黃紅瑩，劉英杰，衛(wèi)文強(qiáng)，婁　強(qiáng)，許國強(qiáng)

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，河南 開封475000)

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微生物學(xué)實驗教學(xué)改革初探*

黃紅瑩，劉英杰，衛(wèi)文強(qiáng)，婁強(qiáng)，許國強(qiáng)

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，河南 開封475000)

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗教學(xué)與臨床結(jié)合緊密，是一門實踐性很強(qiáng)的基礎(chǔ)課。時代的發(fā)展要求教師對實驗教學(xué)加快改革和創(chuàng)新。 通過查閱資料并結(jié)合該院的實驗條件，筆者提出了實驗教學(xué)的整改措施，使實驗教學(xué)緊密聯(lián)系實際，關(guān)注時代發(fā)展，為提高學(xué)生的動手能力、科研能力及綜合素質(zhì)打下堅實的基礎(chǔ)。

微生物學(xué)；實驗教學(xué)；內(nèi)容更新

人類社會的發(fā)展無時無刻不伴隨著微生物的感染與疾病的發(fā)生，當(dāng)今社會不斷出現(xiàn)新型微生物的感染，已對人類健康造成極大威脅[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對病原微生物的認(rèn)識不斷深入，特別是對重要病原微生物的基因結(jié)構(gòu)、功能和致病機(jī)制有了較深入的了解[2]。作為臨床醫(yī)學(xué)的一門基礎(chǔ)課程，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)擔(dān)負(fù)著越來越重要的作用。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)是一門實踐學(xué)科，其理論知識均來源于實驗，所以實驗課是其中重要的組成部分。近年來醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的發(fā)展突飛猛進(jìn),新的技術(shù)、成果不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的教育模式也在隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變[3],這對醫(yī)生和醫(yī)學(xué)生也提出了更高的要求。 時代的發(fā)展要求教師對實驗教學(xué)加快改革和創(chuàng)新。因此，筆者積極申報儀器設(shè)備，結(jié)合河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院的實驗條件提出了實驗教學(xué)的整改措施，爭取為提高學(xué)生的動手能力、創(chuàng)新能力及綜合素質(zhì)打下堅實的基礎(chǔ)。

1　設(shè)置原則

學(xué)生對基本技能實驗的熟練程度將直接影響到微生物實驗教學(xué)及學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)需要掌握更先進(jìn)的實驗技術(shù)。因此，筆者實驗項目設(shè)置原則是：在保留基本技能實驗的基礎(chǔ)上，對現(xiàn)有的實驗內(nèi)容進(jìn)行積極的更新；增加與生活密切相關(guān)的實驗內(nèi)容及分子生物學(xué)實驗。

2　設(shè)置方法

2.1理論聯(lián)系實際近年來，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)發(fā)展迅速，其理論內(nèi)容及實驗技術(shù)都在不斷更新。為了加深學(xué)生對理論知識的認(rèn)識，增加學(xué)習(xí)興趣，在微生物實驗教學(xué)中，安排了與生活、生理密切相關(guān)的實驗內(nèi)容，將學(xué)生遇到的一些問題同微生物學(xué)知識緊密結(jié)合起來。如：在進(jìn)行微生物的分布檢測技術(shù)中，選擇了自來水中微生物的檢測，既讓學(xué)生掌握了水中微生物檢測技術(shù)，也讓學(xué)生掌握了活菌計數(shù)技術(shù)；在進(jìn)行環(huán)境條件對微生物影響的項目中，選擇醫(yī)院中常用的酒精、碘酒、新潔爾滅等因素進(jìn)行檢測，學(xué)生既掌握了基本技術(shù)，也對消毒劑的殺菌作用有了實際了解；在微生物形態(tài)觀察中，選擇口腔中微生物形態(tài)的觀察，從而使學(xué)生更加直觀地認(rèn)識到人類與微生物之間的緊密關(guān)系。

2.2關(guān)注時代發(fā)展隨著時代發(fā)展，新的病原體及感染性疾病不斷出現(xiàn)，診斷病原體的常規(guī)方法主要有細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、核酸雜交、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，特別是ELISA，由于其快速靈敏而在臨床上得到廣泛應(yīng)用。比如利用ELISA 測定乙肝病毒表達(dá)的蛋白質(zhì)( 多肽) 抗原或相應(yīng)的抗體，是輔助診斷乙肝的常規(guī)方法，特別對急性乙肝的發(fā)現(xiàn)有重要作用，但其對慢性乙肝的診斷越來越不靈敏，特別是在乙肝病毒發(fā)生了變異以后，需要進(jìn)行 HBV-DNA 檢測才能確診[4]。PCR技術(shù)具有較高的檢測敏感性，利用熒光定量PCR可定量檢測 HBV-DNA，客觀地反映HBV感染、復(fù)制及病程變化，修正或補(bǔ)充了對 ELISA測定結(jié)果的解釋。PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用越來越廣泛，特別是在感染性疾病中的應(yīng)用，使人們更深入了解了感染性疾病的發(fā)生發(fā)展過程。目前，應(yīng)用多重 PCR方法對感染性疾病病原檢測主要有兩個方向: ①針對一種病原的單個特異基因進(jìn)行多重檢測，可同時檢測一種或幾種病原體的存在與否。②針對某一病原的多個基因進(jìn)行多重檢測，可減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，在同一PCR反應(yīng)管中同時加入多種病原微生物的特異性引物，能夠同時檢測多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染。該教研室以前開設(shè)的都是一些傳統(tǒng)的微生物學(xué)實驗技術(shù)，如細(xì)菌培養(yǎng)，生化反應(yīng)等,關(guān)于分子生物學(xué)技術(shù)，學(xué)生只掌握了理論知識。為了培養(yǎng)符合時代要求的新型專業(yè)人才，本科生實驗課所開設(shè)的實驗項目也應(yīng)與時俱進(jìn)，合理更新。為讓學(xué)生掌握PCR技術(shù)，結(jié)合實際情況，建立了大腸桿菌PCR快速檢測技術(shù)。

2.2.1實驗設(shè)計在以前的實驗中，學(xué)生已學(xué)習(xí)了大腸桿菌的形態(tài)、培養(yǎng)技術(shù)、生化反應(yīng)等，對大腸桿菌有了較全面的了解；另外，大腸桿菌無致病性，容易培養(yǎng)，因此，選用大腸桿菌PCR檢測讓學(xué)生進(jìn)一步學(xué)習(xí)PCR技術(shù)，比較容易理解。

大腸桿菌PCR快速檢測包含DNA提取技術(shù)、PCR反應(yīng)體系的建立及核酸擴(kuò)增技術(shù)和核酸電泳技術(shù)?？紤]到學(xué)生初次接觸分子生物學(xué)技術(shù)，操作步驟復(fù)雜，將此檢測技術(shù)分別放在三次實驗中完成。在此之前，學(xué)生已掌握了顯微鏡技術(shù)及細(xì)菌染色，細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)及生化反應(yīng)，消毒滅菌技術(shù)，細(xì)菌在自然界的分布檢測技術(shù)等實驗內(nèi)容，對微生物學(xué)及其實驗技術(shù)已經(jīng)有了較深入的了解。在此基礎(chǔ)上，引進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)微生物學(xué)的興趣，開闊思路，增強(qiáng)學(xué)生的實際操作能力和科研創(chuàng)新能力。

2.2.2實驗操作大腸桿菌PCR快速檢測技術(shù)的實驗材料較多，包括多種緩沖液的配制、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和大腸桿菌PCR快速檢測試劑盒等。先讓學(xué)生了解這些基本內(nèi)容及實驗原理，然后分組討論，充分熟悉實驗步驟，分工合作，這樣才能保證實驗的順利進(jìn)行。學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性大大提高，實驗操作認(rèn)真仔細(xì)。

首先是DNA提取技術(shù)。在充分熟悉實驗步驟的情況下，讓學(xué)生明白注意事項，否則可導(dǎo)致實驗失敗。如避免樣品反復(fù)凍融，洗脫時的注意事項及DNA如何存放等。實驗的每一步驟直接關(guān)系到DNA的提取量及其純度，也是實驗成敗的關(guān)鍵。事實證明，充分熟悉實驗步驟的學(xué)生成功率比較高。在PCR擴(kuò)增實驗中，首先建立擴(kuò)增反應(yīng)體系。每四位學(xué)生一組，等全部完成后收集放入PCR儀，按設(shè)定好的循環(huán)參數(shù)開始擴(kuò)增。由于時間有限，DNA電泳不能馬上進(jìn)行，所以擴(kuò)增的DNA完成后應(yīng)收集放

入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。下次實驗做核酸電泳，電泳用緩沖液已提前配制，學(xué)生需配制瓊脂糖凝膠，待其凝固后放入電泳槽內(nèi)，加緩沖液及樣品，設(shè)置好電壓及時間。電泳完畢，關(guān)上電源，用紫外分析儀觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker 比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。大腸桿菌PCR快速檢測技術(shù)比較復(fù)雜，它不但需要一定的知識儲備，還考驗了學(xué)生們的操作技能及認(rèn)真細(xì)致的工作作風(fēng)。通過此實驗，大家學(xué)到了相關(guān)的理論知識，也認(rèn)識到作為一個醫(yī)學(xué)生應(yīng)該具備的素質(zhì)，提高了學(xué)習(xí)興趣，使大家對臨床醫(yī)學(xué)的科學(xué)研究有了更深一步的了解。

2.2.3實驗分析傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定主要是根據(jù)表型特征，通過分離培養(yǎng)、染色鏡檢、菌落形態(tài)觀察、生化反應(yīng)特征、抗原分型等一系列實驗后綜合分析得到結(jié)果。此法雖然廣泛用于病原菌檢測，但存在費(fèi)時費(fèi)力、靈敏度低等缺點(diǎn)。隨著PCR和核酸研究技術(shù)的不斷發(fā)展，數(shù)據(jù)庫的不斷完善，其在快速、微量、準(zhǔn)確分類鑒定和檢測病原菌方面將發(fā)揮越來越大的作用。在本實驗中，教師利用PCR快速檢測試劑盒檢測大腸桿菌，快速準(zhǔn)確地對大腸桿菌進(jìn)行了鑒定，且實驗重復(fù)性好，從傳統(tǒng)的分離純化和生化鑒定到現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定，讓學(xué)生既學(xué)習(xí)理解了傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法，又對現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌分類鑒定中的應(yīng)用有了更深刻的認(rèn)識。

3　討論

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗教學(xué)能夠有效地提高學(xué)生對此課程的學(xué)習(xí)興趣與積極性,加強(qiáng)師生之間的交流與互動,擴(kuò)展學(xué)生思維,培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神與實踐能力。同時，實驗教學(xué)也要求教師具有先進(jìn)的實驗教學(xué)理念、科學(xué)的實驗教學(xué)教材、系統(tǒng)的實驗教學(xué)內(nèi)容、先進(jìn)的實驗教學(xué)方法，這些是實驗教學(xué)迅速發(fā)展的關(guān)鍵。只有不斷學(xué)習(xí)，大膽嘗試，才能跟上科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，培養(yǎng)出適應(yīng)臨床需要的醫(yī)學(xué)人才。

[1]劉春艷,艾軍紅.甲型H7N9禽流感病毒的病毒學(xué)特征[J].中國當(dāng)代兒科雜志,2013,15(6):405-408.

[2]蔣梅.禽流感病毒血凝素基因研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2013,29(8)：817-820.

[3]王放，徐廣宇，王國慶，等. 現(xiàn)代臨床微生物學(xué)教學(xué)改革探討[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2012,14(6):401-402.

[4]林杓鋒，李校坤，吳帆，等． 實行定量 PCR 在乙型肝炎(HBV) 診斷中的應(yīng)用[J]．中國生物工程雜志，2012，22(3):68-70．

[責(zé)任編校：柯莉]

2015-10-20

黃紅瑩(1964-)，女，河南省開封市人，碩士，教授，從事微生物學(xué)教學(xué)與科研工作。

河南大學(xué)教改項目。

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1008-9276(2016)03-0344-02