吳國志，歐積壯，吳昌新

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院骨二科，海南 ?？?570311)

·論 著·

巴戟天水提取物對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中OPG/RANKL表達(dá)的影響

吳國志，歐積壯，吳昌新

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院骨二科，海南 ?？?570311)

目的 在成骨誘導(dǎo)條件下，探討巴戟天水提取物對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中骨保護(hù)素(OPG)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)表達(dá)的影響。方法取原代大鼠MSCs，行堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅染色，確定其成骨分化能力；使用0(對照組)、10 g/L(M1組)及100 g/L(M2組)濃度的巴戟天水提取物處理MSCs細(xì)胞，在成骨誘導(dǎo)的條件下干預(yù)7 d，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，并提取細(xì)胞的總RNA及總蛋白，采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中OPG/RANKL的分泌水平，采用Real-time PCR及Western Blot檢測MSCs的OPG/RANKL基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果經(jīng)ALP和茜素紅染色可見MSCs著色明顯。M1處理組和M2處理組OPG/RANKL基因表達(dá)水平較對照組上升，分別為(29.0±6.3)%和(60.0±5.4)%；同時M1及M2組細(xì)胞培養(yǎng)液中OPG/RANKL的蛋白分泌水平分別較對照組上升(17.0±4.1)%和(39.0±6.4)%；通過Western Blot檢測，M1組及M2組OPG/RANKL的蛋白表達(dá)較對照組上升(20.0±4.3)%和(35.0±4.3)%。以上結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論巴戟天水提取物可以提升MSCs細(xì)胞分泌的OPG/RANKL水平，改善骨質(zhì)疏松患者OPG/RANKL比例失衡狀況，這是巴戟天抗骨質(zhì)疏松的主要機(jī)制。

巴戟天；水提取物；間充質(zhì)干細(xì)胞；骨保護(hù)素；核因子κB受體活化因子配體；骨質(zhì)疏松

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(OP)是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化、骨的脆性增加以及容易發(fā)生骨折為特征的一種全身性骨骼疾病，多發(fā)生于65歲老年人以及絕經(jīng)后的婦女[1-2]。我國是世界上擁有OP患者最多的國家，約有9 000萬患者，占總?cè)丝诘?%。骨質(zhì)疏松癥患者更容易發(fā)生股骨頸骨折、肱骨近端骨折及脊柱壓縮性骨折，骨折給患者帶來痛苦和困擾，并帶來巨大社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。在骨代謝的過程中，正常的骨重建是破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞兩種細(xì)胞在骨代謝中達(dá)到舊骨吸收與新骨形成之間的動態(tài)平衡的過程，這種平衡被打破是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因。近來的研究發(fā)現(xiàn)OPG/RANKL細(xì)胞因子系統(tǒng)在骨重建過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。前期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：巴戟天醇提取物對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有明顯的防治作用，然而巴戟天水提取物的作用以及對OPG/RANKL系統(tǒng)的影響尚不明確。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)手段，探討巴戟天水提取物促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的具體機(jī)制是否與OPG/RANKL系統(tǒng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要的試劑和儀器 巴戟天水提取物(西安潤澤生物科技公司，中國)；F12-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；Trizol試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國)；堿性磷酸酶染色試劑盒(碧云天，中國)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、茜素紅染液(Cyagen，中國)；SYBRGreen染料(Fermentas，美國)；胰蛋白酶、OPG及RANKL Elisa試劑盒(博士德，中國)；兔抗OPG、RANKL多克隆抗體(Abcam，美國)；5%二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國)；臺式水平離心機(jī)(Heal Force，中國)；實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(BIO-RAD，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡雄性SD大鼠30只，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 大鼠間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)的分離和培養(yǎng) 取8周齡SD大鼠，脫頸處死后使用75%酒精浸泡20 min，取出股骨并去除周圍軟組織，使用充滿F12-DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)的10 ml注射器沖洗骨髓至骨髓發(fā)白，吹打成細(xì)胞懸液，1 500 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min，收集有核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿瓶底70%～80%時，使用0.25%的胰酶消化，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MSCs成骨分化的鑒定 使用第三代的細(xì)胞，0.25%的胰酶消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml，接種至24孔板培養(yǎng)，使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d和28 d。分別行ALP染色和茜素紅染色。ALP染色方法按照碧云天ALP染色試劑盒所述方法實(shí)施，茜素紅染色使用Cyagen成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基附贈之茜素紅染液，按照Cyagen的染色說明進(jìn)行染色。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理 按照5×105/ml的密度，接種MSCs于6孔板，待細(xì)胞長滿后，分為三組：0 g/L巴戟天水提取物(空白對照組，C組)，10 g/L巴戟天水提取物(M1組)，100 g/L巴戟天水提取物(M2組)，干預(yù)7 d，收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.6 熒光定量PCR檢測基因的表達(dá) 使用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA：每孔加1 ml Trizol進(jìn)行裂解，隨后加入200 μl氯仿，劇烈混勻，12 000×g離心15 min；吸取上層水相400 μl，加入等體積異丙醇，12 000×g離心10 min，棄上清；使用75%乙醇7 500×g離心5 min進(jìn)行洗滌，然后加入50 μl DEPC水。按照Invitrogen說明書的方法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，使用用美國BIO-RAD公司實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測OPG及RANKL的基因表達(dá)；PCR反應(yīng)體系(20μl)，反應(yīng)條件：95℃，3 min變性；95℃，30 s，62℃，40 s，共40個循環(huán)。讀取各基因的Ct值，采用2-△△CT方法進(jìn)行相對定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。

1.7 ELISA法檢測細(xì)胞上清中蛋白的表達(dá) 按照博士德OPG及RANKL ELISA試劑盒的說明，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中OPG及RANKL的蛋白濃度，每個樣本設(shè)三個復(fù)孔。

1.8 總蛋白提取及Western Blot檢測 收獲細(xì)胞，提取總蛋白(參照博士德蛋白抽提試劑盒)。按照1∶4比例加入上樣緩沖液，混勻后置于100℃水浴5 min，使蛋白變性。上樣蛋白量為20 μg，使用垂直電泳進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗并4℃過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫放置1 h，TBST再洗滌3次，使用谷歌生物公司ECL顯影液進(jìn)行顯影，暗室內(nèi)曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用one-way ANOVO中的Dunnet t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化鑒定 堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)分別為成骨分化的早期和晚期指標(biāo)，可分別使用ALP和茜素紅染色鑒定。如圖1所示，ALP染色主要著色在細(xì)胞膜，呈紫色；茜素紅染色主要在鈣沉積部位呈紅色。

圖1 MSC成骨誘導(dǎo)7 d后ALP染色和茜素紅染色結(jié)果

2.2 基因表達(dá)的測定 熒光定量PCR檢測各實(shí)驗(yàn)組OPG和RANKL mRNA的表達(dá)，如圖2所示，M1組及M2組OPG和RANKL基因表達(dá)水平經(jīng)計(jì)算后以O(shè)PG/RANKL的形式與對照組進(jìn)行比較，分別較對照組上升(29.0±6.3)%和(60.0±5.4)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這樣的結(jié)果表明巴戟天的水提取物可以促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG mRNA的表達(dá)和抑制RANKL的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖2 MSC成骨誘導(dǎo)7 d OPG和RANKL基因的表達(dá)

2.3 蛋白水平的測定 ELISA法檢測細(xì)胞上清中分泌蛋白的表達(dá)，計(jì)算M1組、M2組及對照組細(xì)胞培養(yǎng)的上清中OPG、RANKL水平，OPG/RANKL的比值對照組為(1.01±0.02)，M1組為(1.17±0.06)，M2組為(1.39±0.08)。M1組和M2組分別較對照組上升(17.0±4.1)%和(39.0±6.4)%。Western Blot結(jié)果如圖3所示，可見GAPDH、OPG和RANKL的蛋白條帶，利用Image proplus進(jìn)行灰度分析，所得的灰度值與GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后再計(jì)算OPG/RANKL的比值，M1組和M2組分別與對照組比較，OPG/RANKL蛋白水平分別上升了(20.0±4.3)%和(35.0±4.3)%。

圖3 MSC成骨誘導(dǎo)7 d OPG和RANKL蛋白的表達(dá)

3 討 論

已有文獻(xiàn)報道，巴戟天的提取物和含藥血清均能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分泌ALP與骨鈣素、增加成骨細(xì)胞的礦化，其中巴戟天水提取物可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β1mRNA的表達(dá)[5-6]，但巴戟天對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用卻報道較少。本研究表明，巴戟天水提取物能影響MSCs細(xì)胞分泌OPG/RANKL的水平，從基因水平和蛋白水平都得到很好的驗(yàn)證。巴戟天水提取物能促使MSCs分泌OPG升高，RANKL相對下降，OPG/ RANKL比值增高。這些結(jié)果表明巴戟天水提取物能改善骨質(zhì)疏松患者OPG/RANKL比例失衡狀況，OC的數(shù)量和活性降低，從而改變骨質(zhì)疏松的發(fā)展，減少老年患者骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的概率。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可表現(xiàn)為多向分化潛能，特別是在成骨分化中得到了廣泛的應(yīng)用。MSCs的成骨和成脂分化能力失衡也成為骨質(zhì)疏松的一個重要原因，最近的研究表明MSCs還通過直接接觸和旁分泌的形式影響破骨細(xì)胞的分化和功能，從而改變骨代謝[7]。OPG/RANKL是近年來研究發(fā)現(xiàn)的骨代謝重要通路之一，OPG/RANKL均可由MSCs分泌。許多細(xì)胞因子、激素等均直接或間接影響成骨細(xì)胞(OB)、破骨細(xì)胞(OC)的成熟、分化。RANKL是TNF超家族成員之一，主要由成骨細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞分泌，RANKL可與破骨前體細(xì)胞膜受體RANK結(jié)合，刺激破骨前體細(xì)胞分化并可以使成熟的破骨細(xì)胞活化，增強(qiáng)其骨吸收能力[8]。骨保護(hù)素(OPG)屬于TNF受體超家族。OPG與膜受體RANK競爭性結(jié)合RANKL，阻斷RANKL與破骨細(xì)胞系細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，從而抑制骨吸收[9]。OPG/RANKL比率的改變可以直接影響破骨細(xì)胞的發(fā)育，當(dāng)比率上升時OC的數(shù)量和活性降低?？傊?，正常的骨重建和骨量的穩(wěn)定依賴于OPG和RANKL的平衡。

原發(fā)性骨質(zhì)疏松分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者主要是由于絕經(jīng)后雌激素分泌減少，Eghbali-Fatourechi等[10]發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL表達(dá)增高，且與雌激素水平呈負(fù)相關(guān)，雌激素缺乏時，抗骨吸收的因子如TGF-β合成減少，引起OPG基因表達(dá)下降；老年性骨質(zhì)疏松患者，隨著年齡的增加存活的成骨細(xì)胞逐漸減少以及ROS系統(tǒng)激活導(dǎo)致成骨細(xì)胞核骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的RANKL增加、OPG表達(dá)下降。這些均造成OPG/RANKL比例失衡，成為原發(fā)性骨質(zhì)疏松的主要機(jī)制[11-13]。

同時本研究也有一些局限性。巴戟天水提取物激動后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的信號通路的變化我們并沒有關(guān)注，間充質(zhì)干細(xì)胞對破骨細(xì)胞的直接影響未得到驗(yàn)證。但由于OPG/RANKL系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松中的重要作用，我們的研究也有著一定骨科基礎(chǔ)和臨床意義。

綜上所述，我們能得出這樣的結(jié)論，巴戟天水提取物通過增加MSCs細(xì)胞分泌的OPG/RANKL水平來間接影響骨髓微環(huán)境中破骨細(xì)胞的生成，改善骨質(zhì)疏松患者OPG/RANKL比例失衡狀況，從而達(dá)到治療原發(fā)骨質(zhì)疏松的目的。

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Effect of Morinda Root aqueous extract on the expression of OPG/RANKL in mesenchymal stem cells.

WU Guo-zhi,OU Ji-zhuang,WU Chang-xin.Department of Orthopedics,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Morinda Root aqueous extract on the expression of osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand(OPG/RANKL)in mesenchymal stem cells(MSCs)under osteogenic induction.MethodsThe primary cultured rat MSCs was stained by alkaline phosphatase(ALP)and alizarin red to identify the osteogenic differentiation ability.MSCs were cultured in the medium containing 0(control group),10 g/L(M1 group)and 100 g/L(M2 group)Morinda Root aqueous extract for seven days.Culture supernatant and cells were collected,and total RNA and total protein were extracted.The secretion level of OPG/RANKL was detected by using ELISA,and the expression levels of OPG/RANKL gene and protein were detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsMSCs were stained after treatment with ALP and alizarin red.Compared with the control group, the mRNA expression of OPG/RANKL in M1 group and M2 group were increased by(29.0±6.3)%and(60.0±5.4)%, and the secretion level of OPG/RANKL protein in cell culture fluid were increased by(17.0±4.1)%and(39.0±6.4)%. Western Blot showed the protein expression of OPG/RANKL were increased by(20.0±4.3)%and(35.0±4.3)%.These differences were all statistically significant(P＜0.05).ConclusionMorinda Root aqueous extract can up-regulate the expression of OPG/RANKL in MSCs,and improve the imbalance of RANKL/OPG in patients with osteoporosis,which is the main mechanism of Morinda officinalis in treatment of osteoporosis.

Morinda Root;Aqueous extract;Mesenchymal stem cells(MSCs);Osteoprotegerin(OPG);Receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand(RANKL);Osteoporosis

R-332

A

1003—6350（2016）03—0345—04

2015-10-18)

海南省衛(wèi)計(jì)委普通科研項(xiàng)目(編號：14A200077)

吳國志。E-mail：wuguozhi0898@163.com