張倩 周曉偉 王焱 孫建方

黑素瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展

張倩 周曉偉 王焱 孫建方

黑素瘤是高死亡率的皮膚腫瘤，鑒定出與黑素瘤發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)有助于闡明黑素瘤的發(fā)病機(jī)制，臨床上應(yīng)早期診斷以提高療效。近年來，比較蛋白組學(xué)、蛋白質(zhì)表達(dá)譜等多種蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法應(yīng)用于黑素瘤發(fā)病機(jī)制的研究，有助于明確相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路蛋白的功能，闡明腫瘤耐藥機(jī)制、發(fā)現(xiàn)可能的腫瘤標(biāo)記物以利于早期診斷、判斷療效和預(yù)后。

黑色素瘤；蛋白質(zhì)組學(xué)；基因表達(dá)譜；腫瘤標(biāo)記，生物學(xué)；信號(hào)傳導(dǎo)

黑素瘤多原發(fā)于皮膚，高度惡性，死亡率高。若能早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)治療可以治愈，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移其生存率明顯下降。為闡明其發(fā)病機(jī)制，精確進(jìn)行分期、制訂個(gè)體化治療方案及評(píng)估預(yù)后，人們最初從基因水平上試圖尋找分子靶標(biāo)。然而，一個(gè)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA加工、蛋白質(zhì)合成和修飾能產(chǎn)生許多不同的mRNA和蛋白質(zhì)，即轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)是細(xì)胞的實(shí)際功能分子，幾乎負(fù)責(zé)細(xì)胞所有的生物化學(xué)活性，是生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用大規(guī)模蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)，從整體蛋白質(zhì)水平探索生命的本質(zhì)及其規(guī)律，旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式，介紹包括運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在內(nèi)的多種方法探索黑素瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)蛋白的新進(jìn)展，其內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、存在方式（修飾形式）、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等，從一個(gè)機(jī)體或一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體活動(dòng)的角度來揭示和闡明生命活動(dòng)的基本規(guī)律。

1 比較蛋白組學(xué)在黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的研究

Str?mberg 等［1］采用以抗體為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩查正常組織、癌組織和細(xì)胞系中組織微陣列的蛋白表達(dá)，鑒定出一個(gè)新的突觸融合蛋白，具有黑素細(xì)胞選擇性的蛋白表達(dá)模式，進(jìn)一步通過2個(gè)獨(dú)立的黑素瘤隊(duì)列研究表明，突觸融合蛋白在黑素瘤中表達(dá)水平與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，突觸融合蛋白的表達(dá)水平越低，腫瘤侵襲性越強(qiáng)，作者認(rèn)為，以抗體為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法是發(fā)現(xiàn)黑素瘤生物標(biāo)志物的一個(gè)很有吸引力的策略。Greco等［2］用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）分析方法和二維電泳相結(jié)合的蛋白質(zhì)組譜方法，分析了50例擬手術(shù)治療的可疑黑素瘤患者的血清樣品，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白和血管緊張素原表達(dá)升高，維生素D結(jié)合蛋白表達(dá)下降。通過檢測(cè)使維生素D結(jié)合蛋白糖基化的α-N-乙酰半乳糖胺酶活性，可以無創(chuàng)性地檢測(cè)黑素瘤的嚴(yán)重程度。Nawarak等［3］用二維電泳結(jié)合MALDI-TOF MS和MS/MS方法分析了熊果苷對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞系蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，從蛋白組學(xué)探索熊果苷的抗癌效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)26個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中7個(gè)蛋白顯著上調(diào)，19個(gè)蛋白顯著下調(diào)；進(jìn)一步經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR及蛋白質(zhì)印跡方法分析驗(yàn)證得出 14-3-3G、VDAC-1、p53 上調(diào)；VIME、PRDX1、ENPL、IMDH2、ENOA 下調(diào)，并用生物信息學(xué)分析這些蛋白的功能以及預(yù)測(cè)蛋白之間相互作用，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在腫瘤的抑制中起重要作用和描繪出調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

作者單位：210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所 江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室皮膚外科（張倩、周曉偉、王焱），病理科（孫建方）

2 蛋白質(zhì)表達(dá)譜在黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的研究

Baruthio 等［4］用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鳥槍法（shotgun）在檢測(cè)黑素瘤細(xì)胞系的耐洗滌劑膜（detergent resistant membranes）中共鑒定出177種蛋白質(zhì)，5′-核苷酸酶CD73經(jīng)二維電泳被證實(shí)，放射狀生長(zhǎng)階段細(xì)胞中的維生素D結(jié)合蛋白比轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的更豐富。同樣，MYOF、CDH13、LGALS1在放射狀生長(zhǎng)階段-放射狀生長(zhǎng)階段/垂直生長(zhǎng)階段細(xì)胞的耐洗滌劑膜中比轉(zhuǎn)移細(xì)胞更豐富。18種蛋白質(zhì)富含于轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中；FERM、MFGE8、SPTA和SPTB、STOM以及RALB也在轉(zhuǎn)移細(xì)胞的耐洗滌劑膜中表達(dá)增多。該研究證實(shí)，蛋白質(zhì)MFGE8、ATP6V1B2、GAL3、FLOT2在垂直生長(zhǎng)階段和轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的耐洗滌劑膜中更豐富，而CDH13僅在放射狀生長(zhǎng)階段細(xì)胞系的耐洗滌劑膜中觀察到。黑素瘤細(xì)胞特殊的耐洗滌劑膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞惡性程度有關(guān)，提示一些蛋白質(zhì)與耐洗滌劑膜成分的相互作用可能在黑素瘤的進(jìn)展中得到調(diào)節(jié)，并在疾病進(jìn)展中有一定作用。

Carta等［5］對(duì)同一黑素瘤患者原始和轉(zhuǎn)移損害的細(xì)胞系和短期培養(yǎng)的黑素細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過二維電泳分析了短期培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物，鑒定出參與黑素瘤進(jìn)展的8種候選基因：PRDX2、HSP27、HSP60、HSPA8、HSP9B、STIP1、PDI、P4HB，并通過實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR分析檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，評(píng)價(jià)了原發(fā)和轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤蛋白質(zhì)表達(dá)的差異：休克蛋白（HSP）27、60、A8 過度表達(dá)，而PRDX2低表達(dá)。

3 關(guān)鍵通路蛋白在黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的研究

研究發(fā)現(xiàn)，BRAF是參與黑素瘤發(fā)病機(jī)制中最常變異的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是RAF蛋白家族的成員之一，在52%～82%黑素瘤和黑素細(xì)胞皮損中突變。BRAF參與RAS-RAF-絲裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路，使160種以上蛋白質(zhì)磷酸化。活化的BRAF突變主要發(fā)生在黑素瘤的進(jìn)展期，很少發(fā)生在晚期，表明該通路較早的活化在黑素瘤的起始和進(jìn)展中起作用［6］。

有作者用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)一步區(qū)分MeWo和 MM418兩個(gè)黑素瘤細(xì)胞系，以研究干擾素（IFN）活性的分子基礎(chǔ)和抵抗的可能機(jī)制。MM418和MeWo細(xì)胞系對(duì)IFN的抗增殖作用分別表現(xiàn)為敏感和抵抗，因此，用來研究黑素瘤細(xì)胞對(duì)IFN的不同反應(yīng)。IFN-α抑制MM418生長(zhǎng)，對(duì)MeWo無抑制作用。兩個(gè)細(xì)胞系經(jīng)IFN-α誘導(dǎo)后均見人類白細(xì)胞抗原ABC、STAT1α、p91蛋白表達(dá)。CTSB在MM418中表達(dá)水平顯著高于MeWo。PA28α在兩個(gè)細(xì)胞系中均明顯上調(diào)，但在MM418中表達(dá)水平更高［7］。蛋白印跡試驗(yàn)證實(shí)，α/β-SNAP在經(jīng)IFN-α治療的兩個(gè)細(xì)胞系中均上調(diào)。

4 黑素瘤腫瘤標(biāo)記物的研究

Sinha 等［8］運(yùn)用二維電泳與 MALDI-TOF MS 相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了對(duì)抗癌藥物（去乙酰長(zhǎng)春酰胺、依托泊甙、順氯氨鉑、福替目丁）耐藥的黑素瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)譜表達(dá)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)電壓依賴性陰離子通道蛋白過表達(dá)。另有一些耐藥的黑素瘤細(xì)胞的分子伴侶過表達(dá)，包括HSP。幾乎每個(gè)耐藥的細(xì)胞中HSP27過表達(dá)，大多數(shù)細(xì)胞系中，HSX70或HSP60異構(gòu)體上調(diào)。HSP90在順氯氨鉑、福替目丁抵抗的細(xì)胞中下調(diào)。谷胱甘肽還原酶在一些耐藥的人黑素瘤細(xì)胞系MeWo中差異性高表達(dá)，在谷胱甘肽減少的細(xì)胞質(zhì)中維持高水平，故可作為谷胱甘肽濃度的間接標(biāo)記。蛋白質(zhì)組學(xué)分析有助于闡明耐藥的機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)人體靶向治療［9-10］。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）C和VEGF-D高表達(dá)與黑素瘤轉(zhuǎn)移至前哨淋巴結(jié)的頻率增加相關(guān)。SPP1和PRAME被鑒定為黑素瘤特異標(biāo)記物，可在前哨淋巴結(jié)鑒別黑素瘤細(xì)胞與痣細(xì)胞。Melan-A和酪氨酸酶表達(dá)水平可用于評(píng)估患者生存狀況。在黑素瘤陽性的前哨淋巴結(jié)中，白細(xì)胞介素（IL）13、瘦素、淋巴毒素β受體、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白明顯升高，而IL-11 Ra下降。這些基因水平的測(cè)定有助于評(píng)估前哨淋巴結(jié)。另外，前哨淋巴結(jié)CD4T細(xì)胞OX40（CD134）的表達(dá)也有助于前哨淋巴結(jié)的評(píng)估，該基因在黑素瘤的進(jìn)展期表達(dá)下降。觀察循環(huán)中黑素瘤細(xì)胞的標(biāo)記包括：酪氨酸酶、Melan-A、MAGE-3、黑素瘤細(xì)胞黏附分子18、p97、gp100。使用MAGEA-plex、MART-1、酪氨酸酶描述循環(huán)中黑素瘤細(xì)胞最有效，因?yàn)樗鼈冊(cè)谕庵苎泻谒亓黾?xì)胞中的表達(dá)至少達(dá)1 000倍以上，循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞高度提示預(yù)后不良。酪氨酸酶RNA水平測(cè)定已經(jīng)成為重要的無病生存的反向預(yù)后因素［11］。TA90IC、MIA蛋白可預(yù)測(cè)三期患者的生存。MAGE-3與疾病進(jìn)展相關(guān)性最佳。VEGF受體1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）β1、BCL-2、SKP2 和 p27（KIP1）與黑素瘤進(jìn)展有關(guān)。

5 與黑素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的研究

去磷酸絲切蛋白通過切割漿膜附近存在的肌絲使肌動(dòng)蛋白聚合產(chǎn)生新的刺端來促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的侵襲。絲切蛋白切割肌動(dòng)蛋白的能力可通過Rho家族小GTP激酶的下游信號(hào)而被終止，一旦肌動(dòng)蛋白被聚合，則不能立即被切割。在其他環(huán)境，PIP2水平增加可通過結(jié)合和替換肌動(dòng)蛋白肌絲加帽蛋白（如肌動(dòng)蛋白肌絲末端的凝溶膠蛋白），從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合。高水平的凝溶膠蛋白可減少黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。所有肌動(dòng)蛋白聚合的機(jī)制均依賴于細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白單體的可用性，其常被纖維蛋白、胸腺素β4等分子抑制。這些分子在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中上調(diào)［12］。

細(xì)胞外基質(zhì)的主要調(diào)節(jié)介質(zhì)是整聯(lián)蛋白［7］，在侵襲性黑素瘤中整聯(lián)蛋白表達(dá)下調(diào)，其可形成由α和β亞基組成的二聚體復(fù)合體。αVβ3二聚物可結(jié)合一系列含有氨基酸序列RGD的配體（包括纖維蛋白），對(duì)黑素瘤的潛在侵襲性尤其重要。整聯(lián)蛋白結(jié)合的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分為膠原、層粘連蛋白和纖維蛋白；阻斷整聯(lián)蛋白與層粘連蛋白和纖維蛋白相互作用的多肽已被證實(shí)，可減少黑素瘤體外運(yùn)動(dòng)性和在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移?；|(zhì)成分的產(chǎn)生在侵襲性黑素瘤中也發(fā)生改變，如纖維蛋白、SPARC、TNC和某些層粘連蛋白的表達(dá)在侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中增加，研究表明，這些基質(zhì)成分能促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。促使細(xì)胞體運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力來自肌動(dòng)蛋白和肌球運(yùn)動(dòng)蛋白的相互作用，主要受非肌細(xì)胞類型的磷酸化作用調(diào)節(jié)。許多影響調(diào)節(jié)性肌球蛋白亞單位的磷酸化途徑在轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞中上調(diào)。RhoC可通過結(jié)合ROCK1和ROCK2提高肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮性，ROCK1、ROCK2（也稱 Rho或 ROKα） 調(diào)節(jié)MLC激酶磷酸化作用，RhoC的高表達(dá)是黑素瘤模型轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。抑制RhoC之后，RhoA或ROCK1&2可減少黑素瘤細(xì)胞的侵襲性，可能是治療干預(yù)的潛在途徑。ROCK激酶抑制劑可在鼠模型中減少黑素瘤轉(zhuǎn)移［13］。多功能蛋白 MTS1（S100A4）在黑素瘤中下調(diào)，可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白相互作用。為了肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮有效移動(dòng)細(xì)胞體，F(xiàn)肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)需要與細(xì)胞基質(zhì)粘連體和漿膜相連接，需要一系列相關(guān)蛋白的支持，如PIP2或完整的膜蛋白與F肌動(dòng)蛋白和薄膜成分結(jié)合，這些蛋白和細(xì)胞骨架連接蛋白在黑素瘤轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)增加［12］。

體外實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)黑素瘤細(xì)胞在細(xì)胞周圍多點(diǎn)粘連。如果這些粘連體收縮，且沒有粘連的重塑，細(xì)胞將產(chǎn)生內(nèi)張力而運(yùn)動(dòng)，因此，有效地運(yùn)動(dòng)需要一些粘連復(fù)合體的分離。微小管網(wǎng)絡(luò)作用于粘連點(diǎn)使其分離，有利于動(dòng)力蛋白介導(dǎo)的動(dòng)搖粘連的蛋白質(zhì)傳遞。激酶FAK和ERK可促進(jìn)粘連復(fù)合物的翻轉(zhuǎn)。FAK在黑素瘤中過表達(dá)，而ERK1在轉(zhuǎn)移性黑素瘤的一個(gè)模型中過表達(dá)。粘連成分可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶分解，如受ERK調(diào)節(jié)的鈣蛋白酶。抑制鈣蛋白酶可減少與高水平整合蛋白αVβ3相關(guān)黑素瘤的遷移。大量的研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）在侵襲性黑素瘤中上調(diào)，對(duì)促進(jìn)黑素瘤的播散起重要作用。然而不同的MMP有侵襲和抗侵襲性能，因此，目前廣泛的MMP靶向抑制劑在臨床中尚未取得成功。另一可能失敗的原因是非MMP蛋白酶的潛在作用，如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解中的組織蛋白酶［14］。組織蛋白酶在黑素瘤中常下調(diào)，藥物抑制可減少黑素瘤細(xì)胞的侵襲。uPA serine蛋白酶和其受體在黑素瘤進(jìn)展中，可通過他們的能力活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如小GTPase-Rac1通路。HGP、TGF-β可上調(diào)許多參與黑素瘤運(yùn)動(dòng)的基因，包括纖連蛋白、各種膠原蛋白、整聯(lián)αV、CD44、VEFG-A，并下調(diào)E鈣黏著蛋白。TGF-β通過轉(zhuǎn)錄因子的snail家族上調(diào)其作用，這可驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的間葉細(xì)胞模式，以促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲。snail家族蛋白［15］在侵襲性黑素瘤中高表達(dá)，活性增加，能減少E鈣黏著蛋白、occludin和claudin表達(dá)，而提高N鈣黏著蛋白水平有助于黑素瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞而非角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用。snail還可調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)基因的表達(dá)，包括MMP-2、SPARC、金屬蛋白酶組織抑制因子 1、RhoA［12］。

6 結(jié)語

蛋白質(zhì)組學(xué)作為先進(jìn)方法鑒定未知蛋白質(zhì)、研究蛋白質(zhì)功能、高通量監(jiān)控蛋白質(zhì)差異表達(dá)等，借助技術(shù)的突飛猛進(jìn)和成本的降低，在黑素瘤研究中的應(yīng)用日益廣泛。高通量篩選數(shù)目眾多的蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)很多假陽性結(jié)果，需要研究者深入了解研究背景，借助生物信息學(xué)挑選出有意義的蛋白質(zhì)，再鑒定、驗(yàn)證其功能和相關(guān)作用。借助蛋白質(zhì)組學(xué)等方法研究黑素瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)的蛋白，有利于發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，對(duì)黑素瘤早期的診斷、判斷預(yù)后意義重大。

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Proteins associated with the pathogenesis of melanoma

Zhang Qian,Zhou Xiaowei,Wang Yan,Sun Jianfan.Department of Dermatologic Surgery,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Melanoma is a kind of skin cancer with high mortality.Identifying proteins associated with the initiation and progression of melanoma is beneficial to elucidating the pathogenesis of melanoma.Early diagnosis is important for effective treatment of melanoma.Recently,proteomics,including comparative proteomics and protein expression profiling,has been applied to researches into melanoma,which will help to clarify the functions of related cell signaling pathways,elucidate mechanisms underlying drug resistance in tumors,discover tumor markers,so as to facilitate early diagnosis as well as predilection of therapeutic efficacy and prognosis.

Melanoma;Proteomics;Gene expression profiling;Tumor markers,biological;Signal transduction

s:Wang Yan,Email:drwangyan@163.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

2015-01-20）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272992）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131063）；江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)（BL2012003）；江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃（2012ZD011）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China （BK20131063）;Jiangsu Provincial Special Program of Medical Science （BL2012003）；Science and Technology Infrastructure Development Program of Jiangsu Province（2012ZD011）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.01.014

王焱，Email:drwangyan@163.com，孫建方，Email:fangmin5758@aliyun.com

本文主要縮寫：MALDI-TOF MS：基質(zhì)輔助激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜，HSP：休克蛋白，MEK：絲裂原激活蛋白激酶的激酶，ERK：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，IFN：干擾素，VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，IL：白細(xì)胞介素，TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶，