任海燕，薛曉芳，王永康，趙愛玲，隋串玲，李登科，丁國杰

專題綜述

果樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生影響因子研究進(jìn)展

任海燕1，薛曉芳1，王永康1，趙愛玲1，隋串玲1，李登科1，丁國杰2

(1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西 太原 030031；2山西省聞喜縣農(nóng)業(yè)委員會，山西 聞喜 043800)

從基因型、外植體、培養(yǎng)基、碳源、外源激素、添加物、培養(yǎng)條件等內(nèi)外因素幾個方面對果樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響因子研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并探討了存在的問題和今后的研究方向，為果樹體細(xì)胞胚的研究提供參考。

果樹；體細(xì)胞胚胎發(fā)生；內(nèi)因；外因

植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育與合子胚相似，是離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的有效途徑[1]。自1958年，Steward等和Reinert報道了胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生的研究后，人們在大量的植物組織培養(yǎng)、單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到體細(xì)胞胚的發(fā)生。目前我國涉及該研究的樹種有數(shù)10個，已有100多種植物培育出了體細(xì)胞胚[2，3]，特別是在針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的生理代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征以及基因表達(dá)研究等方面取得了較好成果[4]。近年來，關(guān)于果樹體細(xì)胞胚發(fā)生的研究也越來越多，并已在蘋果、核桃、枇杷、葡萄、荔枝、藍(lán)莓、香蕉、草莓、棗、桃、柿等樹種上成功獲得體細(xì)胞胚[5]。

作為快速繁殖和制作人工種子的重要手段的植物體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)，其再生植株的最初來源是單個胚性細(xì)胞，能夠克服遺傳嵌合及后代分離問題，對于進(jìn)行基因工程或細(xì)胞工程育種有著重要意義。體細(xì)胞胚的發(fā)生有直接途徑和間接途徑。前者是外植體不經(jīng)過愈傷組織階段，直接誘導(dǎo)分化出來；后者是通過脫分化形成愈傷組織后，體細(xì)胞胚由胚性愈傷組織發(fā)育而來。體胚的發(fā)生受多種因素影響，包括基因型、外植體類型、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)條件等[6]。本文對影響果樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的內(nèi)外因素進(jìn)行綜述，以期為果樹基因工程和細(xì)胞工程育種提供參考。

1 內(nèi)因

1.1 基因型

基因型是影響果樹體細(xì)胞胚發(fā)生的主要內(nèi)因。番木瓜和獼猴桃的兩性體比雄性體更易產(chǎn)生體胚。不同荔枝品種的同類外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織的頻率不同[7]。同一外植體的不同柑桔品種誘導(dǎo)胚性愈傷組織的能力也存在顯著差異[8]。歐洲葡萄較沙地葡萄和圓葉葡萄更難產(chǎn)生胚性愈傷[9]。王傲雪等[10]認(rèn)為，不同基因型的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)條件不同，從而導(dǎo)致體細(xì)胞胚發(fā)生頻率不同。體細(xì)胞胚的發(fā)生受基因的限制，胚性細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)形成體胚的過程是基因新一輪表達(dá)的結(jié)果。

1.2 外植體

選擇適宜的外植體是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵因子之一。常見的外植體有花藥、子葉、胚軸、成熟胚、幼胚、子房、莖尖、葉片、花瓣等。郟艷虹等[11]研究表明，草莓的花藥、花芽、葉片、葉柄、子葉、下胚軸均可誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，但誘導(dǎo)率存在顯著差異，以花芽誘導(dǎo)率最高，可達(dá)61.74%。蘋果珠心的珠孔端細(xì)胞能形成體細(xì)胞胚，而合點端卻不能[12]。鄧正正[13]對胡桃楸體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的研究表明，只有授粉后13周的胚軸產(chǎn)生了20%的體細(xì)胞胚，而不同時期的子葉、胚根和種胚均未誘導(dǎo)出胚狀體。羅君琴等[8]認(rèn)為，柑桔的下胚軸誘導(dǎo)胚性愈傷組織能力強(qiáng)于子葉、幼根及上胚軸。Ruan JY等[14]認(rèn)為，幼胚的發(fā)育程度對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)起決定性作用。張健等[15]以授粉后50 d的柑桔幼胚為外植體，經(jīng)直接發(fā)生途徑誘導(dǎo)體細(xì)胞胚高頻發(fā)生率。但也有人[16]認(rèn)為，在幼胚的發(fā)育過程中，只有一個較短的階段具有很強(qiáng)的體細(xì)胞胚發(fā)生潛能。

2 外因

2.1 培養(yǎng)基

用于果樹體細(xì)胞胚發(fā)生常見的培養(yǎng)基有MS、B5、NN69、DKW、WPM等，其中MS為最常用的培養(yǎng)基，因其含有NH4NO3較高，利于果樹體細(xì)胞胚的發(fā)生[7]。但不同的果樹種類對基本培養(yǎng)基的選擇也有物種特異性，在葡萄體細(xì)胞胚發(fā)生過程中也有使用液體培養(yǎng)基的報道[9]。柑桔在MT固體培養(yǎng)基的愈傷組織生長速度與體細(xì)胞胚胎發(fā)生之間的比率最佳[17]。多數(shù)學(xué)者[18-20]采用MS培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)出胚狀體。而McGranahan等[21]認(rèn)為DKW是核桃體細(xì)胞胚發(fā)生的首選培養(yǎng)基，WPM更適用于黑核桃。

2.2 碳源

糖類不僅是體細(xì)胞胚碳源的主要來源之一，而且作為滲透劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透勢，影響體細(xì)胞胚發(fā)生的速度和生長量。Yancheva等[22]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖和果糖二者結(jié)合可提高無核葡萄胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。但多數(shù)果樹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中常以3%的蔗糖作為碳源。但棗的胚狀體成苗培養(yǎng)基需將蔗糖濃度提高到5%[18]。荔枝幼胚在胚性愈傷組織分化過程中所需適宜的蔗糖濃度為5%，其誘導(dǎo)率可達(dá)64.2%，若蔗糖高于8% 則顯著地抑制了胚性愈傷組織分化[23]。

2.3 外源激素

誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生需要生長素和細(xì)胞分裂素配合使用，細(xì)胞分裂素與赤霉素類在體細(xì)胞胚的發(fā)生和發(fā)育過程中起協(xié)同作用[24]。在體細(xì)胞胚發(fā)育后期，ABA作為調(diào)節(jié)胚胎晚期發(fā)育的關(guān)鍵因子起著重要的作用。只有通過調(diào)節(jié)外源激素與內(nèi)源激素的平衡，才能成功獲得體細(xì)胞胚，形成完整植株。

2.3.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段 胚性愈傷培養(yǎng)作為成功獲得體細(xì)胞胚的重要階段，是體細(xì)胞胚發(fā)生間接途徑必須經(jīng)歷的中間階段。胚性愈傷培養(yǎng)過程中外源激素添加物的重要成分是2,4-D，在番瓜、葡萄、甜櫻桃、桃、板栗、芒果等果樹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中廣泛使用[25]。周麗儂等[23]認(rèn)為，2,4-D雖然對荔枝幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)起決定性作用，但阻礙體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。而在利用中國櫻桃對櫻桃的不定根誘導(dǎo)胚性愈傷組織中，2,4-D起促進(jìn)作用[26]。郝建平等[19]則認(rèn)為，棗胚在2,4-D中2.0 mg/L激素條件下形成愈傷組織再轉(zhuǎn)入ZT 1.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L的培養(yǎng)基中，可獲的淡黃色、顆粒狀胚性愈傷組織。除了2,4-D及其與細(xì)胞分裂素的組合之外，TDZ也能成功獲得體細(xì)胞胚。但TDZ對植物體細(xì)胞胚發(fā)生的作用因植物種類而異，有的促進(jìn)，有的抑制，TDZ對體細(xì)胞胚發(fā)生的作用可能與濃度與處理時間有關(guān)[27]。

2.3.2 體細(xì)胞胚的發(fā)生階段 在胚性愈傷組織的增殖階段，應(yīng)及時去掉或降低生長素濃度，這樣有利于提高增殖率，而且有利于體細(xì)胞胚的發(fā)生。謝玉明等[28]將荔枝花藥培養(yǎng)胚性愈傷組織置于MS培養(yǎng)基上獲得大量的胚狀體，但后期體細(xì)胞胚成熟較慢?；覘椩诩に谺A 0.5 mg/L和NAA 0.01 mg/L的條件下獲得大量的體細(xì)胞胚。六月鮮棗體胚發(fā)生的研究表明，添加2,4-D的培養(yǎng)基未能獲得大量胚狀體，而是在添加IAA的培養(yǎng)基中產(chǎn)生了大量胚狀體。

2.3.3 體細(xì)胞胚的成熟及萌發(fā)階段 一般來說，體細(xì)胞胚一旦分化出來就可以在無激素的培養(yǎng)基上成熟并發(fā)育成植株。如，柿下胚軸誘導(dǎo)形成的體細(xì)胞胚在無激素的培養(yǎng)基中成苗[29]。但許多果樹的體細(xì)胞胚發(fā)育成熟與轉(zhuǎn)化需要一些特殊條件，葡萄體細(xì)胞胚不經(jīng)處理只有3%具有成熟結(jié)構(gòu)[30]。在培養(yǎng)基中添加ABA可促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)[31]。ABA是調(diào)節(jié)胚胎晚期發(fā)育的關(guān)鍵因素，可促進(jìn)胚胎發(fā)育和種子脫水成熟，抑制體細(xì)胞胚的早熟萌發(fā)[32]。ABA在針葉樹種和龍眼、胡蘿卜、玉米、枸杞等植物體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的作用已有較多研究[33]。關(guān)于ABA在果樹體細(xì)胞胚發(fā)生的研究較少。Cochba J.等認(rèn)為，低濃度的ABA可促進(jìn)柑桔體細(xì)胞胚發(fā)育[34]。用10 μmg/L ABA能明顯增加野生櫻桃的白色體細(xì)胞胚的發(fā)生[35]。此外，培養(yǎng)基中添加GA3可提高芒果珠心組織[36]和草莓葉片[37]體細(xì)胞胚的萌發(fā)。

2.4 其他添加物

培養(yǎng)基中有機(jī)附加物、滲透劑的添加等因素也會影響果樹體細(xì)胞胚的發(fā)生、發(fā)育。但不同物質(zhì)的影響在培養(yǎng)不同材料時效果有較大差異。甜櫻桃胚性愈傷組織增殖過程中，添加200 mg/L的水解酪蛋白(CH)可以提高增殖效果[38]。六月鮮棗體細(xì)胞胚萌發(fā)時添加CH100 mg/L可促進(jìn)萌發(fā)成苗。此外，AgNO3水解乳蛋白(LH)、椰乳(CM)的添加也會促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)育。

2.5 環(huán)境條件

合子胚的發(fā)育在生理避光條件下的子房中進(jìn)行，體細(xì)胞胚的發(fā)育與合子胚相似。因此，多數(shù)研究深入開展了光照條件對體胚誘導(dǎo)或發(fā)育的影響。暗處理對于荔枝葉片、草莓葉片、葡萄葉片等果樹胚性愈傷組織有顯著的影響[5]。對蘋果葉片體細(xì)胞發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，黑暗處理有利于體細(xì)胞胚的發(fā)生，光照條件下生長緩慢且多形成畸形胚[39]。而有些研究[40]認(rèn)為在光照條件下利于體細(xì)胞胚的發(fā)生，適宜的培養(yǎng)條件在很大程度上能影響胚性愈傷組織的產(chǎn)生。

3 存在問題和今后的研究方向

體細(xì)胞胚是由體細(xì)胞發(fā)育成的胚，其發(fā)生途徑是細(xì)胞全能性表達(dá)最完全的一種方式。它不僅表明植物體細(xì)胞具有全套遺傳信息，而且重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的進(jìn)程。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚發(fā)生過程都與基因型、外植體、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、激素水平、添加物、培養(yǎng)條件等因素關(guān)系密切。目前，體細(xì)胞胚發(fā)生的研究在基因工程、種質(zhì)、人工種子、苗木快繁、雜種合子胚挽救、多倍體植株誘導(dǎo)、體細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)基因植物培育等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)于果樹的體細(xì)胞胚發(fā)生研究已取得了一定的進(jìn)展，但尚存在外植體取材的篩選、胚性愈傷誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化率低、體細(xì)胞胚發(fā)育不整齊等亟需解決的問題。盡管如此，許多工作者已深入開展體細(xì)胞胚發(fā)生、發(fā)育機(jī)制的研究，并應(yīng)用基因工程以胚狀體為受體獲得核桃、黑核桃、葡萄及梅等多種轉(zhuǎn)基因果樹[5]。今后還需深入研究果樹體細(xì)胞培養(yǎng)各個階段的關(guān)鍵影響因子和作用機(jī)理，為實現(xiàn)基因工程在果樹育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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2016-03-25

山西省青年科技研究基金(2015021163)；棗種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用山西省科技創(chuàng)新重點團(tuán)隊；果樹種質(zhì)創(chuàng)新與利用山西省重點實驗室。

任海燕(1982-)，女，助研，碩士，主要從事棗種質(zhì)資源與育種研究。E-mail：haiyan_101012@163.com

1005-345X(2016)04-0019-04

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