張全鋒　余細(xì)球　劉錦濤

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胃幽門螺桿菌與口腔幽門螺桿菌檢測方法的研究進(jìn)展

張全鋒余細(xì)球劉錦濤

幽門螺桿菌(Hp)在中國的感染率較高，胃Hp的檢查方法雖然已相對成熟，但仍不斷有新的改良。近年來口腔Hp與胃Hp的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)，有不少報道對口腔Hp的檢測方法進(jìn)行了探討，但目前尚無統(tǒng)一方法可同時檢測胃Hp及口腔Hp。此文就胃Hp與口腔Hp的檢測方法的研究進(jìn)展作一綜述。

幽門螺桿菌；檢測方法；口腔

幽門螺桿菌(Hp)是一種微需氧的革蘭陰性桿菌，一般定植于胃黏液層和胃竇黏膜上皮細(xì)胞之間[1]。持續(xù)性或終身性Hp感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、胃癌等疾病密切相關(guān)。WHO將Hp列為第一類致病因子，全球大約2/3人口曾受Hp感染，在發(fā)展中國家的感染率高達(dá)70%～80%。雖然近年來中國的經(jīng)濟(jì)條件及生活水平不斷得到改善，但是總體感染率仍達(dá)60%左右。

1989年Krajden等[2]報道從Hp感染性胃炎患者的牙菌斑中分離出Hp，同年Shames用DNA限制性內(nèi)切酶分析證實(shí)了胃和牙菌斑的Hp為同一菌株。從此，口腔Hp成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，并有不少報道對胃Hp與口腔Hp的關(guān)系進(jìn)行探討，有研究指出胃與口腔同時感染Hp，在治療口腔Hp后，胃Hp的根除率可由61.33%上升至82.26%[3]。可見胃Hp與口腔Hp之間存在著一定的聯(lián)系。

Hp的檢測方法眾多，包括細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)，本文將分別對胃Hp、口腔Hp的檢測方法進(jìn)行綜述。

1　細(xì)菌學(xué)檢測

細(xì)菌學(xué)檢測指直接在胃鏡下鉗取胃黏膜進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)以檢測Hp，此檢測方法的特異度較高，并可在培養(yǎng)Hp的同時進(jìn)行耐藥實(shí)驗(yàn)的檢測，但由于培養(yǎng)條件苛刻，容易受外界細(xì)菌污染，培養(yǎng)往往不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果，造成此方法的敏感度較低，故臨床上較少應(yīng)用，一般僅用于科研。有研究提出了微細(xì)管培養(yǎng)的方法，此檢測方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為96%、80%、83%、95%，敏感度高于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)、快速尿素酶檢測和蘇木精-伊紅(HE)染色(P<0.01)，且自身可產(chǎn)生微需氧環(huán)境，占用空間小，可作為日常診斷Hp的方法[4]。

細(xì)菌學(xué)檢測方法可同時應(yīng)用于口腔Hp檢測，有不少研究分別從牙菌斑、唾液等部位取樣進(jìn)行Hp培養(yǎng)，得出口腔Hp培養(yǎng)的成功率為0～54.1%[5-7]。造成口腔Hp培養(yǎng)敏感度不高的原因在于口腔中含有多種菌群，影響并干擾Hp的培養(yǎng)。

2　免疫學(xué)檢測

目前已有多種免疫學(xué)檢測方法，可通過檢測Hp抗原或抗體明確有無Hp感染，常見的包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金法等。

2.1ELISA

ELISA是一種非侵入性、簡單、廉價的診斷Hp感染的方法，然而抗Hp抗體陽性不能區(qū)分是現(xiàn)時感染還是既往感染，多被用于流行病學(xué)研究及回顧性研究，且不能作為Hp藥物治療后的隨訪。長期以來，免疫球蛋白G(IgG)是依靠定性檢測，Seo等[8]建立了定量檢測IgG的方法，指出IgG在Hp陽性組及陰性組的平均滴度為1766.4 IU/mL、654.3 IU/mL(P<0.001)，免疫球蛋白A(IgA)在Hp陽性組及陰性組的平均滴度為350.1 IU/mL、193.5 IU/mL(P<0.001)，陽性組IgG、IgA滴度均高于陰性組，可通過定量檢測IgG、IgA滴度以明確有無胃Hp感染[8]。有研究建立了以全細(xì)胞抗原為基礎(chǔ)的自身ELISA，此檢測方法敏感度、特異度分別為93%、100%，可作為實(shí)用的臨床診斷方式[9]。

ELISA檢測可同時應(yīng)用于口腔唾液中Hp檢測，抗Hp-IgG抗體敏感度為79.31%，特異度為63.64%，陽性及陰性預(yù)測值分別為85.19%和53.85%，是一種檢測口腔唾液Hp快速、敏感的方法，具有臨床推廣價值[10]。

2.2膠體金法檢測

2.2.1唾液Hp抗原檢測法唾液Hp抗原檢測法(HPS)指運(yùn)用膠體金法原理，唾液中的Hp尿素酶與膠體金標(biāo)志物結(jié)合，結(jié)合物又與固定在試紙上的Hp尿素酶抗體發(fā)生特異性結(jié)合，游離的膠體金標(biāo)志物移動至質(zhì)控區(qū)與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，是近年來檢測口腔Hp感染的新方法。有研究對HPS、快速尿素酶、13C尿素呼氣實(shí)驗(yàn)(13C-UBT)、組織學(xué)檢測方法進(jìn)行比較，得出敏感度分別為71.43%、76.19%、100%、85.71%，特異度分別為55.42%、98.80%、92.77%、95.18%，可知HPS的敏感度較高，但特異度偏低，不適合作為精確檢測口腔Hp的方法，但其具有快速、取樣簡單的優(yōu)點(diǎn)，可用于Hp流行病學(xué)研究[11]。葉國欽[12]利用13C-UBT、HPS與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)同步檢測，結(jié)果顯示：(1)13C-UBT(+)、HPS(+)組，HPS與PCR的符合率為96.55%；(2)13C-UBT(-)、HPS(+)組，HPS與PCR的符合率為96.97%；(3)13C-UBT(-)、HPS(-)組，HPS與PCR的符合率為100%。此研究指出，HPS與PCR同步檢測口腔Hp感染具有較高的符合率，且均不受13C-UBT檢測結(jié)果的影響，可作為口腔Hp檢測的新方法。目前HPS檢測的穩(wěn)定性尚無統(tǒng)一觀點(diǎn)，是否能作為檢測口腔Hp的首選方法，仍需更多的研究來驗(yàn)證，但因其簡便、快速，目前可作為胃Hp感染時對口腔Hp的輔助檢查方法。

2.2.2Hp糞便抗原檢測采用膠體金法、酶聯(lián)免疫或PCR方法分析糞便中Hp抗原的敏感度并不高，對于無條件開展胃鏡檢查的地區(qū)，可考慮此檢測方法，且由于敏感度較低，需加強(qiáng)隨訪[13]。有研究建立了一種快速、簡單的檢測糞便Hp的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)，通過對Hp的16S rRNA基因設(shè)計4條特異性引物(包括外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP)作為診斷Hp感染的標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，如陽性可見明顯的梯狀條帶，LAMP反應(yīng)結(jié)束后，加入核酸染料，在紫外燈下陽性反應(yīng)管為綠色熒光，結(jié)果Hp基因組DNA檢測敏感度為12 pg，是普通PCR的10倍，可檢測的糞便標(biāo)本中最低菌液濃度為102CFU/mL，由于糞便標(biāo)本留取簡單，對患者無創(chuàng)傷，特別適用于兒童、孕婦等特殊人群，此方法無需特殊的儀器和設(shè)備，操作簡單，并可以在2 h內(nèi)得到檢測結(jié)果，是一種很有前景的檢測方法[14]。同時有學(xué)者提出了一步快速檢測糞便Hp抗原的方法，采用膠體金法原理，由樣本管及測試盒組成，測試盒中有結(jié)果區(qū)及控制區(qū)，只需在樣本管中加入2～3滴樣本，根據(jù)抗原抗體結(jié)合原理，如在結(jié)果區(qū)出現(xiàn)變色，則為Hp陽性，控制區(qū)無論有無Hp感染都出現(xiàn)變色，該檢測方法的敏感度、特異度、精確度分別可達(dá)88%、100%、94%，與血清學(xué)檢測相比較，具有更高的檢測優(yōu)勢，可進(jìn)行推廣[15]。

3　分子生物學(xué)技術(shù)

通過檢測分子水平的結(jié)構(gòu)，在分子水平上操作，從而達(dá)到人們對生物的改造及獲得所需要的產(chǎn)物。用于檢測Hp的主要分子生物學(xué)技術(shù)有PCR技術(shù)、LAMP技術(shù)、活細(xì)胞原位熒光雜交技術(shù)(FIVH)等。

3.1PCR技術(shù)

PCR技術(shù)指利用基因擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增Hp特征性基因片段以達(dá)到檢測目的。實(shí)時熒光定量PCR(FQ-PCR)是一種直接檢測核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，具有高敏感度及特異度的優(yōu)點(diǎn)，能對細(xì)菌進(jìn)行定量。有學(xué)者以尿素酶B亞單位基因(UreB)為靶基因建立FQ-PCR，UreB 基因序列相對更保守，能更加準(zhǔn)確地檢測Hp，以檢測值>0為陽性，136例經(jīng)FQ-PCR法檢測的陽性標(biāo)本中，Hp陽性率高于石炭酸復(fù)紅-孔雀綠染色法(P<0.01)，當(dāng)組織中的細(xì)菌數(shù)低于107拷貝/g時，普通染色法檢測結(jié)果可能為陰性，此方法可以檢測出樣本組織學(xué)染色不能發(fā)現(xiàn)的低水平Hp，降低漏診率，可用于胃Hp感染的輔助診斷[16]。

PCR技術(shù)可同時應(yīng)用于口腔Hp的檢測，在日本兒童及成人的牙髓炎中，發(fā)現(xiàn)15%Hp-DNA與48例Hp菌株相符，但在唾液中并未發(fā)現(xiàn)Hp，提出發(fā)炎的牙根管可能是Hp定居地[17]。巢式PCR與胃黏膜組織學(xué)檢測Hp陽性率，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但在檢測口腔Hp時，巢式PCR陽性檢出率明顯高于單步PCR[18]。雖然PCR的敏感度、特異度較高，但其操作復(fù)雜，未廣泛應(yīng)用于臨床。

3.2LAMP

LAMP技術(shù)能在等溫條件下，短時間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，與常規(guī)PCR相比，不需模板熱變性，具有簡單、快速、特異度強(qiáng)的特點(diǎn)。分別應(yīng)用胃刷細(xì)胞學(xué)檢測、LAMP、活組織檢查、細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)這4種方法檢測Hp，發(fā)現(xiàn)胃刷細(xì)胞學(xué)檢測與LAMP結(jié)合的方法敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均達(dá)100%，期間無出血、穿孔等并發(fā)癥發(fā)生，是一種實(shí)用、安全的檢測胃Hp感染的方法[19]。

同時應(yīng)用此方法檢測牙菌斑Hp的陽性率可達(dá)77.78%，表明牙菌斑可能是Hp再次感染及經(jīng)口-口傳播的重要原因[20]。

3.3FIVH

有學(xué)者以原位雜交熒光技術(shù)(FISH)為基礎(chǔ)，建立了新的檢測方法——FIVH，是以核酸苷酸為探針(鎖核酸為基礎(chǔ))，利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，形成靶DNA或RNA與核酸探針的雜交體，在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定雜交體中細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)、分布及定位的技術(shù)?？稍?7℃、pH 2～7及無毒的濃聚物的環(huán)境下開展，雜交步驟只需30 min即可完成，重要的是其具有與FISH基本一致的敏感度及特異度[21]。

4　基因水平的研究

多重基因分析系統(tǒng)(GeXP系統(tǒng))是基因表達(dá)多重定量分析的準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高通量的最新解決方案，至少可以檢測到10拷貝的目的DNA量，是普通PCR的10～100倍，能夠?qū)χ炼?5重的目標(biāo)基因表達(dá)情況進(jìn)行定量分析比較，是基因表達(dá)分析領(lǐng)域的革命性技術(shù)。巧妙地將多重PCR技術(shù)與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，采用通用引物與特異引物相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)多重PCR產(chǎn)物定量檢測的目的，克服了芯片成本高、重復(fù)性差和定量PCR方法通量低等弊端，是目前唯一可以進(jìn)行低成本、高效的、多重PCR定量分析的技術(shù)平臺。有研究指出多基因定量表達(dá)分析系統(tǒng)檢測Hp的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為92.9%、92.4%、96.0%、87.1%，可成為潛在的臨床檢查方法，并可對Hp治療的有效性進(jìn)行監(jiān)測[22]。選取16S rRNA、UreA、UreC、26KDa、cagA基因作為Hp的診斷基因，并采用多重基因檢測，16S rRNA、26KDa、UreC的敏感度、特異度均達(dá)到了100%，UreA的敏感度、特異度為95.6%、70.4%；cagA的敏感度、特異度分別為85.2%、96.3%，可見利用多重基因檢測增加了其檢測的敏感度和特異度。通過擴(kuò)增其他幾種細(xì)菌或病毒的DNA模板來評估此檢測方法的特異度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒有檢測出擴(kuò)增信號，表明該系統(tǒng)高度特異，且每次可以增加96個標(biāo)本體系，每個體系可以增加30多對引物而彼此之間不受影響，不僅滿足了臨床標(biāo)本檢測的需求，同時可檢測突變位點(diǎn)從而分析Hp的致病程度，具有較高的臨床應(yīng)用價值[23]。

5　尿液檢測方法

RapirunHp抗體檢測是一種通過收集被檢者的尿液，運(yùn)用免疫層析原理檢測抗Hp-IgG抗體，明確有無Hp感染的檢測方法。Nquyen等[24]對越南148例患者進(jìn)行檢測，提出此檢測方法的敏感度、特異度及精確度分別為79.5%、90.7%、84.5%。越南有研究采用快粘試驗(yàn)對此方法進(jìn)行改進(jìn)，顯示敏感度、特異度、精確度可達(dá)84.7%、89.9%、87.0%，總體表現(xiàn)有所提升，指出此檢測方法可用于臨床[25]。目前國內(nèi)尚未見相關(guān)文獻(xiàn)采用此檢測方法，是否同時適用于中國Hp檢測，仍需進(jìn)一步探討與研究。

綜上所述，目前檢測胃Hp的方法較多，無論是傳統(tǒng)的還是新穎的檢測方法，只有結(jié)合實(shí)際條件，才能選擇適合的檢測方法?？谇籋p是目前研究的熱點(diǎn)，尚無統(tǒng)一的檢測方法，仍需不斷探討新的、快速、敏感、準(zhǔn)確且廉價的檢測方法。

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(本文編輯：周駿)

524000湛江，廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(張全鋒)；518000深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(余細(xì)球)；518100深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(劉錦濤)

劉錦濤，Email: bill-liu118@163.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.02.012

2015-07-09)