曹海鵬，溫樂夫，周桂嫻，張　帆，何　珊*

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306; 2. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306; 3. 上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心(ZF1206)，上海 201306)

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南美白對蝦白便綜合征病原霍亂弧菌的分離與藥敏試驗

曹海鵬1,2,3，溫樂夫1,2,3，周桂嫻1,2,3，張帆1,3，何珊1,2,3*

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306; 2. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306; 3. 上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心(ZF1206)，上海 201306)

摘要:為確定南美白對蝦白便綜合征的病原菌及其藥物敏感性，采用傳統(tǒng)方法從患白便綜合征的南美白對蝦肝胰腺中分離到病原菌菌株BB31，結(jié)合API 20E革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)、16 S rDNA序列及聚類分析對菌株BB31進行了鑒定，并通過紙片瓊脂擴散法對菌株BB31的藥物敏感性進行了測定。結(jié)果表明，菌株BB31為霍亂弧菌 (GenBank登錄號: KF446244)，其16 S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中弧菌菌株的16 S rDNA序列有99%~100%的同源性，而且與霍亂弧菌菌株RD1(GenBank登錄號:KF307775)的親緣性最近。菌株BB31對四環(huán)素、慶大霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等抗生素的敏感性高，對磺胺甲氧嘧啶、呋喃唑酮、復(fù)方新諾明等抗生素不敏感。本研究證實霍亂弧菌是南美白對蝦白便綜合征的病原菌，慶大霉素、諾氟沙星等常規(guī)漁藥可作為防控霍亂弧菌引起的南美白對蝦白便綜合征的用藥參考。

關(guān)鍵詞:霍亂弧菌；鑒定；藥敏特性；白便綜合征；南美白對蝦

南美白對蝦是深受消費者青睞的名特優(yōu)水產(chǎn)品之一，具有生長速度快、養(yǎng)殖周期短、養(yǎng)殖產(chǎn)量高、經(jīng)濟收益好等特點，在我國已有近30年的養(yǎng)殖史，是我國水產(chǎn)品出口和內(nèi)銷的重要品種之一。目前，我國已在福建、海南、廣西、山東以及珠三角、長三角、京津唐等地區(qū)進行了南美白對蝦的大規(guī)模養(yǎng)殖，取得了顯著的經(jīng)濟效益[1]。然而，自2011年以來，一種以“肝胰腺腫大，嚴(yán)重者糜爛；空腸或斷腸；糞便呈白色棉線狀、有黏性、浮在水面”為典型病癥的白便綜合征(俗稱“白便病”)在南美白對蝦養(yǎng)殖區(qū)頻發(fā)，其危害性逐年增強。該病發(fā)病率高，傳染性強，嚴(yán)重困擾著南美白對蝦養(yǎng)殖戶，也對整個南美白對蝦產(chǎn)業(yè)鏈造成了嚴(yán)重的不利影響。從現(xiàn)有文獻資料來看，我國對南美白對蝦白便綜合征的研究較少，鮮見有關(guān)該病病原菌及其控制藥物等方面的詳細(xì)報道，這阻遏了我國對南美白對蝦白便綜合征的控制進程。2014年7月，浙江省蕭山區(qū)一養(yǎng)殖戶淡水養(yǎng)殖的南美白對蝦出現(xiàn)了嚴(yán)重的白便綜合征，死亡率達(dá)到了60%~80%。本研究從自然發(fā)病的南美白對蝦肝胰腺中分離鑒定了一株病原性霍亂弧菌，并進一步確定了該菌株的生理生化特性與藥敏特性，以期為南美白對蝦白便綜合征的病原學(xué)研究與防控提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

具有典型病癥的瀕死南美白對蝦，6尾，平均體重為8.23 g，取自浙江蕭山一自然發(fā)病養(yǎng)蝦池；健康南美白對蝦，300尾，平均體重為10.12 g，購自上海崇明養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分離將患病南美白對蝦在無菌室用750 mL/L酒精反復(fù)擦拭消毒后，用無菌鑷子挑取其肝胰腺至滅菌的白磁盤中，然后用無菌接種環(huán)蘸取肝胰腺分別在TCBS瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離，將平板放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)18 h~24 h后進行菌株純化，并將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上在30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后4 ℃冰箱保存，次日備用。

1.2.2人工回歸感染試驗選取活力好、無病傷、體質(zhì)健壯、大小均勻的健康南美白對蝦進行人工回歸感染試驗。首先用無菌生理鹽水分別將普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上的菌株菌苔洗下至無菌刻度管中，用稀釋涂布平板法測定并將各分離菌株的菌懸液菌濃度調(diào)節(jié)為2.0×108CFU/mL，并將各菌株的菌懸液均勻噴灑在南美白對蝦配合餌料上制成各分離菌株的菌餌，使各菌餌的菌濃度為1.0×108CFU/g，每日按蝦總體重的2%投喂；對照組以不含分離菌株的相同南美白對蝦配合餌料進行投喂[2]，每日投喂量為蝦總體重的2%。連續(xù)投喂18 d，每3 d記錄南美白對蝦的發(fā)病情況與死亡數(shù)量，并將死蝦撈出，同時取試驗中發(fā)病剛死的南美白對蝦肝胰腺，常規(guī)無菌操作進行病原菌再分離鑒定。每組南美白對蝦各30尾，連續(xù)曝氣，不換水，水溫控制在為28 ℃。

1.2.3病原菌的鑒定

1.2.3.1生理生化鑒定參照曹海鵬等[3]的方法，用API 20E革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)對分離的病原菌株進行生理生化鑒定。

1.2.3.2分子鑒定以分離的病原菌株的基因組DNA為模板，分別以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)作為正向引物和反向引物，在94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min的條件下對病原菌株的16 S rDNA基因進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物的純化與測序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將病原菌株的16 S rDNA基因序列用DNA Man軟件編輯后，在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中利用BLASTN軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的16 S rDNA基因序列進行同源性比較，利用軟件BioEdit 7.0和MEGA 4.0對同源性較高的相關(guān)細(xì)菌的16 S rDNA基因序列進行多重比較后，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4病原菌藥敏特性的測定參照紙片擴散法[4]對分離的病原菌株進行藥敏性分析，并根據(jù)《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):第19版信息增刊》判定病原菌株對抗生素的敏感程度。其中，試驗選用的各抗生素藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司。

2結(jié)果

2.1病原菌的分離

從患病南美白對蝦的肝胰腺中共分離純化出5株優(yōu)勢菌，分別暫命名為BB11、BB21、BB31、BB41和BB51。根據(jù)5株分離菌的人工回歸感染試驗結(jié)果(表1)，證實菌株BB31是南美白對蝦白便綜合征的病原菌。菌株BB31通過人工口服感染的方式對南美白對蝦的致死率為73.33%，其感染的試驗?zāi)厦腊讓ξr也表現(xiàn)出與自然病癥基本相同的癥狀，而且從試驗病死的南美白對蝦肝胰腺中也分離到了與菌株BB31形態(tài)特征、理化性質(zhì)一致的菌株。

2.2病原菌的鑒定

API 20E革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)對菌株BB31的鑒定結(jié)果(表2)表明，菌株BB31為霍亂弧菌(Vibriocholerae)，鑒定結(jié)果的可信度為99.9%。此外，通過對菌株BB31大小為1 500 bp的16 S rDNA基因序列(GenBank登錄號：KF446244)進行測序和同源性比較，結(jié)果表明菌株BB31的16 S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中弧菌屬菌株的16 S rDNA基因序列的同源性高達(dá)99%~100%?；诰闎B31 16 S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)進一步表明，菌株BB31與霍亂弧菌菌株RD1(GenBank登錄號：KF307775)的親緣性最近。結(jié)合API 20E革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)鑒定與16 S rDNA基因序列分析的結(jié)果，判定菌株BB31為霍亂弧菌。

表1　分離菌株對南美白對蝦人工回歸感染試驗結(jié)果

表2　API 20E革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)測定的菌株BB31的生理生化特征

注：+. 陽性；-. 陰性。

Note: +. positive; -. negative.

括號中的序號代表菌株的GenBank登錄號; 分支點上的數(shù)字代表計算1 000次聚類到一起的幾率; 標(biāo)尺刻度代表0.05%的序列差異。

The number in the bracket means GenBank accession number of the strain; the number at the node means the percentage of occurrence in 1 000 boot-strapped trees; the scale bar means 0.05% sequence difference.

圖1通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株BB31及相關(guān)菌株 16 S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.1Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method, based on 16 S rDNA gene sequences of strain BB31 and other related strains

2.3病原菌的藥敏特性

菌株BB31對15種抗生素的敏感試驗結(jié)果(表3)表明，菌株BB31對四環(huán)素、慶大霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星等5種抗生素敏感性較高，對新霉素、鏈霉素的敏感性次之，對氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶、呋喃唑酮、頭孢三嗪、頭孢呋新、頭孢他啶、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明等8種抗生素耐藥。

表3 菌株BB31的藥敏特性

注：S. 高度敏感；I.中度敏感；R.耐藥。

Note: S. Sensitivity; I. Intermediate sensitivity; R. Resistance.

3討論

霍亂弧菌是一種對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖具有巨大危害性的病原菌。據(jù)報道[5-8]，霍亂弧菌迄今已經(jīng)導(dǎo)致泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、鯽(Carassiusauratus)、草魚(Ctenopharyngodonidllus)、暗紋東方鲀(Fuguobscurus)等水產(chǎn)養(yǎng)殖品種發(fā)病死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。然而，從現(xiàn)有文獻資料來看，關(guān)于南美白對蝦白便綜合征病原菌的詳細(xì)研究較少，更未見到霍亂弧菌引起南美白對蝦白便綜合征的相關(guān)報道。本研究證實霍亂弧菌是南美白對蝦白便綜合征的病原菌，并分析了其生理生化特征、藥敏特征等相關(guān)特性，再一次表明了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖要加強對霍亂弧菌的防控力度，同時也推進了南美白對蝦白便綜合征的病原學(xué)研究進程。

白便綜合征已經(jīng)成為近年來南美白對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中僅次于早期死亡綜合征的重大疾病，養(yǎng)殖戶談“白便”色變。至于該病的病因，張水波[9]分析認(rèn)為細(xì)菌是南美白對蝦白便綜合征的病原，并同時認(rèn)為水質(zhì)惡化、攝食變質(zhì)飼料造成消化機能受損可能與該病的發(fā)生有關(guān)；彭小云[10]認(rèn)為一種類似弧菌的病原可能導(dǎo)致該病的發(fā)生，并進一步指出天氣突變、倒藻、底質(zhì)變壞、餌料霉變、藍(lán)藻暴發(fā)、消化機能受損等因素能夠誘發(fā)該病發(fā)生或?qū)е略摬〔∏榧又亍１狙芯勘砻骰魜y弧菌是南美白對蝦白便綜合征的病原菌，并能夠?qū)е履厦腊讓ξr出現(xiàn)大量死亡。至于霍亂弧菌引起南美白對蝦白便綜合征的發(fā)病機理，可能是由于霍亂弧菌在南美白對蝦腸組織中經(jīng)大量生長增殖、黏附腸黏膜表面、產(chǎn)生毒力因子，引起腸壁黏膜損傷，進一步通過血淋巴循環(huán)至肝胰腺組織并在其中繁殖和產(chǎn)生毒素后，導(dǎo)致肝胰腺出現(xiàn)腫大、糜爛等病變，最終促使肝胰腺和腸對相關(guān)消化液或消化酶合成和分泌功能失常，導(dǎo)致南美白對蝦發(fā)病死亡。當(dāng)然，除了霍亂弧菌本身因素外，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生與養(yǎng)殖水質(zhì)和底質(zhì)惡化、養(yǎng)殖戶投喂變質(zhì)飼料或不正常投飼也有較大的關(guān)系。

不同來源的霍亂弧菌的藥敏特性往往具有菌株差異性。秦蕾等[6]從患病異育銀鯽體內(nèi)分離的霍亂弧菌菌株對先鋒霉素V、頭孢他啶等頭孢類抗生素高度敏感；陳冬娥等[11]從鱷魚體內(nèi)分離的霍亂弧菌菌株對頭孢噻肟、頭孢呋新等頭孢類抗生素高度敏感。本試驗對霍亂弧菌菌株BB31的藥敏特性也進行了分析，發(fā)現(xiàn)菌株BB31對包括頭孢噻肟、頭孢呋新、頭孢他啶等在內(nèi)的頭孢類抗生素耐藥，這與秦蕾等[6]和陳冬娥等[11]分離的霍亂弧菌菌株的藥敏特性不同。此外，菌株BB31對慶大霉素、恩諾沙星、諾氟沙星等抗生素的敏感性高，說明菌株BB31對這些常規(guī)漁用抗生素并未產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性，為該病防控過程中的合理用藥提供了理論參考。

養(yǎng)殖水環(huán)境中和南美白對蝦體內(nèi)殘留的漁用抗生素對南美白對蝦健康養(yǎng)殖產(chǎn)生的嚴(yán)重不良影響已經(jīng)毋庸置疑。這些漁用抗生素殘留對霍亂弧菌耐藥性的誘導(dǎo)產(chǎn)生、耐藥基因水平擴散和垂直傳播具有重要的作用，容易造成養(yǎng)殖水環(huán)境中和南美白對蝦體內(nèi)的霍亂弧菌對抗生素耐藥性的增強、南美白對蝦抗病能力降低和抗生素殘留量增大，進而對南美白對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生了潛在威脅。因此，在南美白對蝦養(yǎng)殖過程中，監(jiān)測霍亂弧菌對常規(guī)漁用藥物的敏感程度、避免臨床盲目用藥顯得尤為重要[12]。值得一提的是，目前對霍亂弧菌起效的抗微生物藥物種類正在減少，因而除了對霍亂弧菌進行藥物控制外，開展霍亂弧菌的生物防治將是今后主要的發(fā)展方向。目前，我國已經(jīng)針對霍亂弧菌的生物防治進行了蛭弧菌、噬菌弧菌等蛭弧菌類生物和噬菌體的研究，為其生物控制技術(shù)的建立奠定了良好的基礎(chǔ)[13-15]。

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動物醫(yī)學(xué)進展,2016,37(2):133-136ProgressinVeterinaryMedicine

Isolation and Antimicrobial Sensitivity Test of AVibriocholeraeStrain fromPenaeusvannameiwith White Fecal Syndrome

CAO Hai-peng1，2，3， WEN Le-fu1，2，3， ZHOU Gui-xian1，2，3， ZHANG Fan1，3， HE Shan1，2，3

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterFisheryGermplasmResources,MinistryofAgricultureofChina,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai, 201306,China; 2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofAquaculture,Shanghai, 201306,China;3.ShanghaiUniversityKnowledgeServicePlatform,ShanghaiOceanUniversityAquaticAnimalBreedingCenter(ZF1206),Shanghai, 201306,China)

Abstract:In order to confirm the bacterial pathogen of Penaeus vannamei white fecal syndrome and its antimicrobial sensitivity, a pathogenic strain BB31 was isolated from white fecal syndrome Penaeus vannamei using traditional methods, identified by API 20E Gram negative bacterial identification system, 16 S rDNA sequence and phylogenetic analysis. Its antimicrobial susceptibility was also analyzed by Kirby-Bauer test. The results showed that strain BB31 was a Vibrio cholerae strain with its GenBank accession No. KF446244, its 16 S rDNA sequence had a 99%-100% homology with those of Vibrio strains, and showed a closest relationship to that of V. cholerae strain RD1 with GenBank accession No. KF307775. Strain BB31 exhibited a high sensitivity to tetracycline, gentamycin, enrofloxacin, ofloxacin and norfloxacin, showed a resistance against sulfametoxydiazine, compound sulfamethoxazole, furazolidone. This study confirmed Vibrio cholerae as a pathogen of white fecal syndrome Penaeus vannamei, and common fishery antimicrobial such as gentamycin and norfloxacin may be regarded as useful antimicrobial in the control of Penaeus vannamei white fecal syndrome caused by Vibrio cholerae.

Key words:Vibrio cholerae; identification; antimicrobial susceptibility; White fecal syndrome; Penaeus vannamei

文章編號:1007-5038(2016)02-0128-05

中圖分類號:S945.46

文獻標(biāo)識碼:B

作者簡介：曹海鵬(1981-)，男，山東招遠(yuǎn)人,講師，博士，主要從事水產(chǎn)動物病害防治與微生態(tài)制劑的開發(fā)研究。*通訊作者

基金項目：上海海洋大學(xué)科技發(fā)展專項基金；江蘇省科技支撐計劃項目(No. BE2013366); 閔行區(qū)中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新計劃項目; 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)類人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實訓(xùn)基地(泗洪)項目；閔行區(qū)產(chǎn)學(xué)研合作計劃項目

收稿日期：2015-04-27