硝化菌的篩選、鑒定及其固定化顆粒的氨氮去除效能*

汪懷建 周躍龍 汪新強 胡美丹

(1.江西農(nóng)業(yè)大學國土資源與環(huán)境學院, 江西 南昌 330045;2.江西婺源饒河源國家濕地公園管理局, 江西 婺源 333200)

近年來，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，水環(huán)境面臨的壓力日趨增大，部分劣Ⅴ類地表水中的氨氮污染問題較為突出[1-2]。根據(jù)環(huán)境保護部發(fā)布的《2013年環(huán)境統(tǒng)計年報》，2013年，全國廢水中氨氮的排放量為245.7萬t，主要來源為城鎮(zhèn)生活污水、農(nóng)業(yè)源、工業(yè)廢水等污染源。廢水中氨氮進入環(huán)境水體后，極易引起水體的富營養(yǎng)化等水生態(tài)環(huán)境問題。

針對水體中氨氮污染物的去除，國內(nèi)外學者主要對生物修復方法開展了大量相關研究，從環(huán)境水體中篩選出高效硝化菌的優(yōu)勢菌株，并考察環(huán)境因素對硝化菌的氨氮硝化過程的影響[3-5]。由于硝化菌在天然水體中的含量相對較低，近年來，固定化微生物方法成為硝化菌強化技術(shù)的研究熱點[6-10]。通過微生物固定的方法，可以實現(xiàn)污染水體中局部區(qū)域硝化菌的大量富集，從而提升氨氮的去除效果。

為探討環(huán)境中硝化菌的固定化方法及對地表水中氨氮的去除效果，從地表水中篩選分離得到一種硝化菌優(yōu)勢菌株，對其進行16S rDNA鑒定，考察不同固定化方法條件下固定化硝化菌顆粒對氨氮的處理效果，為固定化硝化菌顆粒在氨氮微污染地表水修復中的應用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 優(yōu)勢菌株的篩選

1.1.1 硝化菌的富集培養(yǎng)

取南昌市某內(nèi)河流中底泥，在無菌環(huán)境下，與無菌水均勻混合制成均勻菌懸液。在錐形瓶中加入富集培養(yǎng)基，主要成分為(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCO3、無氨水。然后向其中接種菌懸液，將已移取菌懸液的富集培養(yǎng)基(即富集培養(yǎng)液)置于恒溫搖床上，于30 ℃、120 r/min下振蕩培養(yǎng)，以6 d為1個周期。經(jīng)過多周期轉(zhuǎn)接，淘汰富集培養(yǎng)液中伴生的異養(yǎng)細菌。在每次轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)液的同時，取富集培養(yǎng)液滴于白瓷板上，分別用格利斯試劑及二苯胺-硫酸試劑，檢驗是否存在亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，通過指示劑與富集培養(yǎng)液混合后顯示顏色的深淺來間接顯示硝化菌的強弱。

1.1.2 硝化菌的分離與純化

吸取1 mL富集培養(yǎng)液于含9 mL無菌水的試管中，80 ℃水浴加熱20 min，充分搖勻，然后在上一個試管中取1 mL到另一個含9 mL無菌水的試管中，制成濃度梯度的菌懸液。取10、102、103、104、105倍梯度的少量稀釋后的菌懸液分別置于平板培養(yǎng)基中的一角，硝化菌的分離采用平板劃線法。平板培養(yǎng)基主要成分為K2HPO4、NaNO2、NaCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3、瓊脂。

1.1.3 硝化菌的篩選

將分離得到的菌株接入硝化菌篩選培養(yǎng)基，置于恒溫搖床上，在30 ℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。同時以滅菌后沒有接種任何菌株的篩選培養(yǎng)基為對照樣。篩選培養(yǎng)基的主要成分為NaNO2、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCO3、氨水。7 d后測定氨氮的濃度，計算氨氮的去除率。篩選出氨氮去除效果最好的菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 菌株16S rDNA鑒定

采用細菌DNA提取試劑盒，提取篩選得到的硝化菌DNA。然后進行DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增處理。PCR擴增體系(50 μL反應總體系)：H2O 22 μL，菌體DNA 1 μL，引物P1 1 μL，引物P2 1 μL，2×PCR Mix 25 μL(含10×PCR Buffer、dNTP、Taq酶)。硝化菌擴增程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行29個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

DNA的檢測：在點樣板上點加1 μL溴酚藍，再加入3 μL DNA樣品，并同時以20 ng標準DNA作對比，混合后點入凝膠點樣孔中，在220 V電壓、280 mA電流下電泳20 min；在紫外光透射儀下觀察DNA圖譜條帶，并拍照。

PCR產(chǎn)物的電泳檢查在點樣時以2 μL DL2000 DNA作為參照， 3 μL的擴增后產(chǎn)物加1 μL溴酚藍混合后，分別點入點樣孔，在220 V電壓、280 mA電流下電泳20 min；在紫外光透射儀下觀察擴增產(chǎn)物光帶的情況，并拍照。

1.3 不同的載體固定方法

1.3.1 海藻酸鈉/粉末活性炭固定法

將篩選出的最佳菌體用質(zhì)量分數(shù)為0.85%的生理鹽水洗滌，再將菌液放入離心機中，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，得到固定化所要用的菌泥。稱取2 g海藻酸鈉于48 mL蒸餾水中，水浴加熱直至海藻酸鈉完全溶解。然后將0.5 g活性炭邊攪拌邊加入上述海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后冷卻至室溫。離心得到的固定化菌泥與上述配置的質(zhì)量分數(shù)為4%的海藻酸鈉溶液按2∶1(質(zhì)量比)的比例混合，充分混勻，然后利用注射器吸取后逐滴滴入質(zhì)量分數(shù)為4%的氯化鈣溶液中，形成均勻的顆粒狀，而后將固定化顆粒放入4 ℃的條件下進行固化交聯(lián)24 h。固化后將固定化顆粒取出用蒸餾水洗滌兩次，即得到最終的海藻酸鈉/粉末活性炭固定化硝化菌顆粒。

1.3.2 聚乙烯醇(PVA)固定法

稱取1 g海藻酸鈉、10 g PVA于89 mL的蒸餾水中，水浴加熱使其溶解。稱取3 g二氧化硅、0.3 g碳酸鈣緩緩攪拌加入上述溶液中，將離心得到的固定化菌泥與上述溶液按2∶1(質(zhì)量比)的比例混合，充分混勻，然后利用注射器吸取，逐滴滴入含1%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈣的飽和硼酸溶液中，形成均勻的顆粒狀，輕輕攪拌，制作完固定化顆粒后將其放入4 ℃的冰箱中固化交聯(lián)24 h。固化后將固定化顆粒取出用蒸餾水洗滌兩次，即完成最終的微生物固定化顆粒制作。

1.4 氨氮去除效果

取南昌市某內(nèi)河流水1 L置于容積為2 L的燒杯中，分別放入等量的干質(zhì)量為5 g 的PVA固定化硝化菌顆粒與海藻酸鈉/粉末活性炭固定化硝化菌顆粒進行曝氣，每隔一定時間取樣1次，連續(xù)運行24 h后，沉淀2 h，撇除上清液，新補充內(nèi)河流水至1 L，重復上述實驗。取不加固定化硝化菌顆粒的內(nèi)河流水進行曝氣，作為空白對照。分析原水及處理后水樣中氨氮濃度。水樣中氨氮的測試采用納氏試劑分光光度法。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果

提取硝化菌DNA，對其PCR擴增后的產(chǎn)物進行電泳處理，以 DNA Marker DL2000作為參照，其DNA擴增后產(chǎn)物在紫外光透射儀下的照片如圖1所示。由圖1可知，擴增后產(chǎn)物光帶呈集中、明亮的狀態(tài)，且擴增所得到的條帶DNA長度約為1 500 bp。擴增結(jié)果表明，擴展后的DNA能夠用于16S rDNA 序列分析，PCR擴增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

圖1 硝化菌PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR of nitrobacteria

將提取的硝化菌株(命名XH)16S rDNA，提交到美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)在線基因數(shù)據(jù)庫進行相似性比對。結(jié)果表明，提取的硝化菌株XH最接近的屬(種)為NR_074453.1，登錄號為Bacillusanthracisstr. Ames strain Ames 16S ribosomal RNA, complete sequence，相似度99%。采用ClustalX軟件對GenBank中的已知序列與測得的硝化菌序列進行比對后，采用BioEdit手動刪除兩端不齊序列，然后用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。

圖2 硝化菌株XH基于16S rDNA全序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of XH based on complete 16S rDNA sequences

由圖2可知，硝化菌株與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和炭疽桿菌(Bacillusanthracis)的親緣關系最近。然而菌株的NCBI在線基因數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果表明，菌株與炭疽桿菌的相似度高達99%。這表明硝化菌株在分類學上屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，但不能確定具體是哪一種芽孢桿菌。

2.2 固定化載體的選擇

對于篩選得到的硝化菌株，分別采用海藻酸鈉/粉末活性炭與PVA兩種固定化載體，對優(yōu)勢菌株進行固定處理。兩種固定化載體得到硝化菌強化顆粒對地表水中氨氮的去除效果見圖3。地表水初始氨氮質(zhì)量濃度為6.10 mg/L、pH為7.72、COD為41.8 mg/L。

由圖3可見，在連續(xù)曝氣反應24 h的條件下，兩種固定化載體對氨氮的去除率均高于99.2%，這表明兩種載體中固定的硝化菌均保持較高的生物活性，能夠有效去除地表水中的低濃度氨氮。在反應時間為0～16 h時，PVA固定化硝化菌顆粒的氨氮去除率略高于海藻酸鈉/粉末活性炭固定化硝化菌顆粒。這可能是由于前者部分硝化菌固定于二氧化硅和碳酸鈣顆粒的孔道中，后者部分硝化菌固定于粉末活性炭的孔道中，相較氨氮在水中到達硝化菌表面的傳質(zhì)速度，前者高于后者。此外，PVA固定化硝化菌顆粒的機械強度高于海藻酸鈉/粉末活性炭固定化硝化菌顆粒，因此，PVA固定化載體整體上優(yōu)于海藻酸鈉/粉末活性炭固定化載體。

圖3 不同固定化載體下硝化菌顆粒的氨氮去除效果Fig.3 The ammonia nitrogen removal efficiency of nitrobacteria particles immobilized on different carriers

2.3 固定化硝化菌顆粒的氨氮去除效果

以南昌市某內(nèi)河流中氨氮微污染水為原水，考察PVA固定化硝化菌顆粒長時間動態(tài)處理氨氮的效果，其對氨氮的去除率如圖4所示。原水初始氨氮質(zhì)量濃度為1.85 mg/L、pH為7.67、COD為32.9 mg/L。由圖4可見，連續(xù)運行12 d，PVA固定化硝化菌顆粒對水中的氨氮有較高且穩(wěn)定的去除率，達到78.0%～87.2%，出水氨氮質(zhì)量濃度低于0.4 mg/L，低于《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838—2002)Ⅱ類水體氨氮限值(0.5 mg/L)。與傳統(tǒng)生化法脫氮處理相比，固定化硝化菌處理具有快速啟動的特點，在反應時間為1 d時，其氨氮去除率達到了82.7%。固定化后硝化菌能夠在反應區(qū)域?qū)崿F(xiàn)較高濃度的富集，而不會隨水流失，其在氨氮微污染地表水修復領域具有較好的推廣應用前景。

圖4 PVA固定化硝化菌顆粒對氨氮的去除效果Fig.4 The ammonia nitrogen removal efficiency of nitrobacteria particles immobilized on PVA

3 結(jié) 論

從氨氮微污染地表水中篩選得到一種硝化菌，通過分子生物學鑒定，該硝化菌在分類學上屬于芽孢桿菌屬。相對于海藻酸鈉/粉末活性炭材料，PVA材料固定篩選得到的硝化菌性能更優(yōu)。PVA固定化硝化菌顆粒能夠有效去除微污染地表水中的氨氮，處理后氨氮濃度低于GB 3838—2002 Ⅱ類水體氨氮限值。

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