馬　偉 ，王家敏，令世鑫，馬桂蘭 ，馬　花，喬自林，馬忠仁，馮玉萍

(1.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730030； 2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州 730010；3.生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730030)

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昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基研究進(jìn)展

馬偉1，王家敏1，令世鑫1，馬桂蘭2，馬花2，喬自林1，馬忠仁1，馮玉萍3*

(1.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730030； 2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州 730010；3.生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730030)

摘要:隨著昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，昆蟲細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)已成為一種發(fā)展趨勢。目前的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中主要有糖類、維生素、氨基酸、脂類、無機(jī)鹽、有機(jī)酸等基礎(chǔ)成分，此外還需要添加血清或酵母提取物和水解乳蛋白等血清替代物。然而使用血清會帶來諸多難以解決的問題，因此開發(fā)使用血清替代物和無血清培養(yǎng)基已成為生物制品行業(yè)關(guān)注的主要方向。論文綜述了昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究進(jìn)展，包括研究歷程、研究現(xiàn)狀、基礎(chǔ)成分和其他添加物等。

關(guān)鍵詞:昆蟲細(xì)胞；無血清培養(yǎng)基；血清替代物

昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system，BEVS)具有克隆容量大、重組病毒易篩選、翻譯后加工修飾系統(tǒng)完備和外源基因表達(dá)能力高等特點(diǎn)，因此與大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)并稱為當(dāng)今基因工程的四大表達(dá)系統(tǒng)[1-2]。隨著BEVS的廣泛應(yīng)用，以草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda細(xì)胞株Sf 9和Sf 21，以及粉紋夜蛾Trichoplusiani細(xì)胞株Tn5B1-4(商品名High Five)為主的昆蟲細(xì)胞的體外培養(yǎng)越來越被重視，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基也越來越受到人們的關(guān)注。最初Grace’s培養(yǎng)基是在Hank’液的基礎(chǔ)上通過添加水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate，LH)、酵母提取物(yeast extract，YE)和100 mL/L滅活血清形成的； Gardiner G R等[3]通過修改Grace’s培養(yǎng)基組成適合于苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒在Sf細(xì)胞系中生長的培養(yǎng)基并定名為TC-100，但TC-100僅適用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)而不適用于大規(guī)模生產(chǎn)；Weiss S A等[4]改進(jìn)了最初的IPL培養(yǎng)基，研制了可大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的IPL-41培養(yǎng)基，利于昆蟲桿狀病毒的有效生產(chǎn)，同時(shí)該培養(yǎng)基很適合細(xì)胞無血清培養(yǎng)，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基被用于多種無血清培養(yǎng)基的開發(fā)?，F(xiàn)有的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基是在分析昆蟲血淋巴的化學(xué)組成基礎(chǔ)上發(fā)展和形成的，目前成分穩(wěn)定且應(yīng)用廣泛的商品化基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要是Grace’s、IPL-41和TC-100 3種培養(yǎng)基，這3種培養(yǎng)基在應(yīng)用中一般要補(bǔ)加3%～15% 的血清用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)，而含血清培養(yǎng)基還沒有用到大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)中。由于添加血清存在諸多難以克服的困難：如血清來源困難，價(jià)格昂貴，質(zhì)量不穩(wěn)定，批間差異大，重復(fù)性差；血清是支原體和其他異源病毒的重要來源；另外，血清成分復(fù)雜，給基因工程表達(dá)產(chǎn)物的后處理帶來困難，所以低價(jià)、穩(wěn)定且全能型昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(serum-free media，SFM)的開發(fā)一直是昆蟲細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化的主要方向[5]。

1昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的發(fā)展

昆蟲細(xì)胞SFM的開發(fā)應(yīng)用始于20世紀(jì)80年代。首先，Wilkie G E等開發(fā)了培養(yǎng)液CDM，其中含有0.4% YE，它能夠維持Sf細(xì)胞的生長和生產(chǎn)野生型桿狀病毒。關(guān)于CDM培養(yǎng)液，除了Ferrance J P等[6]發(fā)表的一篇涉及到代謝研究的文章，沒有有關(guān)CDM 做細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道。Roder A用0.5%蛋黃乳液替代脂類分子在TC10培養(yǎng)基中成功地培養(yǎng)了幾個(gè)鱗翅目細(xì)胞系。Maiorella B等[7]在IPL-41中添加0.4% YE及多聚醇F-68乳化的脂質(zhì)混合物，成功配制無血清培養(yǎng)基ISFM，可使Sf9和其他一些細(xì)胞系維持6 L～36 L規(guī)模生產(chǎn)巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)。戴琥等[8]以IPL-41為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加0.2% LH、0.2% YE以及由膽固醇等組成的脂質(zhì)微乳濁液，研制出IC-SFM培養(yǎng)基并成功培養(yǎng)High Five細(xì)胞，但并未發(fā)現(xiàn)用于商業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。以IPL-41培養(yǎng)基為基礎(chǔ)還配制了其他商品化無血清培養(yǎng)基，包括Ex-cell系列和Sf900系列培養(yǎng)基，其中Sf900-Ⅱ在很多研究中被廣泛應(yīng)用[9-11]。

近年來，無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，已報(bào)導(dǎo)有多種細(xì)胞株系在相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基中生長和增殖獲得成功，但由于不同昆蟲細(xì)胞對培養(yǎng)基的專一性要求，每種培養(yǎng)基都是為培養(yǎng)特定的細(xì)胞或特定的培養(yǎng)目的而設(shè)計(jì)的。例如Thermo Fisher Scientific公司設(shè)計(jì)開發(fā)的Sf-900TMSFM系列和Express Five?SFM：Sf-900TMSFM系列適合Sf9和Sf21細(xì)胞系長期生長，其中Sf-900TMⅢ SFM所含水解物濃度更低且無動(dòng)物源性成分，能夠有效提高細(xì)胞培養(yǎng)的一致性；Express Five?SFM則適用于High Five細(xì)胞系長期培養(yǎng)，使用前需按45 mL/500 mL培養(yǎng)基添加200 mmol/L的L谷氨酰胺。LONZA公司開發(fā)出適用于Sf9和Sf21細(xì)胞系培養(yǎng)的Insect-XPRESSTM培養(yǎng)基，但由于其不含胰蛋白酶抑制劑，如使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，應(yīng)馬上離心分離并轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中。Sigma-Aldrich公司也開發(fā)出適用于Sf9和Sf21細(xì)胞系長期培養(yǎng)的EX-CELL?420和EX-CELL?TiterHighTMMedium，且都是完全培養(yǎng)基，使用時(shí)無需添加其他成分，而其生產(chǎn)的EX-CELLTM405和Hyclone的HyQ SFX-Insect則更適于High Five細(xì)胞系的長期培養(yǎng)[12]。盡管目前已有諸多商品化昆蟲SFM，但是細(xì)胞在SFM中從幾代到十幾代不等，都會逐漸出現(xiàn)衰退、老化或死亡等現(xiàn)象，因而每種無SFM都有各自的特點(diǎn)和局限性，還需進(jìn)一步優(yōu)化完善。

2昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)成分

培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)開發(fā)與細(xì)胞的新陳代謝研究是密不可分的，基礎(chǔ)的代謝研究數(shù)據(jù)是培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的最基本理論依據(jù)，對于設(shè)計(jì)合理的培養(yǎng)方案以及實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量的桿狀病毒感染表達(dá)也是非常重要的。目前常用的High-Five、Sf9細(xì)胞系新陳代謝方面的研究已有相關(guān)文章發(fā)表[13-14]。

糖類是大部分昆蟲細(xì)胞首要的能源和碳源，蔗糖雖然也可利用，但它在培養(yǎng)基中所起主要作用是調(diào)節(jié)滲透壓而非能源，如Grace’s培養(yǎng)基中蔗糖含量高于25 g/L，作用即在于此。維生素是維持細(xì)胞生長的一種重要生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對促進(jìn)昆蟲細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞貼附有積極作用。一般認(rèn)為，泛酸、異己酸、乙酸及核黃素等對細(xì)胞的存活是有利的，而膽堿、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。氨基酸是細(xì)胞生長所需的另一類重要物質(zhì)，其中有14種必需氨基酸，細(xì)胞本身不能合成，必須由培養(yǎng)基提供。非必需氨基酸有谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等，其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)的重要材料，缺少谷氨酰胺會影響到細(xì)胞的生長速度，幾乎所有的昆蟲細(xì)胞對谷氨酰胺都有較高的要求，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長不良而最后死亡，昆蟲細(xì)胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培養(yǎng)基中攝取有效，所以各類培養(yǎng)基中都含有較高濃度的谷氨酰胺。周正中指出谷氨酸是昆蟲細(xì)胞生長過程中一個(gè)重要的代謝物(谷氨酰胺代謝的中間體)，在快速生長的昆蟲細(xì)胞系谷氨酸中被大量消耗，而在生長緩慢的細(xì)胞系中它成為代謝產(chǎn)物被積累[15]。非必需氨基酸在感染病毒后的生化反應(yīng)中有無作用仍需進(jìn)一步研究。脂類是細(xì)胞膜的主要成分，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，對其生長必不可少。培養(yǎng)基中的脂類包括不飽和脂肪酸和甾醇，后者昆蟲細(xì)胞不能合成，因此無血清培養(yǎng)基中脂類的濃度要相應(yīng)提高。

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境包括pH值、滲透壓、鹽組分和溫度等都不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞要在較高的滲透壓中生長，一般為340 mOsm/kg～390 mOsm/kg，因而昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度略高，并且各無機(jī)鹽離子之間需要平衡，其中Na+/K+比例在某些細(xì)胞系中有嚴(yán)格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+、Al3+等能促進(jìn)細(xì)胞貼附和增加產(chǎn)量，其中Al3+和Zn2+還可以促進(jìn)病毒的感染和復(fù)制，因此昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中添加Al3+和Zn2+是很有必要的。在有機(jī)酸中，蘋果酸、延胡索酸、唬拍酸和a-酮戊二酸等聯(lián)合使用時(shí)，對細(xì)胞生長有顯著的促進(jìn)作用，而單獨(dú)測試時(shí)則只有蘋果酸有生長促進(jìn)作用[12]。

3昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中的添加物

細(xì)胞體外培養(yǎng)最好能接近其原來生長的體內(nèi)環(huán)境，設(shè)計(jì)適合的培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素。動(dòng)物血清對細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂有非常重要的作用，是培養(yǎng)基中使用最多最廣泛的自然添加物，然而添加血清會產(chǎn)生諸多難以克服的困難，尋找適合的血清替代物一直是培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的主要方向之一，YE和蛋白水解物是目前常用血清替代物。

YE富含水溶性B族維生素和嘌呤堿基，是昆蟲培養(yǎng)基中維生素和嘌呤的主要來源。在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面YE的作用有一定限度，并非與其含量成比例。而且有研究表明，YE濃度過高反而會抑制細(xì)胞的生長[16]。因此，YE的含量應(yīng)該根據(jù)不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或細(xì)胞進(jìn)行調(diào)整，一般而言YE的含量應(yīng)在0.2%～0.6%之間[8,12,17-19]。

蛋白水解物(也稱為蛋白胨)是培養(yǎng)基中主要的氨基酸來源，其中LH作為應(yīng)用最廣的添加劑，通常和酵母提取物一起被添加到各種昆蟲培養(yǎng)基中。與YE相同，LH對昆蟲細(xì)胞的作用也不是與其含量成正相關(guān)的，其濃度一般在0.2%～0.5%之間[8,17-18]。除水解乳蛋白外，常用于培養(yǎng)基研制的蛋白水解物還包括細(xì)菌用蛋白胨、朊蛋白胨和Primatone RL[20]。隨著對生物制品安全性要求的提高，非動(dòng)物源性的材料已成為人們更加關(guān)注的方向，植物蛋白水解產(chǎn)物已成為動(dòng)物源蛋白水解物的理想替代物，其中大豆水解產(chǎn)物正在無血清培養(yǎng)基中發(fā)揮越來越重要的作用[21-22]。

脂類一般不直接加入培養(yǎng)基中，而由血清提供。無血清培養(yǎng)基中的脂類物質(zhì)通常由膽固醇等組成的脂類復(fù)合物代替，也有以蛋黃提取物代替脂類復(fù)合物和血清配制成的無血清培養(yǎng)基[20]。除上述YE、LH、蛋黃提取物和脂類復(fù)合物等生物活性物質(zhì)外，有些具有促細(xì)胞生長的化工原料也可用于代替血清，例如曽慶韜就用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)代替血清配制無血清培養(yǎng)基，并成功培養(yǎng)了果蠅胚胎細(xì)胞。

細(xì)胞生長因子是維持細(xì)胞生存和增殖所必需的物質(zhì)，隨著對其種類和功能的深入了解，細(xì)胞生長因子在無血清培養(yǎng)基的開發(fā)應(yīng)用中將會發(fā)揮更大的作用。關(guān)于脊椎動(dòng)物細(xì)胞的生長因子已經(jīng)有了一定研究進(jìn)展，并且已經(jīng)應(yīng)用到無血清培養(yǎng)基的開發(fā)中[23-24]，但是對于昆蟲細(xì)胞生長因子的研究卻僅僅才是開始。目前已鑒定出2個(gè)N末端具有共同序列(Glu-Asn-Phe-)的昆蟲細(xì)胞生長因子，它們都是ENF家族成員。一個(gè)是生長阻抑肽(growth blocking peptide, GBP)，當(dāng)它的添加濃度為nmol/L 級水平時(shí)，能夠刺激人角質(zhì)形成細(xì)胞和Sf9細(xì)胞的DNA合成[25]。另一個(gè)是家蠶麻痹肽(Bombyxmoriparalytic peptide, BmPP)，用來自家蠶胚胎或卵巢的7個(gè)細(xì)胞系測試BmPP的功能，其促進(jìn)細(xì)胞生長的效果與10-9mol/L～10-5mol/L的FBS基本相同[26]。后來又分離到一種未糖基化的單亞基蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約28 ku，其抑制細(xì)胞凋亡的活性和全部熱處理的血淋巴相同[27]。這些因子在昆蟲細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)中的綜合應(yīng)用還依賴于其是否能大量、簡易地進(jìn)行分離純化以及在High Five細(xì)胞和家蠶Bm5細(xì)胞等其他常用細(xì)胞系培養(yǎng)中是否能發(fā)揮同樣的作用。

昆蟲細(xì)胞在無血清低蛋白或無蛋白培養(yǎng)基環(huán)境中對剪切應(yīng)力更為敏感，為保護(hù)細(xì)胞免受剪切力損傷和降低細(xì)胞結(jié)團(tuán)，無血清培養(yǎng)基中還需添加一些多聚物保護(hù)劑，大致有甲基纖維素、甘油、聚乙烯吡咯烷酮和Pluronic多聚醇(聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物)、硅油和Tween(消泡劑)、維生素E(Vitamin E，抗氧化劑)、Fluronic RF68等。Fluronic RF68是目前應(yīng)用最廣泛的一種保護(hù)劑，含量一般在0.1%～0.3%之間[12]。

4昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的發(fā)展方向

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基相對于哺乳動(dòng)物培養(yǎng)基起步較晚，目前大多數(shù)商品化無血清培養(yǎng)基都含有水解乳蛋白、酵母提取物和脂類復(fù)合物等生物活性物質(zhì)，雖然成分相對穩(wěn)定，但依然不明確，對于其中一些添加物的成分和作用機(jī)理還不夠了解，因此還需加深細(xì)胞代謝及各成分的作用機(jī)理的研究，找到適合的成分明確的替代物。現(xiàn)有的商品化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分完全足夠，添加血清或血清替代物的主要目是彌補(bǔ)合成培養(yǎng)基中缺少的細(xì)胞生長因子。隨著對血清及其替代物的充分研究和深入了解，人們終將找出其中的促細(xì)胞生長因子，并將這類生長因子作為生物活性物質(zhì)的替代物用于無血清培養(yǎng)基的開發(fā)。今后昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)開發(fā)要以成本低、成分明確、批間差異小、穩(wěn)定性高、產(chǎn)物效率高且易純化為基礎(chǔ)，向著無血清、無蛋白、無動(dòng)物源性材料的適合多種不同細(xì)胞生長的全能型培養(yǎng)基方向發(fā)展。

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Progress on Insect Cell Serum-free Media

MA Wei1, WANG Jia-min1, LING Shi-xin1, MA Gui-lan2, MA Hua2,QIAO Zi-lin1, MA Zhong-ren1, FENG Yu-ping3

(1.EngineeringandTechnologyResearchCenterforAnimalCell,Gansu，Lanzhou,Gansu, 730030,China；2.LanzhouMinhaiBio-EngineeringCO．,LTD,Lanzhou,Gansu, 730010，China；3.KeyLaboratoryofBioengineeringandBiotechnologyoftheStateEthnicAffairsCommission,Lanzhou，Gansu，730030,China)

Abstract:With the wide application of insect baculovirus expression vector system, the large scale of insect cell culture has become a developing trend. At present, there are some basic elements such as sugars, vitamins, amino acids, lipids, inorganic salts and organic acids in the insect cell culture media, and it also needs to add serum or serum substitutes like yeastolate and lactalbumin hydrolysate. However, serum will bring many difficulties if being used, so developing and using the serum substitutes and serum-free media has become the main research direction of the biological product industry. This paper summarized the research progress on insect cell serum-free media, including the research history, research status, basic components and other additives, etc..

Key words:insect cell; serum-free medum; serum substitute

文章編號:1007-5038(2016)02-0101-04

中圖分類號:Q813.11

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：馬偉(1986-)，男(回族)，寧夏固原人，碩士研究生，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)、獸用生物制品的開發(fā)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目(IRT13091)；西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(31920150029)；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013-4-101)；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)(GNSW-2014-24)

收稿日期：2015-07-06