn)物,如VEGF、腫瘤壞死因子-α等。他們認(rèn)為其主要的作用機(jī)制是 miRNAs可以對(duì)轉(zhuǎn)錄因子HBP1產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，而HBP1是p47phox的一種抑制性轉(zhuǎn)錄因子，抑制HBP的表達(dá)，將導(dǎo)致p47phox的表達(dá)增加，從而使人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的活性因子的表達(dá)增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。該試驗(yàn)證明了miRNAs可以調(diào)節(jié)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)通路，而還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶復(fù)合物的調(diào)節(jié)基因p47phox是miRNAs調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成等過(guò)程的一個(gè)特定靶點(diǎn)。以上研究表明了miRNAs在缺氧狀態(tài)下對(duì)VEGF的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。

3.2 miRNAs對(duì)TGF-β基因的表達(dá)調(diào)控

TGF-β因具有使正常小鼠成纖維細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化的能力而得名，是由淋巴細(xì)胞、血小板、單核細(xì)胞和肝枯否氏細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的一類(lèi)具有多重生物學(xué)效應(yīng)的因子，廣泛存在于動(dòng)物正常組織細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞的作用因細(xì)胞的種類(lèi)，細(xì)胞周?chē)h(huán)境和細(xì)胞自身狀態(tài)不同而表現(xiàn)出刺激或抑制效應(yīng)。TGF-β眼內(nèi)來(lái)源廣泛，已知眼前、后段組織中角膜、虹膜、晶狀體上皮細(xì)胞、小梁網(wǎng)細(xì)胞、睫狀體上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞都能合成和分泌。TGF-β可由壓力負(fù)荷、高血糖、血管緊張素Ⅱ等多種因素刺激產(chǎn)生。DR患者血清中TGF-β含量明顯高于健康人群，并隨病程延長(zhǎng)及眼部病情加重而增高。其參與DR發(fā)病機(jī)制可能為：（1）促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、粘附、細(xì)胞外基質(zhì)沉積；（2）激活絲裂原活化蛋白激酶，誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF增加，促進(jìn)DR新生血管形成；（3）增加纖維連接蛋白的合成，導(dǎo)致血管纖維化。此外，在新生血管的形成過(guò)程中，TGF-β參與新生血管的激活、重塑，并擴(kuò)張存在的血管網(wǎng)，它能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞向血管聚集，并向周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞(Edothelial cells, ECs)增殖。它同ang2、Tie2一起，在新生血管的重塑和維持血管的穩(wěn)定中發(fā)揮作用。

目前有研究表明miRNAs對(duì)TGF-β信號(hào)通路具有一定的調(diào)控作用，同時(shí)TGF-β也可影響miRNAs的表達(dá)。首先Sun等研究表明 TGF-β可以通過(guò)調(diào)節(jié) miR-24促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化，他們發(fā)現(xiàn)在骨骼肌細(xì)胞分化的過(guò)程中 miR-24的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)TGF-β可以抑制miR-24的表達(dá)，TGF-β是通過(guò)抑制smad3和miR-24啟動(dòng)子區(qū)域smad的結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮作用的。隨后，Zavadil等研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可以通過(guò)直接調(diào)控miRNAs的表達(dá)而影響上皮細(xì)胞的功能。有關(guān)糖尿病時(shí)miRNAs的調(diào)節(jié)作用研究尚少，最近 Kato等研究報(bào)道在糖尿病腎病時(shí) miRNA-192可以通過(guò)抑制E-box受體從而調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的膠原表達(dá)。miRNAs在糖尿病腎病時(shí)對(duì) TGF-β調(diào)控機(jī)制目前還不清楚，但是初步的研究表明miRNAs在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。DR和糖尿病腎病一樣都是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，他們之間存在著很多相似之處，因此，因此，有學(xué)者推測(cè)miRNAs在DR時(shí)也對(duì)TGF-β的表達(dá)發(fā)揮著一定的調(diào)控作用或通過(guò)某種機(jī)制影響TGF-β的生物學(xué)功能。

3.3 miRNAs對(duì)Ang-2/Tie-2信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)控

血管生成素（angiopoietin,Ang）是血管調(diào)節(jié)因子，分為Ang-1和Ang-2兩種。Ang1可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的連接，穩(wěn)定血管構(gòu)造。Ang-2是Ang-1的拮抗體，使周細(xì)胞游離，引起血管構(gòu)造不穩(wěn)定，在VEGF存在時(shí)促進(jìn)血管新生。Ang-1和Ang-2均是通過(guò)和其受體Tie-2結(jié)合而發(fā)揮作用的。目前，有許多研究結(jié)果表明，Ang/Tie-2系統(tǒng)很可能在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生和形成中發(fā)揮重要作用。Hackett等報(bào)道無(wú)論是在胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育階段或是成人視網(wǎng)膜病理性新生血管形成階段，視網(wǎng)膜表面和內(nèi)核層Ang-2表達(dá)都增高，提示Ang-2能輔助VEGF促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成。Umeda等研究也顯示：早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜纖維血管膜中有Ang-2,Tie-2的mRNA表達(dá)升高。轉(zhuǎn)基因Ang-2缺陷鼠，不可能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成。此外，Takagi等,研究顯示：人視網(wǎng)膜血管增殖標(biāo)本中，Ang-2，Tie-2表達(dá)均有升高；且在缺血性視網(wǎng)膜疾病所致的視網(wǎng)膜血管增殖膜中Ang-2、Tie-2表達(dá)明顯高于非缺血性視網(wǎng)膜疾病，同時(shí)Ozaki等收集了30例PDR病例和21例增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變患者玻璃體液，經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ang水平均有所升高。

這些研究結(jié)果都提示Ang-2/Tie-2信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的各個(gè)成員對(duì)視網(wǎng)膜微血管形成起到重要的促進(jìn)作用，而DR是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，新生血管的形成是造成視力損害的重要因素，因此如何在DR的狀況下調(diào)整Ang/Tie-2信號(hào)系統(tǒng)各成員的表達(dá)及作用，使其在DR早期血管穩(wěn)定、防滲漏中最大程度的發(fā)揮有益作用，是一個(gè)值得深入研究的問(wèn)題。目前關(guān)于 miRNAs對(duì)Ang/Tie-2信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)控作用機(jī)制研究尚少，僅有研究表明miRNAs可以調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Tie-2的表達(dá)，但是綜合以往研究多表明 miRNAs對(duì)新生血管形成的潛在調(diào)控作用及Ang/Tie-2信號(hào)系統(tǒng)在 DR新生血管形成中發(fā)揮的重要作用，miRNAs也有可能通過(guò)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中 Ang/Tie-2信號(hào)系統(tǒng)從而調(diào)控DR視網(wǎng)膜新生血管的形成。

4. 小結(jié)

大家知道血管新生在生理和病理的條件下均可以產(chǎn)生，但不同的是：生理?xiàng)l件下的血管生成是一個(gè)有序的過(guò)程，而病理?xiàng)l件下的血管生成表現(xiàn)為無(wú)序和不可控制。血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子等參與其中，如：VEGF/VEGFR、TGF-β、Ang/Tie、胰島素樣生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、缺氧誘導(dǎo)因子等。在正常的血管代謝中這些正向、負(fù)向作用因子保持平衡，在高糖作用下，平衡被打破，VEGF等正向因子被激活，刺激新生血管的形成。其主要步驟是：① 在VEGF等因子作用下，血管基底膜松弛，內(nèi)皮細(xì)胞增殖；② 內(nèi)皮細(xì)胞在黏附分子作用下，以出芽的方式向外遷徙；③ 各種促血管因子和其受體結(jié)合，促使內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔；④ 在各種血管生成因子的作用下，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和周?chē)С旨?xì)胞相互作用，使血管壁緊密，完成血管的重塑。這個(gè)過(guò)程可以簡(jiǎn)單的概括為：增殖、出芽、形成、重塑4個(gè)階段。在該過(guò)程中VEGF/VEGFR、Ang/Tie-2、TGF-β發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而這些血管生成因子的主要作用靶細(xì)胞――內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能在新生血管的形成中也發(fā)揮著不可忽視的作用。因此，我們認(rèn)為對(duì)作用于新生血管形成各個(gè)階段的關(guān)鍵性因子—VEGF/VEGFR、TGF-β、Ang/Tie-2信號(hào)系統(tǒng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控有可能成為抑制DR新生血管形成的一種新方法。目前有研究[32]表明使用小分子干擾 RNA選擇性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的DICER酶的表達(dá)，從而阻斷miRNAs的成熟過(guò)程，發(fā)現(xiàn)miRNAs的減少抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及內(nèi)皮條索的形成，并改變了多種影響內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為及血管生成能力的重要調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況，如 TEK/Tie-2、KDR/VEGFR等。因而隨著對(duì)miRNAs功能的深入了解，許多學(xué)者推測(cè)miRNAs在眼部目前治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變新生血管形成的過(guò)程中有著不可估量的治療前景。尋找能靶向調(diào)控血管形成的miRNAs，并探討其內(nèi)在調(diào)控途徑，對(duì)深入和全面理解血管形成的分子機(jī)制有著重要的意義,并使得 miRNAs有可能成為抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療的新靶點(diǎn)。

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