許丁帆，劉艷軍，陶則滿，黃俊軒，李建科，武春霞

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392)

絲綿木(EuonymusmaackiiRupr.)，衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(EuonymusL.)落葉灌木或小喬木，其根、莖、皮、枝、葉、果皆可入藥，具有活血、祛風(fēng)濕、抗腫瘤等作用[1-3]。絲棉木耐貧瘠、耐鹽堿、抗惡劣環(huán)境，具較高的觀賞、藥用價值和較強的空氣凈化能力，極其符合人們追求高質(zhì)量的居住環(huán)境和舒適健康生活的需求，已逐漸成為園林綠化中的主流樹種之一[4]。絲棉木種苗繁育主要以播種[5]、嫁接[6-7]和扦插[8]繁殖為主，雖然這些技術(shù)簡單、成本低，但苗木繁殖效率低，遠不能滿足目前市場需求。因此，進行絲棉木無性快繁技術(shù)研究，提高繁殖系數(shù)，是解決絲棉木種苗不足、保持母樹優(yōu)良性狀的重要途徑。前人分別采用了絲棉木嫩莖、葉片為外植體，通過腋芽增殖和器官發(fā)生途徑開展絲棉木組織培養(yǎng)和植株再生研究，初步建立了絲棉木組培快繁體系[9-12]，但仍存在繁殖系數(shù)低等缺陷，尚未能推廣應(yīng)用。

利用體細胞胚胎發(fā)生途徑進行植物繁殖較器官發(fā)生途徑具有較高的遺傳穩(wěn)定性，能保持無性系母本的優(yōu)良性狀，有利于優(yōu)良無性系苗木的規(guī)?；a(chǎn)，在種質(zhì)資源繁殖與保存方面的應(yīng)用前景廣闊[13]。而松散型胚性愈傷組織是胚胎形成的前體和體細胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵材料，是研究胚胎起源、植物再生過程生理、分子和形態(tài)的理想材料[14-15]。建立絲棉木松散型胚性愈傷組織培養(yǎng)體系，可應(yīng)用于絲棉木良種繁育、體細胞離體誘變育種、遺傳轉(zhuǎn)化及其次生代謝物生產(chǎn)等研究。目前，未見關(guān)于絲棉木胚性愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)報道。本試驗以絲棉木莖段為外植體，建立絲棉木松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系，為絲棉木工廠化繁育、遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及藥用有效成分生產(chǎn)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用絲棉木植株生長于天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)敏學(xué)樓西北側(cè)花壇內(nèi)，于2020年6月中旬剪取絲棉木植株中上部生長健壯、無病蟲害的枝條備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒

將絲棉木枝條在超凈臺中剪成約1～2 cm的莖段，每個莖段上帶1～2個腋芽，70%(V/V)乙醇消毒30～35 s，2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，期間不斷搖晃，將消毒后莖段用無菌水反復(fù)沖洗3次，每次沖洗時間10 min，最后用無菌濾紙吸干莖段表面水分，剪去兩端消毒損傷部分，接種至含有125 mg/L 羧芐青霉素鈉的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基附加20.0 g/L蔗糖，待腋芽萌發(fā)。

1.2.2 絲棉木松散型愈傷組織的誘導(dǎo)

接種15 d后絲棉木腋芽萌發(fā)后快速生長，剪取其幼嫩莖段，長約0.5 cm，接種到不同的松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度BA、2,4-D(表1)，所有培養(yǎng)基均添加30.0 g/L蔗糖和7.0 g/L瓊脂粉，滅菌前調(diào)節(jié)pH至5.8，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。試驗采用100 mL廣口三角瓶為容器，瓶中加入40 mL培養(yǎng)基，每種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶接種絲棉木莖段5個，試驗重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為：(25±2) ℃，24 h光照，光照強度1 000 Lx。30 d后統(tǒng)計各處理愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 不同類型培養(yǎng)基中2,4-D及BA濃度Tab.1 2,4-D and BA concentrations in different types of media mg/L

1.2.3 絲棉木胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將誘導(dǎo)的松散型愈傷組織從外植體上切下，大小約為0.25 cm3，選擇生長狀態(tài)基本一致的愈傷組織分別接種至不同的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的BA、2,4-D，培養(yǎng)基蔗糖、瓊脂粉添加量與滅菌方法同1.2.2。試驗重復(fù)3次，每5瓶胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為一個小區(qū)，每瓶接種5塊愈傷組織。培養(yǎng)條件為(23±2) ℃，連續(xù)光照，光照強度2 000 Lx。接種后每天觀察愈傷組織生長情況，40 d后取少量愈傷組織采用醋酸洋紅染色，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以大拇指緊壓蓋玻片，使材料分散壓平，使用Leica DM 2000顯微鏡觀察愈傷組織的胚性情況。

1.2.4 絲棉木松散型胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)

選擇胚性愈傷組織邊緣新長的結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地硬脆的愈傷組織，用鑷子分散成約0.25 cm3的小塊，選擇生長狀態(tài)一致的愈傷組織接種到絲棉木松散型胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上。每15 d繼代培養(yǎng)一次，每次繼代培養(yǎng)時選擇愈傷組織邊緣新長的愈傷組織，每次繼代培養(yǎng)后結(jié)合顯微鏡壓片觀察愈傷組織胚性保持情況，5次繼代培養(yǎng)后記錄愈傷組織生長速度、結(jié)構(gòu)質(zhì)地與顏色。培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基，改變培養(yǎng)基中BA與2,4-D的濃度，蔗糖、瓊脂粉添加量與配制方法同1.2.2。培養(yǎng)條件同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

愈傷組織誘導(dǎo)率%=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS Statistic 17.0進行數(shù)據(jù)分析，Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物激素濃度配比對愈傷組織形成的影響

由表2可知，絲棉木莖段在含不同激素的培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生愈傷組織，且愈傷組織誘導(dǎo)率之間差異不顯著；同時，外植體在不含植物激素的培養(yǎng)基上也能產(chǎn)生愈傷組織，說明絲棉木莖段外植體極易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。但從愈傷組織生長情況來看，不同培養(yǎng)基間差異較大。在不含激素的MS培養(yǎng)基上，莖段外植體傷口部位20 d后才出現(xiàn)綠色的愈傷組織，且愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密、質(zhì)地硬，生長速度緩慢，這種愈傷組織一般很難誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織。在含有一定濃度2,4-D的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，莖段外植體快速膨大，7 d后即出現(xiàn)愈傷組織，且愈傷組織生長速度均較不含激素的培養(yǎng)基上愈傷組織的生長速度明顯加快，愈傷組織生長速度隨著2,4-D濃度的升高而明顯提高，說明2,4-D有利于愈傷組織誘導(dǎo)并促進愈傷組織的生長。當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 2,4-D時，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密、質(zhì)地較硬(圖1B)；當(dāng)2,4-D濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬；當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg/L時，誘導(dǎo)出的為白色松軟型愈傷組織(圖1A)。這說明愈傷組織結(jié)構(gòu)會隨著2,4-D濃度的提高而逐漸變松散，愈傷組織質(zhì)地隨著2,4-D濃度的提高而變軟。當(dāng)培養(yǎng)基中2,4-D濃度為1.0 mg/L時可誘導(dǎo)出結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的愈傷組織(圖1C)，適于繼續(xù)誘導(dǎo)胚性愈傷組織；在此基礎(chǔ)上附加一定濃度BA時，愈傷組織結(jié)構(gòu)變得緊密，顏色轉(zhuǎn)為綠色，這種愈傷組織雖可進一步誘導(dǎo)再生，但由于其結(jié)構(gòu)緊密不適合進一步誘導(dǎo)松散型胚性愈傷組織。因此，附加1.0 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基為絲棉木松散型愈傷組織誘導(dǎo)的理想培養(yǎng)基。

表2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織形成的影響Tab.2 Effects of different induction media on callus induction

圖1 不同類型的愈傷組織注：A為結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較軟的半透明狀愈傷組織，B為結(jié)構(gòu)緊密、質(zhì)地較硬的愈傷組織，C為結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的愈傷組織，D為結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的胚性愈傷組織。Fig.1 Different types of callus

2.2 不同植物激素濃度配比對胚性愈傷組織形成的影響

由表3可知，不同培養(yǎng)基上愈傷組織胚性情況、愈傷組織特性與生長速度存在較大差異。當(dāng)繼續(xù)在松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，即只附加1.0 mg/L 2,4-D時，愈傷組織保持較快速度的增殖生長，為結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的白色愈傷組織，但顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)此類愈傷組織未能被醋酸洋紅染色，且細胞較大，細胞質(zhì)濃度低、液泡較大，為典型的非胚性愈傷組織(圖2A)。在培養(yǎng)基中只附加一定濃度的BA時，愈傷組織質(zhì)地堅硬，結(jié)構(gòu)緊密，顏色逐漸變綠，生長速度緩慢，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)此類愈傷組織多數(shù)內(nèi)部組織化且分化出了厚壁組織、導(dǎo)管等，此類愈傷組織已經(jīng)失去薄壁細胞的特點，分化為成熟組織，僅愈傷組織表層有少量分生組織細胞。當(dāng)培養(yǎng)基中BA和2,4-D的比值較高時，即MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D時，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密、質(zhì)地較硬，僅愈傷組織部分邊緣細胞可被醋酸洋紅染色，染色的細胞體積小、細胞核大、胞質(zhì)濃，表現(xiàn)為胚性細胞特性(圖2B)；而當(dāng)培養(yǎng)基中BA和2,4-D的比值較低時，即MS+0.5 mg/L BA+1.0 mg/L 2,4-D，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬，僅少數(shù)細胞可被醋酸洋紅染色，表現(xiàn)為胚性細胞特性。當(dāng)培養(yǎng)基中BA和2,4-D的比值一致時，即MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D上，愈傷組織能夠被醋酸洋紅溶液染為紅色，為典型的胚性愈傷組織特征，且此時愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬(圖2D)，生長速度也較快。因此，MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D為絲棉木松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)的理想培養(yǎng)基。

表3 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對胚性愈傷組織形成的影響Tab.3 Effects of different induction media on embryogenic callus induction

圖2 愈傷組織顯微觀察注：A為非胚性愈傷組織，B為胚性愈傷組織。Fig.2 Microscopic observation of callus

2.3 不同植物激素濃度配比對松散型胚性愈傷組織增殖的影響

由表4可知，當(dāng)松散型胚性愈傷組織繼續(xù)在原培養(yǎng)基中長期繼代培養(yǎng)，胚性愈傷組織會隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而逐漸喪失胚性，愈傷組織出現(xiàn)組織化現(xiàn)象且愈傷組織結(jié)構(gòu)變得越來越緊密。當(dāng)培養(yǎng)基只加入2,4-D，胚性愈傷組織胚性很難保持，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而逐漸變軟，說明單獨使用2,4-D不利于胚性愈傷組織維持胚性。當(dāng)采用0.5 mg/L BA+1.0 mg/L 2,4-D激素組合和0.25 mg/L BA+1.0 mg/L 2,4-D時，愈傷組織隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而逐漸變松散，但愈傷組織質(zhì)地也隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而逐漸變軟，同時愈傷組織胚性會隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而逐漸喪失，說明高濃度2,4-D不利于胚性愈傷組織的保持。當(dāng)采用0.25 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D組合時，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加愈傷組織結(jié)構(gòu)保持松散且愈傷組織質(zhì)地也較硬脆，篩選結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地硬脆的胚性愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)后，愈傷組織表面出現(xiàn)一些瘤狀顆粒，且結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地緊密，通過顯微鏡觀察愈傷組織細胞個體較小、細胞質(zhì)濃度大、細胞核大，為典型的胚性愈傷組織特征；并且在此激素組合的培養(yǎng)基上，松散型胚性愈傷組織可以穩(wěn)定增殖，生長速度較快且保持胚性。因此，理想的絲棉木松散型胚性愈傷組織增殖與保持培養(yǎng)基配方為：MS+0.25 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D。

表4 不同增殖培養(yǎng)基對松散型胚性愈傷組織胚性保持的影響Tab.4 Effects of different propagation media on embryogenic retention of loose embryogenic callus

3 討論與結(jié)論

松散型胚性愈傷組織是體細胞離體誘變和基因轉(zhuǎn)化研究的理想試材。但誘導(dǎo)松散型胚性愈傷組織過程復(fù)雜，會受到激素、繼代時間、培養(yǎng)條件等因素的影響[16-17]。本試驗主要通過調(diào)整培養(yǎng)基中的激素水平最終獲得絲棉木松散型胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)適宜濃度的2,4-D會加快愈傷組織形成，并有利于形成結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織，但2,4-D濃度過高會導(dǎo)致愈傷組織質(zhì)地變軟，最終導(dǎo)致細胞褐化死亡。這與霍云謙[18]在誘導(dǎo)甘草(Glycyrrhizauralensis)愈傷組織時發(fā)現(xiàn)隨著2,4-D濃度的提高愈傷組織褐化程度加重，認為2,4-D使用濃度不宜過高的結(jié)論相一致。

BA作為外源激素可改善細胞內(nèi)源生長素和細胞分裂素的比例，調(diào)節(jié)細胞生理生化狀態(tài)，有利于胚性愈傷組織的發(fā)生。有研究表明[19-20]，培養(yǎng)基中2,4-D與BA配合使用有利于胚性愈傷組織發(fā)生。本試驗單獨使用2,4-D或BA均不能獲得胚性愈傷組織，但當(dāng)BA配合使用2,4-D時，愈傷組織胚性化；當(dāng)培養(yǎng)基中2,4-D濃度較BA濃度高或低時，愈傷組織胚性化程度均較低；當(dāng)采用相同濃度的2,4-D和BA，即含有0.5 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BA的培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的胚性愈傷組織。史滟滪等[21]認為2,4-D在愈傷組織胚性化過程中起決定性作用，在一定濃度范圍內(nèi)濃度的增加有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，2,4-D濃度過高或過低均不利于胚性愈傷組織的形成和分化再生。因此，在誘導(dǎo)胚性愈傷組織時需要注意BA和2,4-D的配比使用量，2,4-D比例過高時，愈傷組織繼續(xù)保持薄壁細胞特性；BA比例過高會導(dǎo)致愈傷組織老化，失去愈傷組織特性，分化出不定芽等組織結(jié)構(gòu)。

適時的繼代培養(yǎng)和繼代選擇是獲得均質(zhì)的松散型胚性愈傷組織的關(guān)鍵。在胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中，要對胚性愈傷組織進行繼代選擇，否則會造成胚性與非胚性愈傷組織、松散型與緊密型的愈傷組織混合繼代，則很難獲得均質(zhì)的松散型胚性愈傷組織。在胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中，胚性愈傷組織退化是不可避免的，部分胚性愈傷組織可能會因為一些非胚性細胞的競爭優(yōu)勢而喪失胚性。閔義等[22]認為非胚性細胞容易占據(jù)生長的優(yōu)勢，應(yīng)及早對胚性愈傷組織進行篩選，剔除非胚性愈傷組織，對保持接種物的均勻十分重要。因此，在繼代培養(yǎng)時需結(jié)合顯微鏡觀察，判斷愈傷組織胚性，有目的篩選結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地硬脆的胚性愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，可加快獲得均質(zhì)的松散型胚性愈傷組織。同時，胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)周期也會對其產(chǎn)生影響，繼代培養(yǎng)周期過長可能會由于培養(yǎng)基營養(yǎng)不足等原因，導(dǎo)致胚性愈傷組織喪失胚性；而繼代培養(yǎng)周期過短會增加工作量，對愈傷組織造成機械損傷，不利于愈傷組織生長。

本試驗建立了一套高效的絲棉木松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系，總結(jié)如下：以不帶腋芽的絲棉木幼嫩莖段為外植體，在MS+1.0 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出松散型愈傷組織；將松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上，經(jīng)過30 d培養(yǎng)即可獲得胚性愈傷組織；將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+0.25 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上，每15 d繼代培養(yǎng)一次，繼代時選擇結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的愈傷組織進行繼代，2～3次繼代培養(yǎng)后即可獲得均質(zhì)的絲棉木松散型胚性愈傷組織。本試驗結(jié)果可用于絲棉木的組培快繁、離體誘變育種及遺傳轉(zhuǎn)化等研究。