楊 剛 綜述,尹 寧 審校

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830002)

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·綜 述·

革蘭陰性桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

楊 剛 綜述,尹 寧△審校

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830002)

革蘭氏陰性菌； 抗菌藥; 藥物耐受性; 碳青霉烯類(lèi)

革蘭陰性桿菌是感染性疾病特別是住院患者醫(yī)院感染的主要病原菌，臨床分離的致病性多重耐藥的革蘭陰性桿菌中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌占據(jù)前幾位。隨著臨床抗生素的濫用，該類(lèi)細(xì)菌不僅對(duì)常用抗生素耐藥，而且對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥率也逐年上升。現(xiàn)將耐碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

1 碳青霉烯酶對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制

碳青霉烯酶是指能明顯水解亞胺培南或美羅培南的一類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶，是β-內(nèi)酰胺酶家族中最多變的成員，但碳青霉烯類(lèi)藥物并非其唯一水解底物。碳青霉烯酶根據(jù)活性部位水解機(jī)制分為兩種主要的分子家族：一種來(lái)源于革蘭陽(yáng)性桿菌，可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制，稱(chēng)為金屬酶(MBLs)，其活性部位含有Zn2+有助于水解β-內(nèi)酰胺的雙環(huán)；另一種最初發(fā)現(xiàn)于腸桿菌科細(xì)菌，其活性部位含有絲氨酸，該類(lèi)碳青霉烯酶能被克拉維酸和他唑巴坦抑制，但不能被EDTA抑制。按照分子類(lèi)型可將碳青霉烯酶分為Ambler A、B、D類(lèi)[1]，A、D類(lèi)活性中心有絲氨酸，又稱(chēng)為絲氨酸酶，屬于Bush分群中的第2f、2d亞組。B類(lèi)活性中心含有Zn2+，稱(chēng)為MBLs。屬于Bush分群中的第3組，可由染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子介導(dǎo)。

1.1 A類(lèi)碳青霉烯酶 最主要的A 類(lèi)絲氨酸碳青霉烯酶有3個(gè)家族即SME(serratia marcescens enzyme)、KPC(klebsiella pneumoniae carbapenemases)和NMC(non-metallo carbapenemases)/IMI(imipenemas)，均由染色體編碼，其水解機(jī)制是在活性中心70號(hào)位含有絲氨酸。SME家族包括 SME-1、SME-2、SME-3。SME-1是在1982年發(fā)現(xiàn)于英格蘭的2株黏質(zhì)沙雷菌。NMC、IMI酶有97%氨基酸是相同的，其均含有相同的活性部位保守序列S-X-X-K、S-D-N和K-T-G，且在其氨基酸殘基的69、238號(hào)位形成二硫鍵。這種二硫鍵普遍存在于A類(lèi)碳青霉烯酶，不僅對(duì)其水解活性十分必要，而且能夠穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)[2]。在NMC-A、IMI-1和 SME-1基因編碼區(qū)的上游存在與LysR家族有關(guān)的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，當(dāng)刪除nmcR調(diào)控基因時(shí)就可消除NMC-A的誘導(dǎo)表達(dá)并可降低碳青霉烯類(lèi)藥物對(duì)其的最低抑菌濃度(MIC)。

KPC、GES(guiana extended-spectrum β-lactamase)均由質(zhì)粒編碼，KPC-1于1996年發(fā)現(xiàn)于北卡羅來(lái)納，2003年在美國(guó)東海岸發(fā)現(xiàn)了KPC-1的變體KPC-2，其由單個(gè)氨基酸突變所致，隨后KPC在蘇格蘭、哥倫比亞、以色列[3]、中國(guó)等國(guó)家均有報(bào)道。KPC含有活性部位保守序列S-X-X-K、S-D-N和K-T-G。有研究顯示，對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物敏感率下降的肺炎克雷伯菌均產(chǎn)KPC-2，KPC基因位于可移動(dòng)的質(zhì)粒上，可以通過(guò)質(zhì)粒、整合子、插人序列的基因元件進(jìn)行水平傳播，造成暴發(fā)流行。有研究發(fā)現(xiàn)，blaOXA(編碼OXA的基因)基因位于耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌質(zhì)粒上，較位于染色體上更容易發(fā)生播散。GES/IBC(integron-borne cephalosporinase)家族并不常見(jiàn)，IBC-1在2000年發(fā)現(xiàn)于希臘，GES-1則分離于法屬圭亞那的1株肺炎克雷伯菌，該2種酶在活性序列的69、38號(hào)位含有半胱氨酸殘基。編碼GES家族的基因位于質(zhì)粒的整合子上，該類(lèi)酶具有很廣的水解譜，目前該家族成員眾多，GES-2、GES-3、GES-4、GES-5、GES-6、GES-7、GES-8、GES-9相繼被鑒定出來(lái)。

1.2 B類(lèi)碳青霉烯酶 B類(lèi)碳青霉烯酶因活性中心含有Zn2+，也稱(chēng)為MBLs。MBLs首先在銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌中被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)在腸桿菌科細(xì)菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌中也有發(fā)現(xiàn)。MBLs編碼的耐藥基因位于細(xì)菌染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上。并以基因盒的形式存在于整合子中。整合子屬于可移動(dòng)基因元件。可借助整合子的移動(dòng)、基因盒的插入、切除而導(dǎo)致細(xì)菌間耐藥性呈水平傳播[4]，MBLs有較強(qiáng)的水解碳青霉烯類(lèi)藥物的能力且對(duì)常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有抵抗作用。常見(jiàn)的MBLs有VIM(verona integron-encoded metallo-β-lactamase)、IMP(imipenemase)、GIM(german imipenemase)和SIM(seoul imipenemase)，其位于各種整合子結(jié)構(gòu)上，當(dāng)這些整合子與質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子結(jié)合時(shí)就會(huì)介導(dǎo)在各細(xì)菌間傳播。第1例可轉(zhuǎn)移性MBLs基因于1990年發(fā)現(xiàn)于日本的1株銅綠假單胞菌，隨后各種獲得性或轉(zhuǎn)移性MBLs基因相繼被發(fā)現(xiàn)[5]。IMP-1能水解亞胺培南、青霉素和廣譜頭孢菌素，但不能水解氨曲南，最早分離于日本的沙雷菌和其他腸桿菌科，在意大利則在鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)現(xiàn)與IMP-1相似的IMP-2[6]，隨后IMP家族成員在世界各地被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。目前IMP已多達(dá)34種。Ⅰ類(lèi)整合子是耐藥基因DNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，還可整合其他耐藥基因如氯霉素、氨基糖苷類(lèi)基因，但其自身不能傳播而是通過(guò)識(shí)別內(nèi)部轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)來(lái)傳播。VIM家族的編碼基因位于染色體的Ⅰ類(lèi)整合子上，1997年VIM-1在意大利維羅納被發(fā)現(xiàn)，隨后其變體VIM-2在法國(guó)被發(fā)現(xiàn)，二者均分離自銅綠假單胞菌。雖然二者氨基酸序列同源性很高(90%)，但結(jié)構(gòu)明顯不同，這也導(dǎo)致了其酶促動(dòng)力學(xué)的顯著差異。目前VIM家族種類(lèi)多達(dá)15種，其耐藥基因位于相應(yīng)的Ⅰ類(lèi)整合子內(nèi)[7]。其他MBLs還有SPM(sao paulo metallo-β-lactamase)、GIM和SIM，其只在所發(fā)現(xiàn)國(guó)家局部傳播并未造成世界范圍的流行。這有別于VIM和IMP。SPM-1分離自圣保羅的銅綠假單胞菌，含有該酶的銅綠假單胞菌所致的感染有較高的致死率，其與IMP-1有35.5%氨基酸是相同的，能被EDTA、吡啶二羧酸、二氮雜菲抑制，能水解大多數(shù)廣譜抗生素，主要在拉美國(guó)家流行。通過(guò)對(duì)SPM-1的編碼基因區(qū)域分析顯示，該區(qū)域不是整合子的一部分，而是含有一種新型的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子序列[8]。近年來(lái)新型MBLs被發(fā)現(xiàn)如TMB-1(tripoli metallo-blactamase)，該酶來(lái)自于利比亞的1株木糖氧化無(wú)色桿菌。TMB-1與DIM-1、GIM-1同源性分別為62%、51%，blaTMB-1位于染色體上并可嵌入到Ⅰ類(lèi)整合子中。2011年在日本發(fā)現(xiàn)了blaTMB-1 的變體blaTMB-2，多利培南和美羅培南對(duì)產(chǎn)TMB-2轉(zhuǎn)化株的MIC較TMB-1轉(zhuǎn)化株分別高256、16倍，有更強(qiáng)的耐藥性[9]。

1.3 D類(lèi)碳青霉烯酶 D類(lèi)酶也稱(chēng)為OXA酶(oxacillin-hydrolyzing)，主要存在于腸桿菌科和銅綠假單胞菌屬，由質(zhì)粒編碼。該類(lèi)酶很少能被克拉維酸和EDTA抑制。由于其氨基酸序列存在大量可變性，導(dǎo)致有很多變體，目前已知有232種變體[10]。絕大多數(shù)OXA酶發(fā)現(xiàn)于不動(dòng)桿菌屬，根據(jù)氨基酸同源性將其分為9個(gè)亞組。通過(guò)對(duì)OXA酶分子結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，催化絲氨酸殘基位于70～73號(hào)位的S-T-F-K序列，而A、D類(lèi)酶的絲氨酸和賴(lài)氨酸均位于此。其水解機(jī)制與其他絲氨酸碳青霉烯酶相同，底物和酶結(jié)合，在催化絲氨酸部位形成共價(jià)?；?，隨后通過(guò)脫酰基作用在β內(nèi)酰胺環(huán)的C-N結(jié)合處而水解抗生素使其失活。某些D類(lèi)酶需要一定濃度的CO2，因?yàn)镃O2可影響Lys70的羧化作用。2003年在土耳其1株肺炎克雷伯菌中分離的OXA-48對(duì)亞胺培南的水解效率較分離于不動(dòng)桿菌屬的OXA酶高9倍，對(duì)其分子動(dòng)力學(xué)及晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，其水解作用依賴(lài)于碳青霉烯類(lèi)藥物的α-羥乙基的旋轉(zhuǎn)，在活性部位脫去酰基并以此?；被釟埢鵞11]。編碼OXA-48基因blaOXA-48(編碼OXA-48的基因)通過(guò)可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒在各菌種間傳播[12]。鮑曼不動(dòng)桿菌中的OXA-23、OXA-58通過(guò)將OXA質(zhì)粒介導(dǎo)入易感碳青霉烯類(lèi)藥物中而具有耐藥作用[13]。

2 外排泵系統(tǒng)耐藥機(jī)制

細(xì)菌外排系統(tǒng)是一種非特異性耐藥機(jī)制，是通過(guò)細(xì)菌外排泵將進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物或其他底物排出膜外，已在不同細(xì)菌上發(fā)現(xiàn)幾十種外排泵，依據(jù)氨基酸序列的同源性，將與抗菌藥物相關(guān)的膜外排泵分子分為5個(gè)主要超家族[14]，包括主要易化子超家族(Mrs)、ATP結(jié)合盒(ABC)超家族、耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化(RND)超家族、小多重耐藥性(SMR)家族，多藥和有毒化合物排出(MATE)家族。其中RND超家族在革蘭陰性桿菌耐藥中發(fā)揮重要作用如大腸埃希菌中的AcrAB-TolC系統(tǒng)和銅綠假單胞菌中的MexAB-OprM系統(tǒng)。

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌的外排系統(tǒng) AdeABC外排系統(tǒng)是鮑曼不動(dòng)桿菌中認(rèn)識(shí)最早的外排系統(tǒng)。國(guó)外有極少數(shù)研究提示，AdeABC外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)可引起菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素如亞胺培南和美羅培南的高水平耐藥。AdeABC外排泵系統(tǒng)屬于RND超家族，AdeB為內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，AdeC為外膜蛋白(OMP)，AdeA為膜融合蛋白(MFP)，其共同組成三聚體結(jié)構(gòu)，形成一連續(xù)通道跨在外膜和周質(zhì)之間[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，AdeC對(duì)耐藥無(wú)本質(zhì)意義，并非必需。AdeAB共同轉(zhuǎn)錄并可利用另一外膜蛋白質(zhì)來(lái)形成外排泵通道。AdeFGH外排泵是近年新發(fā)現(xiàn)的由AdeF、AdeG、AdeH共同轉(zhuǎn)錄編碼一個(gè)RND超家族的外排系統(tǒng)[16]，表現(xiàn)出對(duì)氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素、氯霉素、甲氧芐啶、磺胺甲基異惡唑、十二烷基硫酸鈉(SDS)和某些染料外排的增強(qiáng)。有研究顯示，AdeFGH外排系統(tǒng)在鮑曼不動(dòng)桿菌的亞胺培南耐藥中發(fā)揮作用。

2.2 大腸埃希菌的外排系統(tǒng) AcrAB-TolC系統(tǒng)是大腸埃希菌產(chǎn)生多藥耐藥性最重要的系統(tǒng)之一，屬于質(zhì)子依賴(lài)型，能同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)有機(jī)溶劑、染料、去污劑及多種抗菌藥物(如氯霉素、紅霉素、四環(huán)素等)的高水平的多重耐藥。AcrAB-TolC系統(tǒng)主要由3個(gè)部分組成，即膜融合蛋白(AcrA)、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)。這些組分及其類(lèi)似物是大多數(shù)革蘭陰性菌產(chǎn)生對(duì)多種抗菌藥物、染料和去污劑等多重耐藥的主要機(jī)制。AcrB主要的功能域?yàn)槿垠w，且包含1個(gè)大的細(xì)胞周質(zhì)域?yàn)榈湫吞卣鱗17]，細(xì)胞周質(zhì)域的每個(gè)亞基的構(gòu)象有細(xì)微的差別，均具有1個(gè)底物識(shí)別位點(diǎn)，但在特定的時(shí)間只有1個(gè)位點(diǎn)(binding site)被底物所占據(jù)，排出位點(diǎn)緊鄰周質(zhì)但開(kāi)放于TolC對(duì)接域，將底物推入TolC外排；接入位點(diǎn)(access site)緊鄰TolC但開(kāi)放于周質(zhì)，準(zhǔn)備接受底物。該3個(gè)周質(zhì)域的構(gòu)象由上述3個(gè)位點(diǎn)輪流替換，形成1個(gè)類(lèi)似蠕動(dòng)泵的機(jī)制將底物排出細(xì)胞外。AcrA蛋白的作用主要是促進(jìn)外排體系與細(xì)胞膜的融合。AcrB 能識(shí)別外排藥物并通過(guò)構(gòu)象改變形成質(zhì)子和藥物分子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的能量轉(zhuǎn)化體[18]。AcrAB的表達(dá)受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，分為全局和局部2個(gè)調(diào)控層次。

2.3 銅綠假單胞菌的外排系統(tǒng) 銅綠假單胞菌中的外排泵主要有 MexAB-OprM、MexCD-OprJ、exEF-OprN和MexXY-OprM，每一種外排泵都包括3個(gè)部分：(1)內(nèi)膜蛋白如 MexB、MexY，其嵌在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜，可識(shí)別抗菌藥物并將其主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)出去；(2)OMP如OprM、OprN，二者均位于細(xì)胞外膜具有孔蛋白的作用，可將抗菌藥物排出菌體外；(3)膜融合蛋白如MexA、MexX等，位于內(nèi)、外膜之間，可連接內(nèi)、外膜。3種蛋白相互連接橫貫整個(gè)細(xì)胞膜并開(kāi)口于外膜，將抗菌藥物排出菌體[19]。

3 與膜孔蛋白有關(guān)的耐藥機(jī)制

革蘭陰性菌被一層具有通透性的外膜包繞，約60%表面覆蓋膜孔蛋白，其聚合起來(lái)形成孔道。大多數(shù)抗生素發(fā)揮活性的決定性因素并不單純?nèi)Q于外膜的通透性或抗生素的失活，而是取決于二者之間的平衡，外膜通透下降可以放大酶失活造成的抗生素耐藥效應(yīng)。

膜孔蛋白是OMP中的一類(lèi)，大腸埃希菌的膜孔蛋白主要有5種：OmpF、OmpC、PhoE、LamB和蛋白K。大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素可通過(guò)的膜孔蛋白主要為OmpF、OmpC，而OmpF的通透性較OmpC高10倍。膜孔蛋白的變異可引起細(xì)菌對(duì)抗生素敏感率下降。肺炎克雷伯菌的膜孔蛋白有OmpK35、OmpK36和OmpK37，OmpK35、OmpK36相當(dāng)于大腸桿菌中的OmpF、OmpC。OmpK37一般情況下不表達(dá)或表達(dá)量極少。OmpK35是細(xì)菌發(fā)生耐藥最主要的膜孔蛋白。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，膜孔蛋白缺失這一單獨(dú)因素并不能引起對(duì)亞胺培南的耐藥。對(duì)大腸埃希菌來(lái)說(shuō)OMP缺失合并CMY-4、CMY-2、CTX-M-2等可造成其對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥[21]。

外膜孔蛋白D2(OprD2)是亞胺培南通過(guò)銅綠假單胞菌的特異性孔道，編碼OprD2的結(jié)構(gòu)基因位于染色體上，突變可使OprD2蛋白表達(dá)減少甚至缺失，從而導(dǎo)致菌體外膜通透性改變使得碳青霉烯類(lèi)藥物進(jìn)入菌體受阻，產(chǎn)生耐藥性。此外OprD2還能形成碳青霉烯類(lèi)藥物特異性結(jié)合位點(diǎn)，是目前所知的銅綠假單胞菌中唯一有助于抗菌藥物通過(guò)的孔道蛋白[22]。OprD2缺失引起亞胺培南耐藥，而將克隆有OprD2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入OprD2缺失的亞胺培南耐藥株中可使其恢復(fù)對(duì)亞胺培南的耐藥性并在細(xì)胞膜上表達(dá)OprD蛋白[23]。在銅綠假單胞菌中存在大、小2種孔道蛋白，而大孔通道數(shù)量較少或僅有小孔通道，導(dǎo)致銅綠假單胞菌外膜通透性降低，產(chǎn)生耐藥性[24]。

4 與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)有關(guān)的耐藥機(jī)制

PBPs是一組位于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上的具有催化作用的酶，在細(xì)菌的細(xì)胞壁合成中起關(guān)鍵作用。在PBPs中大分子PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3為β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物作用靶位。當(dāng)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物與這些靶位結(jié)合后可使轉(zhuǎn)肽酶、轉(zhuǎn)糖苷酶的活性丟失，細(xì)菌的細(xì)胞壁不能合成，細(xì)菌死亡[25]?？梢?jiàn)當(dāng)PBPs基因發(fā)生變異導(dǎo)致蛋白改變，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素?zé)o法與之結(jié)合或結(jié)合能力降低均可能導(dǎo)致耐藥。銅綠假單胞菌中有8種不同PBPs，其中PBP2、PBP3與碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥性有關(guān)，是細(xì)菌保持正常形態(tài)及生存繁殖必需的[26]。Farra等[27]研究結(jié)果顯示臨床分離的對(duì)亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌耐藥性與PBP位點(diǎn)改變密切相關(guān)。另一方面PBPs可參與頭孢菌素酶(AmpC酶)表達(dá)從而產(chǎn)生耐藥性，這些PBPs均是非必需PBP如在大腸埃希菌中PBP4過(guò)表達(dá)導(dǎo)致AmpC酶高產(chǎn)，而PBP4失活使其對(duì)AmpC酶誘導(dǎo)能力減弱，PBP4有誘導(dǎo)AmpC酶產(chǎn)生的作用[28]。

5 其 他

細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥往往是多種機(jī)制共同發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)1株耐碳青霉烯類(lèi)藥物的大腸埃希菌研究顯示，其缺少OmpF、OmpC，并攜帶有耐藥基因marR和功能性非翻譯基因yedS[29]。其所表達(dá)的蛋白marR和yedS被認(rèn)為可耐碳青霉烯類(lèi)藥物。在大腸埃希菌中操縱子marRAB能編碼marR、marA和marB。而marA過(guò)度表達(dá)可正向調(diào)節(jié)外排泵AcrAB-TolC，使之表達(dá)增加，外排作用增強(qiáng)；另一方面marA可通過(guò)MicF這種小RNA來(lái)抑制OmpF，使其對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥。

6 結(jié) 語(yǔ)

革蘭陰性桿菌耐碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制是復(fù)雜的，往往多種機(jī)制共同發(fā)揮作用。革蘭陰性桿菌種類(lèi)繁多，有些耐藥基因可通過(guò)質(zhì)粒在各細(xì)菌間相互傳播，導(dǎo)致新的變體的出現(xiàn)。另一方面抗生素的濫用也會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生新的耐藥基因，造成耐藥率不斷升高。有些細(xì)菌自身外排泵高表達(dá)，孔道蛋白的改變也會(huì)對(duì)碳青霉烯酶類(lèi)藥物耐藥。因此，在臨床要加強(qiáng)對(duì)該類(lèi)細(xì)菌的監(jiān)測(cè)，根據(jù)細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗生素。

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新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(XJC2012142)。 作者簡(jiǎn)介：楊剛，男，在讀碩士研究生，主要從事病原微生物學(xué)的研究?！?/p>

E-mail：tuguyu@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.034

A

1673-4130(2016)02-0226-04

2015-07-30)