周晏丞,郭玉潔,陳　露,曹立亭,馬　躍

(西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶榮昌 402460)

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體內(nèi)誘導抗原技術(shù)研究進展

周晏丞,郭玉潔,陳露,曹立亭,馬躍

(西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶榮昌 402460)

摘要:體內(nèi)誘導抗原技術(shù)(IVIAT)作為一種新興的體內(nèi)誘導基因篩選技術(shù)，相比其他篩選技術(shù)具有不需要動物模型的顯著優(yōu)勢。大量試驗證實體內(nèi)誘導基因可能與病原微生物在機體內(nèi)生存以及致病性相關，同時其表達產(chǎn)物也是良好的藥物靶標和疫苗候選基因。論文綜述了IVIAT的原理、操作步驟及優(yōu)缺點，由于現(xiàn)階段該技術(shù)在寄生蟲病上應用較少，因此分析了其在寄生蟲病上所具有的優(yōu)勢和可能存在的問題。

關鍵詞:體內(nèi)誘導抗原技術(shù)；體內(nèi)誘導基因; 寄生蟲病

針對細菌病原學和遺傳學的研究在20世紀大部分時間里多集中在體外試驗上，而對細菌在體內(nèi)的作用機制模棱兩可。微生物對機體的致病作用是通過多種方式完成的，是兩者之間的一個繁雜的多因子作用過程，其一是病原菌釋放毒力因子侵襲機體，其二則是機體通過各種防御機制抵御這些毒力因子的作用。由于機體內(nèi)環(huán)境和體外培養(yǎng)條件截然不同，基因表達情況也就存在很大差異，同時病原微生物為了適應環(huán)境變化，會通過調(diào)節(jié)相應基因的表達模式作出適應性反應，即上調(diào)在宿主體內(nèi)存活中起關鍵作用的基因、表達感染宿主所必需的基因,以及下調(diào)某些非必需基因的表達[1]，以優(yōu)化生存能力。對上述在體內(nèi)表達而體外培養(yǎng)時不表達的基因進行探求，可增進對致病菌在機體內(nèi)部生存和致病機理的認知。因此有學者提出以下概念：病原菌感染機體后，在機體內(nèi)被誘導表達的基因就稱為體內(nèi)誘導基因(invivoinduced gene，ivi gene)。體內(nèi)誘導基因有可能是病原微生物感染過程中的毒力基因，往往能增強其在宿主體內(nèi)的生存能力、致病性，甚至決定其毒力強弱[2]，其表達產(chǎn)物同時也可以是非常好的藥物靶標和保護性抗原[3]。毒力基因在宿主體內(nèi)的調(diào)控表達過程一定程度上反應了不同感染階段的環(huán)境變化，但由于技術(shù)限制，還不能完全模擬病原微生物不同感染階段宿主內(nèi)環(huán)境的復雜變化，因此并非所有毒力基因都可以在體外被鑒定。為了解決這一問題，體內(nèi)表達技術(shù)(invivoexpression technology,IVET),信號標簽誘變技術(shù)(signature-tagged mutagenesis,STM)，差異熒光誘導技術(shù)(differential fluorescence induction,DFI)，體外轉(zhuǎn)座進行基因組分析和作圖技術(shù)(GAMB IT)等許多先進技術(shù)應運而生，用于在體內(nèi)鑒定病原菌毒力因子。但是這些技術(shù)同時也具有一些缺陷，如這些技術(shù)都依賴于動物模型。目前并沒有良好的動物模型可用于所有的體內(nèi)誘導基因篩選，如肺炎鏈球菌、結(jié)核分支桿菌、傷寒沙門菌至今沒有合適的動物模型，即便是有，由于感染階段的復雜多樣性，動物模型所模擬的內(nèi)環(huán)境也和宿主體內(nèi)有一定差異，會使篩選結(jié)果產(chǎn)生一定的偏差，同時從動物模型推至人得到的結(jié)果也并不一定可靠。近年來提出的體內(nèi)誘導抗原技術(shù)(invivoinduced antigen technology,IVIAT)則是上述技術(shù)的很好補充。目前，IVIAT 已經(jīng)在禽支原體、流產(chǎn)布魯菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌等多個病原菌的體內(nèi)誘導基因篩選中得到了廣泛的運用。IVIAT可以在在體狀態(tài)下鑒定毒力基因，利用該技術(shù)作為一個平臺來研究在體表達的具有抗原特異性的毒力因子，可以為之后篩選有效的抗原基因，制備高效的動物疫苗奠定基礎。

1體內(nèi)誘導抗原技術(shù)的原理

Handfield M等[4]在2000年口腔放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)研究中首次提出IVIAT。該技術(shù)不需要依賴于動物模型，而是使用實際感染患者的血清來指示病原菌在體內(nèi)的基因表達情況。IVIAT是利用康復期病人的血清作為探針吸附病原菌，以此除去菌體體外表達的抗原，只余下感染階段在機體內(nèi)部誘導表達抗原，從而檢測出體內(nèi)特異性表達的基因。

IVIAT的操作主要包括以下幾點：

首先是病原菌文庫的構(gòu)建。提取病原菌全基因組，用內(nèi)切酶(Sau3AI)部分消化后，回收0.5 kb~1.5 kb片段(也有文獻報道3.5kb的片段也較為有效[5]，插入較大的片段可能不受IPTG誘導，而由原始或局部的啟動子引導表達)，將片段與合適的載體(常用pET30-a/b/c)連接，再將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌Dpα中獲得含有重組子的克隆，洗脫后重新轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中,使用改良后的BL21(DE3)codon plus菌株可以降低密碼子偏好性的影響，檢測插入率與片段大小，作為基因組表達文庫。

其次是康復期血清的處理。收集多個康復期宿主的血清混合，5個~8個是消除免疫差異的最佳組合，同時應注意感染病人的代表性，樣品最好包括不同發(fā)病階段及不同途徑感染病人的血清。用體外培養(yǎng)的病原菌全菌體、超聲裂解物、熱變性裂解處理物對混合血清進行多次(6次以上)吸附，扣除體外培養(yǎng)表達的抗體。由于大腸埃希菌感染的普遍性，宿主血清中不可避免的含有大腸埃希菌的抗體，造成篩選的假陽性。因此，同時需要用文庫載體菌的全菌體和細胞裂解物以及熱變性裂解物對血清吸附1次~2次，以除去假陽性的可能。注意應在宿主血清中加入復合蛋白酶抑制劑，以充分消除細菌培養(yǎng)物中蛋白酶對血清中抗體的降解。

第三步是文庫的免疫篩選。將上述構(gòu)建的文庫標記轉(zhuǎn)印到NC膜上，用吸附處理過后的血清進行多次菌落免疫篩選，獲得顯色明顯的陽性克隆。對篩選出的陽性克隆插入序列進行測序，并對測序結(jié)果進行分析比對，即可得到編碼該致病菌體內(nèi)表達抗原的基因序列。因為體內(nèi)誘導表達的抗原基因在體外是不轉(zhuǎn)錄的，用RT-PCR技術(shù)對陽性克隆進行再次驗證，可以保證克隆結(jié)果的正確性[6]。

2IVIAT的應用

自IVIAT問世以來，已成功運用于病原菌感染人體后，在機體產(chǎn)生的體內(nèi)誘導抗原基因的篩選研究中。同樣，在動物病原菌研究方面，也有越來越多的報道。

2.1IVIAT在人類疾病方面的應用

Deb D K等[7]在2002年構(gòu)建了結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)p7Rv基因組文庫，利用結(jié)核病康復期病人的血清吸附體外培養(yǎng)的p7Rv菌株，共篩選出6個在體誘導表達基因，其中rv0287、rv387、rv2402和rv1045為假想功能蛋白，在數(shù)據(jù)庫中并未發(fā)現(xiàn)與其高度同源的序列，dnaQ(rv3711c)負責編碼具有校對功能的DNA聚合酶Ⅲ的小部分亞基，lpdA(rv3303c)負責編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶。研究發(fā)現(xiàn)這2種酶都可能是潛在的藥物靶標，為后續(xù)結(jié)核病的治療提供了方向。Long Hang等[8]采用IVIAT研究了霍亂弧菌(Vibriocholerae)的體內(nèi)誘導基因。該菌為革蘭陰性菌，能夠引起人類發(fā)熱、腹瀉，嚴重時可因脫水引起死亡。他們首先構(gòu)建El Tor N16961 O1株基因組表達文庫，分離10個康復期病人血清，用體外培養(yǎng)的El Tor 霍亂弧菌O1菌體進行吸附，作為后續(xù)篩選探針。試驗共篩選出38株陽性克隆，分別編碼4號菌毛PilA和TcpA(毒素共調(diào)節(jié)鞭毛)，細胞膜蛋白PilQ、MshO、MshP和CapK，三甲基趨化蛋白，傳感蛋白LuxP等。對純化的PilA和TcpA進行免疫反應試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PilA及其胞外分泌產(chǎn)物PilQ在感染階段均有表達，并且能夠在胃腸道定殖，而TcpA能夠與吸附后的血清發(fā)生穩(wěn)定的免疫反應，證明了TcpA在人體內(nèi)的反應原性，說明利用IVIAT不僅可以快速篩選出體內(nèi)誘導基因，同時這些毒力基因表達產(chǎn)物還具有潛在的研究價值。Dantas S F I M等[9]通過IVIAT篩選了Paracoccidioidesbrasiliensis的體內(nèi)誘導基因，該菌能引起人類系統(tǒng)性肉芽腫，即副球孢子菌病。利用11個康復期病人的血清吸附cDNA文庫，經(jīng)過三輪篩選從近6 000個克隆中共篩選出35個陽性克隆，包括負責細胞代謝的脂酰輔酶A脫氫酶(acyl-coA dehydrogenase)、芳香族氨基酸脫羧酶(aromatic-L-amino acid decarboxylase)、輔酶Q(ubiquinone COQ9)等功能蛋白以及6個功能未知蛋白。副傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericaserotype paratyphi A)能夠引起人類的持續(xù)發(fā)熱、肝脾腫大、腹瀉。Alam M M[10]利用IVIAT從100 000個克隆中初篩出505個陽性克隆，復篩后獲得僅在體內(nèi)表達的陽性克隆47個，包括87個全部或部分沙門氏菌ORF片段，將該ORF亞克隆入pET30，電轉(zhuǎn)后得到20個克隆。分析其ORF，包括涉及編碼菌毛結(jié)構(gòu)(SPA0021、SPA0181、SPA0201、SPA0703)、細胞膜(SPA1533、SPA1604、SPA1645、 SPA3787和SPA4148)、細胞新陳代謝和凋亡進程(SPA0489、SPA0608、SPA0652、SPA1239、SPA1734、SPA2362、SPA2948和SPA4117)等多個功能的基因。

可見IVIAT在引起人類疾病的病原微生物中應用較廣，研究較為全面，能夠快速篩選出體內(nèi)誘導基因，同時該基因的產(chǎn)物也是很重要的毒力因子。對這些毒力因子進行系統(tǒng)的研究，有助于之后對該疾病的預防、控制及治療。

2.2IVIAT在家禽疾病方面的應用

IVIAT首先運用于口腔放線桿菌，而后廣泛運用于動物疾病中，對家禽疾病研究進行了補充。我國鴨疫里默桿菌的流行血清型以血清1型為主，缺乏對里默桿菌(Riemerellaaanatipestifer，RA)體內(nèi)誘導基因的研究報道。袁建豐等[11]建立了RA菌株血清1型的基因組文庫，用血清探針進行吸附，以期獲得特異性表達的體內(nèi)毒力基因，初篩共獲得23個陽性克隆，復篩得到14個，其中2個為重復篩選獲得，為后續(xù)的鑒定分析奠定了基礎。副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)是一種革蘭陰性菌，能夠使雞生長發(fā)育受阻，引起淘汰率增加、產(chǎn)蛋率下降、肉雞品質(zhì)降低等，進而影響家禽業(yè)生產(chǎn)。梁玉榮[12]經(jīng)過多輪篩選試驗最終從副雞禽桿菌基因組文庫中確定了5個ORF，1個編碼為轉(zhuǎn)運谷氨酰還原酶，1個為轉(zhuǎn)錄終止因子和莢膜合成域2基因簇，另外2個編碼保守假想蛋白。李求春[13]對雞白痢沙門菌S06004基因組進行2輪篩選，共獲得45個基因，進行比對分析后發(fā)現(xiàn)，可分為幾大類：生物大分子的合成和降解(嘧啶合成相關的 pyrB、氨基酸合成相關的 dapA)、能量代謝相關分子(乙酰輔酶 A 脫氫酶 adhE、四氫乙酸合成相關的 folE等)、膜轉(zhuǎn)運蛋白、調(diào)控因子、抗生素抗性蛋白及噬菌體相關蛋白和功能未知功能蛋白等，篩選得到的蛋白覆蓋細菌各個方面，反映細菌在體內(nèi)除了感染和致病，同時也要保證其生存的基本要素，同時該結(jié)果和其他文獻結(jié)果基本一致，證明親緣關系較近的細菌在感染致病的過程中有一定的相似性。

2.3IVIAT在家畜疾病方面的應用

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌Ⅱ型(Streptococcussuisserotype 2，SS2)引起的，可引起豬的多種疾病,侵害各年齡階段的豬, 通常以敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎 、 淋巴結(jié)炎為主要特征,還可引起人類腦膜炎、敗血癥等,導致嚴重疾患，甚至死亡[14]。通過傳統(tǒng)基因工程技術(shù)和生物化學方法很難了解其在體內(nèi)感染的復雜過程。2009年，Gu H等[15]構(gòu)建了ss2基因表達文庫，采用康復期豬血清進行吸附，篩選到48個陽性克隆，其中40個為已知功能蛋白，另外8個為未知功能蛋白。對10個已知功能蛋白進行RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示在在體環(huán)境中，有6個基因表達上調(diào)。通過傳統(tǒng)基因工程技術(shù)和生物化學方法很難了解豬鏈球菌在體內(nèi)感染的復雜過程，IVIAT能夠在在體環(huán)境下鑒定毒力基因則彌補了該弊端。Ma Z等[16]在2015年構(gòu)建了獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus，SEZ)ATCC35246的基因組表達文庫，以感染家豬的康復期血清為探針，篩選分析了43組體內(nèi)表達基因，涉及了SEZ毒力基因、中間產(chǎn)物的形成、基因復制、轉(zhuǎn)錄和表達等多個方面。因此，運用IVIAT可以為研究病原菌的致病機理、疾病的診斷、疫苗的開發(fā)等提供一種新的方法。

2.4IVIAT在野生動物疾病、魚病等方面的應用

IVIAT不需要動物模型、無需知道病原菌的遺傳背景的優(yōu)勢使得該技術(shù)在其他動物疾病中也得到了良好的發(fā)展。炭疽桿菌能夠引起豬、馬、牛、羊等家畜甚至人類的炭疽病。2008年，Rollins S M等[18]以獼猴為感染宿主，利用大腸埃希菌BL21(DE3)構(gòu)建了炭疽桿菌基因表達文庫，在近125 000個克隆中成功篩選出60個陽性克隆，其中包括聚乙酰谷氨酸，酰胺酶自溶素家族的7個成員，2個轉(zhuǎn)運子以及3個未知功能蛋白等。Lowry J E等[19]對自然感染 B 型流產(chǎn)布魯菌(BrucellaabortusB)的麋鹿進行了研究，最終獲得了 B 型流產(chǎn)布魯菌的3種體內(nèi)表達蛋白外膜蛋白(D15)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和離子轉(zhuǎn)運體(AfuA)。維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii，AV)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種人-獸-魚共患病病原，主要引起敗血癥、腦膜炎、胃腸炎等?？翟h(huán)[20]對AV CVCC3700基因組用IVIAT進行篩選，獲得21個基因序列，共含有22個ORF(其中一個基因含有2個完整ORF)，其功能主要涉及分子生物合成和降解相關基因(7個)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因(MarR和AraC轉(zhuǎn)錄調(diào)控[21])、細胞壁合成相關基因(3個)、轉(zhuǎn)運相關基因(包括 ABC 轉(zhuǎn)運子通透酶，生物大分子轉(zhuǎn)運體 TonB 及外膜受體介導的轉(zhuǎn)運激發(fā)蛋白質(zhì) Ton B等[22])、裂解基因(1個)、調(diào)節(jié)基因(2個)、分泌系統(tǒng)相關基因(1個)和未知功能基因(3個)。Jiao X等[23]利用IVIAT從患病魚體內(nèi)分離得到遲緩愛德華菌(Eswardsiellatarda)菌株 TX01，從中篩選得到3個抗原蛋白：Eta21、Eta6 及 FliC，并通過牙鲆對3種抗原蛋白進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白 Eta21 可以有效地保護牙鲆抗遲緩愛德華菌感染；Zou Y X等[24]以大菱鲆為感染動物，在鰻弧菌(Vibrioanguillarum)中獲得了 19 個假定的體內(nèi)誘導基因。

2.5IVIAT在寄生蟲病方面的應用

現(xiàn)階段，IVIAT應用多集中于細菌毒力基因的檢測，并且以感染人類的病原微生物為主，隨著動物醫(yī)學的快速發(fā)展，近年來在動物病原菌方面的研究應用逐漸增多，但在寄生蟲方面的研究報道仍然比較缺乏。其中Tao Q等[17]構(gòu)建了剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)的基因組文庫，篩選獲得了14個陽性克隆，鑒別分析其同源性及功能，發(fā)現(xiàn)包括編碼細菌侵襲(PI、CyP、GRA5、MIC11)，離子/蛋白結(jié)合(CaM和LRRP)，生物合成和新陳代謝(D4PD和 EF1)以及6個已知功能基因。其中5個高表達基因分別是鈣調(diào)蛋白基因(CaM)JK483883、親環(huán)素基因(CyP)JK483893、絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(PI)JK483886、致密顆粒蛋白5基因(GRA5)JK483900以及微線體蛋白11(MIC11)JK483892。以上5個基因功能與弓形蟲侵染機體的過程有關，預示著體內(nèi)誘導基因在寄生蟲感染階段扮演著非常重要的角色。

可想而知利用IVIAT篩選寄生蟲體內(nèi)誘導抗原基因?qū)羌纳x抗原組研究的新方法。以雞柔嫩艾美耳球蟲為例，球蟲生活史包括3個發(fā)育階段，即孢子生殖階段、裂殖生殖階段和配子生殖階段。不少學者利用各種方法篩選到部分柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)的保護性基因，但只是某一階段的某單一抗原，缺乏對其所有抗原(抗原組)的系統(tǒng)化研究，從而導致市面上具有免疫效力的疫苗臨床保護效果均不理想。因此，利用IVIAT篩選出不同病程階段的不同抗原組，對每個階段均有表達的保護性基因進行深入研究，制成具有完全保護力的疫苗，或者將不同病程階段表達的基因重組制成聯(lián)合疫苗，使其具有高保護力。但目前除弓形蟲外，還未有相似研究，筆者認為最主要的原因是就免疫方面而言，寄生蟲不如細菌引起的免疫反應顯著，用以做探針的血清抗體滴度較低，而IVIAT又是基于抗原抗體反應基礎上的，因此給該技術(shù)在寄生蟲方面的大量應用帶來了困難。

以雞柔嫩艾美耳球蟲為例，球蟲生活史包括3個發(fā)育階段：孢子生殖階段、裂殖生殖階段和配子生殖階段[25]。不少學者利用各種方法篩選到部分柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)的保護性基因，但只是某一階段的某種單一抗原，缺乏對其所有抗原(抗原組)的系統(tǒng)化研究，從而導致市面上具有免疫效力的疫苗臨床保護效果均不理想。因此，利用IVIAT篩選出不同病程階段的不同抗原組，對每個階段均有表達的保護性基因進行深入研究，制成具有完全保護力的疫苗，或者將不同病程階段表達的基因重組制成聯(lián)合疫苗，使其具有高保護力。但目前除弓形蟲外，還未有相似研究。筆者認為最主要的原因是就免疫方面而言，寄生蟲不如細菌引起的免疫反應顯著，用以做探針的血清抗體滴度較低，而IVIAT又是基于抗原抗體反應基礎上的，因此給該技術(shù)在寄生蟲方面的大量應用帶來了困難。但利用IVIAT篩選寄生蟲體內(nèi)誘導抗原基因?qū)羌纳x抗原組研究的一種新方法。

3IVIAT的優(yōu)勢與不足

常見篩選誘導抗原基因的技術(shù)有體內(nèi)表達技術(shù)(IVETI),信號標簽誘變技術(shù)(STM)，差異熒光誘導技術(shù)(DFI)，體外轉(zhuǎn)座進行基因組分析和作圖技術(shù)等。IVET是基于啟動子誘捕策略的體內(nèi)表達技術(shù)，將一定大小的病原基因隨機片段克隆到缺乏啟動子的報告基因中，構(gòu)建含有病原隨機基因組片段和報告基因的融合載體(即啟動子誘捕文庫)，再轉(zhuǎn)化宿主菌，得到重組病原菌。在感染動物模型后，這些重組病原菌會表現(xiàn)出報告基因的相應表型，最后篩選出含有報告基因的表型，從而鑒定出體內(nèi)誘導表達的基因。該技術(shù)無法鑒定出瞬時表達或表達豐度較低的體內(nèi)誘導基因。

信號標簽突變技術(shù)(STM)是基于轉(zhuǎn)座子特性發(fā)展起來的新型篩選技術(shù)，是將穿梭性轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)和基因融合策略聯(lián)合應用以鑒定細菌在不同生長環(huán)境及不同致病條件下的必需基因。

差異熒光誘導技術(shù)(DFI)同IVET相似，同樣也采用啟動子誘捕策略，不同之處在于DFI需要以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作為報告基因來分離能驅(qū)動GFP基因表達的體內(nèi)誘導基因序列，而IVET根據(jù)報告基因的不同分為營養(yǎng)缺陷型篩選、抗生素抗性篩選、依賴于重組酶的篩選和系統(tǒng)特異性篩選4種類型。

上述多種方法都已廣泛應用于病原菌分子遺傳學的研究，但是它們都有同樣的缺點，即需要動物模型，同時操作比較復雜。最重要的是現(xiàn)階段很多病原菌缺乏相應的合適動物模型。即使有，疾病是機體和病原菌相互作用的一個復雜過程，動物模型并不能很好的反應機體的內(nèi)部情況，在這種情況下，IVIAT的優(yōu)勢就顯而易見：①不依賴于動物模型，操作簡單方便，能夠反應機體內(nèi)部的真實情況，對研究病原菌不同時期對機體產(chǎn)生的抗原提供了平臺，并且混合血清的使用最大限度的減小了個體免疫差異；②可以對瞬時表達的基因進行檢測，可以高通量的對多個克隆進行篩選；③無需了解病原菌的生物學背景和遺傳學資料，對突發(fā)病原菌和目前了解不多的病原菌尤其適用；④通過免疫雜交反應篩選出的基因可以作為潛在的藥物靶標和疫苗候選抗原。

IVIAT同樣存在缺點，首先該技術(shù)只適用于能夠在體外培養(yǎng)的病原菌，不能應用于無法在體外誘導培養(yǎng)的病原菌；其次，利用血清作為抗體探針，無法檢測細胞免疫情況；再者，該技術(shù)只能識別在體內(nèi)表達的基因，不能識別病原菌所表達的所有毒力因子；另外，利用大腸埃希菌構(gòu)建文庫也可能面臨密碼子偏好性、酶切位點限制和毒性抗原的過表達[26]，大腸埃希菌不能表達的基因也無法檢測；最后，IVIAT建立于菌落免疫篩選技術(shù)基礎上，血清探針中抗體的強弱對篩選結(jié)果有一定影響，無法篩選編碼沒有免疫原性的體內(nèi)表達基因，低免疫原性抗體會降低篩選特異性，同時交叉免疫則可能造成假陽性。但需要注意的是，交叉反應不代表該基因就一定不在體內(nèi)表達，同樣有表達也不代表有保護力。

4結(jié)語

IVIAT作為一種新興的體內(nèi)誘導基因篩選技術(shù)，具有獨特的優(yōu)勢，盡管其也具有一定的局限性，但仍是一種鑒定體內(nèi)誘導基因的有效技術(shù)。利用該技術(shù)篩選出的毒力因子可以作為可能的藥物靶標、疫苗候選基因等，為后續(xù)研究奠定基礎。同時應用該技術(shù)還可能填補寄生蟲抗原組研究的部分空白，有巨大的潛在應用價值。

參考文獻:

[1]劉利.細菌毒力基因的篩選技術(shù)研究進展[J].醫(yī)學綜述, 2011, 17(12): 1786-1788.

[2]黎庶,胡福泉.病原微生物的體內(nèi)誘導基因及相關研究方法簡介[J].免疫學雜志,2011, 27(4): 350-354.

[3]袁建豐,覃宗華,呂敏娜,等.體內(nèi)誘導抗原技術(shù)鑒定細菌毒力基因的研究進展[J].中國獸醫(yī)學報, 2011, 31(10): 1533-1536.

[4]Handfield M, Brady L J, Progulske-Fox A, et al. IVIAT: a novel method to identify microbial genes expressed specifically during human infections[J]. Trends Microbiol, 2000,8(7): 336-339.

[5]趙力,曹建波,余波,等.體內(nèi)誘導抗原技術(shù)研究進展[J].中國獸醫(yī)雜志,2009 (5): 78-80.

[6]康元環(huán),王慶奎,邊宇,等.應用IVIAT對動物病原菌體內(nèi)誘導抗原的篩選研究進展[J].中國預防獸醫(yī)學報, 2013, 35(11): 943-945.

[7] Deb D K, Dahiya P, Srivastava K K, et al. Selective identification of new therapeutic targets ofMycobacteriumtuberculosisby IVIAT approach[J]. Tuberculosis, 2002, 82(4): 175-182.

[8]Hang L, John M, Asaduzzaman M, et al. Use ofinvivo-induced antigen technology (IVIAT) to identify genes uniquely expressed during human infection withVibriocholerae[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(14): 8508-8513.

[9]Dantas S F I M, de Rezende T C V, Bail?o A M, et al. Identification and characterization of antigenic proteins potentially expressed during the infectious process ofParacoccidioidesbrasiliensis[J]. Microbes and Infection, 2009, 11(10): 895-903.

[10]Alam M M, Tsai L L, Rollins S M, et al. Identification ofinvivo-induced bacterial proteins during human infection withSalmonellaentericaserotype paratyphi A[J]. Clin Vaccine Immunol, 2013, 20(5): 712-719.

[11]袁建豐, 覃宗華, 蔡建平, 等. 利用 IVIAT 技術(shù)鑒定鴨疫里默氏桿菌體內(nèi)表達基因[A]//中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會成立大會暨第一次學術(shù)研討會論文集[C].2008.

[12]梁玉榮.副雞禽桿菌體內(nèi)誘導基因的篩選研究[D].河北邯鄲：河北工程大學, 2012.

[13]李求春.利用 IVIAT 技術(shù)篩選雞白痢沙門菌體內(nèi)感染相關因子及 pSPI12 質(zhì)粒的鑒定與 IpaJ蛋白的功能分析[D]. 江蘇揚州：揚州大學, 2010.

[14]拜廷陽,閆若潛,吳志明,等. 豬鏈球菌病研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展, 2007, 28(9): 83-87.

[15]Gu H, Zhu H, Lu C.Use ofinvivo-induced antigen technology (IVIAT) for the identification ofStreptococcussuisserotype 2invivo-induced bacterial protein antigens[J].BMC Microbiol, 2009, 9(1): 201.

[16]Ma Z, Yu L, Zhou H, et al. Identification of novel genes expressed during host infection inStreptococcusequissp.zooepidemicusATCC35246[J]. Microb Pathog, 2015, 79: 31-40.

[17]Tao Q, Xiao J, Wang Y, et al. Identification of genes expressed duringToxoplasmagondiiinfection byinvivo-induced antigen technology (IVIAT) with positive porcine sera[J]. J Parasitol, 2014, 100(4): 470-479.

[18]Rollins S M, Peppercorn A, Young J S,et al. Application ofinvivoinduced antigen technology (IVIAT) toBacillusanthracis[J]. PLoS One, 2008, 3(3): e1824.

[19]Lowry J E,Goodridge L,Vernati G, et al. Identification ofBrucellaabortusgenes in elk (Cervuselaphus) usinginvivo-induced antigen technology (IVIAT) reveals novel markers of infection[J]. Vet Microbiol, 2010, 142(3): 367-372.

[20]康元環(huán).維氏氣單胞菌體內(nèi)誘導抗原基因的篩選及鑒定[D].吉林長春：吉林農(nóng)業(yè)大學,2014.

[21]Tekedar H C, Waldbieser G C, Karsi A, et al. Complete genome sequence of a channel catfish epidemic isolate, aeromonas hydrophila strain ML09-119[J]. Genome Announc, 2013,1 (5): e00755-13.

[22]Allard M W, Muruvanda T, Strain E, et al. Fully assembled genome sequence forSalmonellaentericasubsp.entericaserovarjavianaCFSAN001992[J]. Genome Announc, 2013,1 (2): E0008113.

[23]Jiao X, Dang W, Hu Y, et al. Identification and immunoprotective analysis of aninvivo-inducedEdwardsiellatardaantigen[J]. Fish & Shellfish Immunol, 2009, 27(5): 633-638.

[24]Zou Y X, Mo Z L, Hao B, et al. Screening of genes expressedinvivoafter infection byVibrioanguillarumM3[J]. Lett Appl Microbiol, 2010, 51(5): 564-569.

[25]吳德銘, 畢英佐, 于康震, 等. 雞球蟲基因工程疫苗研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展, 2004, 25(1): 57-60.

[26]張舒.副豬嗜血桿菌SH0165體內(nèi)表達抗原的篩選及分析[D].湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學, 2011.

Progress oninVivoInduced Antigen Technology

ZHOU Yan-cheng，GUO Yu-jie，CHEN Lu，CAO Li-ting，Ma Yue

(DepartmentofVeterinaryMedicine,SouthwestUniversity，RongchangCampus,Chongqing, 402460，China)

Abstract:In vivo induced antigen technology (IVIAT), as a new technology in vivo induced gene screening, has significant advantages that surpasses other screening technologies, namely it doesn't need animal models. Numerous experiments confirmed that the in vivo induced genes may have a subtle relationship with the survival and pathogenic microorganismsy, and its expression products are also a well-functioned kind of drug target and the candidates of vaccine genes. This paper summarized the principles, steps, advantages and disadvantages of IVIAT,at the present stage, with only a small quantity of application on parastic diseases based on IVIAT, the advantages of IVIAT on parastic disease and the potential problems were analyzed in the paper.

Key words:in vivo induced antigen technology; in vivo induced gene; parasitic disease

文章編號:1007-5038(2016)02-0075-06

中圖分類號:S852.43

文獻標識碼:A

作者簡介：周晏丞(1991-)女，重慶江北人,碩士，主要從事畜禽傳染病與寄生蟲病防治研究。

收稿日期：2015-06-09