王杰瓊，高冬梅，于艷紅，魏 盛，張媛媛，張惠云,喬明琦

（山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點實驗室 濟南 250355）

HPLC法對白香丹膠囊中芍藥苷在大鼠體內(nèi)藥時曲線的測定＊

王杰瓊，高冬梅，于艷紅，魏 盛，張媛媛，張惠云＊＊,喬明琦

（山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點實驗室 濟南 250355）

目的：本研究通過HPLC法對白香丹膠囊大鼠含藥血清的檢測，確定其主要藥效成分芍藥苷在體內(nèi)代謝的藥時曲線，并找出最佳采血時間，為后續(xù)機制研究奠定基礎(chǔ)。方法：通過方法學(xué)考察確定所采用HPLC的 準確度和 精密度；給予白香丹膠囊溶液l mL/100 g，連續(xù)給藥3天，每天2次；給藥后在不同時間點對大鼠進行眼眶靜脈叢取血，白香丹膠囊組取血時間點分別為：10、20、40、60、90、120、180、240、300、360 min，離心15 min，3 000 r·min-1，取血清；將大鼠血清與甲醇按1∶4混合，4℃離心，取上清液，氮氣吹干，流動相定容至100 μL，過濾后進行測定。結(jié)果：方法學(xué)考察結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度和日間精密度RSD＜3%，回收率均在98.0%-102.0%；制備藥時曲線顯示末次給藥2 h左右含藥血清中芍藥苷含量達到峰值。結(jié)論：通過方法學(xué)考察說明所采用 HPLC方法日內(nèi)精密度和日間精密度良好，回收率在標準范圍內(nèi)，符合定量檢測要求；采用該方法所得藥時曲線說明該復(fù)方中主要藥效成分芍藥苷在2 h后血藥濃度最大，可作為復(fù)方含藥血清提取的最佳采血時間，這將為后續(xù)該復(fù)方治療機制研究提供科學(xué)依據(jù)。

HPLC法 白香丹膠囊 芍藥苷 含藥血清 藥時曲線

調(diào)肝方藥白香丹膠囊是由白芍、香附、丹皮等中藥的提取物配伍組成，主治PMS肝氣逆證。該證的主要臨床癥狀為: 經(jīng)前情緒激動、煩躁易怒。在此方劑中白芍作為君藥，其主要藥效成分芍藥苷的含量是評價該藥質(zhì)量的主要指標之一。另外，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可促進皮層神經(jīng)元生長，具有抗抑郁作用[1]。因此，在白香丹膠囊治療機制的中芍藥苷的體內(nèi)代謝具有主要作用，基于此本研究采用HPLC法對白香丹膠囊大鼠含藥血清的檢測，從而確定該復(fù)方主要藥效成分芍藥苷在體內(nèi)代謝的藥時曲線，這將為該復(fù)方治療機制的后續(xù)研究做好鋪墊。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

日立高效液相色譜儀：四元泵，L2000，DAD檢測器 （日立高新技術(shù)公司）；高速冷凍離心機LGR16-W（北京醫(yī)用離心機廠）；旋渦混合器XWSOA（上海嘉鵬科技有限公司），色譜柱22I5H-002，日立 LaChrom C18，規(guī)格：5規(guī)格，4.6mmrom C1（日立高新技術(shù)公司）。

1.2 實驗藥物

白香丹膠囊（青島陽光海川醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：20110220）；芍藥苷標準品（成都泰迪生物科技有限公司，批號：23180-57-6）。

1.3 實驗動物

Wistar大鼠，體質(zhì)量180-220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2002-2003。

2 血清樣品制備方法

2.1 白香丹膠囊含藥血清制備

取10只大鼠，分別給予白香丹膠囊溶液l mL/100 g（相當于成人臨床8倍劑量，1 mL藥液含原生藥9 g），連續(xù)給藥3天，2次/天，于給藥后不同時間點對大鼠于眼眶靜脈叢取血1 mL。白香丹膠囊組取血時間點10、20、40、60、90、120、180、240、300、360 min，離心15 min，3 000 r·min-1，取血清，于-20℃冰箱保存，備用。

2.2 血清樣本處理

用微量加樣器精取待測大鼠血清100 μL加入離心管，再加入400 μL甲醇，渦旋60 s，于4℃離心機離心20 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1。離心后取上清液，用氮氣吹干， 流動相定容至100 μL，0.22 μm濾膜過濾，手動進樣20 μL。采用HPLC法檢測各樣本中芍藥苷的含量。

3 方法學(xué)考察

3.1 色譜條件

流動相∶乙睛-水（16∶84）；流速：1.0 mL·min-1；紫外/可見二極管陣列檢測器；檢測波長為230 nm。在此條件下，芍藥苷保留時間tr=6.65±0.08 min。采用外標法測定血清芍藥苷濃度。

3.2 標準液配制

精密稱取芍藥苷標準品0.65 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，濃度為0.13 mg·mL-1，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 芍藥苷標準曲線制備

分別于離心試管中加入0.26、0.52、1.30、2.60、5.20、7.80、13.0 μg·mL-1試管中加標準液10 μL，室溫用氮氣吹干，加入空白血清定容至100 μL，按“2.2”項下方法處理后，HPLC色譜法測定其峰面積（APF）。

3.4 日內(nèi)、日間精密度測定

分別于離心試管中加入0.52、2.60、5.20 μg·mL-1標準液10 μL，室溫用氮氣吹干，加入空白血清定容至100 μL，按“2.2”項下方法處理后，1日內(nèi)測定5組，計算相對標準偏差RSD，結(jié)果為日內(nèi)精密度。在5天內(nèi)連續(xù)測定5次，計算RSD，結(jié)果為日間精密度。

3.5 回收率測定

分別于離心試管中分別加入0.52、2.60、5.20 μg·mL-1標準液10 μL，樣本處理方法同“3.4”項，在1日內(nèi)分別連續(xù)測定5次，與標準曲線同批進行測定，以當日標準曲線計算芍藥苷的濃度，芍藥苷的檢出量與加入量的比值即為回收率。

3.6 檢測限測定

峰高約在基線噪音高的3倍（即信噪比S/N= 3∶1）時，注入液相色譜的芍藥苷濃度即為檢測限。以上所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件繪制藥時曲線。

圖1 空白血清色譜曲線圖

圖2 芍藥苷標準品色譜曲線圖

4 實驗結(jié)果

4.1 HPLC色譜圖

4.2 芍藥苷標準曲線

標準曲線回歸方程為：y=4×10-5x+0.165（R2= 0.999 2）。

結(jié)果表明芍藥苷的濃度在0.026 0-1.300 0 μg·μL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可滿足藥物濃度定量分析的要求，詳見圖1-圖4。芍藥苷標準品濃度與面積見表1。

4.3 日內(nèi)、日間精密度及回收率

0.052、0.26、0.52 μg·mL-1濃度的芍藥苷標準品處理后，測定其日內(nèi)、日間精密度及回收率，結(jié)果見表2。日內(nèi)精密度和日間精密度RSD＜3%，回收率均在98.0%-102.0%之間，符合定量分析要求。

圖3 白香丹膠囊含藥血清色譜曲線圖

表1 芍藥苷標準品濃度與面積

圖4 芍藥苷含量標準曲線

表2 日內(nèi)、日間精密度及回收率檢測結(jié)果

表3 不同時間點白香丹膠囊含藥血清中芍藥苷濃度測定結(jié)果（n=5，μg·mL-1）

4.4 白香丹膠囊藥時曲線

根據(jù)上述回歸方程計算白香丹含藥血清中芍藥苷濃度，不同時間點芍藥苷濃度測定結(jié)果見表3。根據(jù)結(jié)果，以時間為橫坐標，含藥血清芍藥苷濃度為縱坐標，繪制含藥血清芍藥苷藥時曲線圖，見圖5。由此可以發(fā)現(xiàn),連續(xù)給藥3天，末次給藥后120 min，白香丹膠囊含藥血清中芍藥苷含量出現(xiàn)峰值。

5 討論

白香丹膠囊中白芍，味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)。具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽之功效。既能養(yǎng)肝血，又能柔肝體，是最順應(yīng)肝之特性，治療肝郁證獨一無二之品[2]?，F(xiàn)代中醫(yī)治療抑郁癥的方藥，在組方頻次和用藥劑量上，白芍都占有重要的位置。王景霞等[3]發(fā)現(xiàn)白芍提取物（其中含芍藥苷占48.99%）能夠改善抑郁癥模型大鼠在糖水消耗、水平和垂直運動及跳臺錯誤次數(shù)方面的異常表現(xiàn)，同時能夠增加中樞5-HT、NE的含量，說明白芍提取物具有明顯的抗抑郁作用。

因此，白香丹膠囊中白芍在治療情緒所致疾病起到關(guān)鍵作用，有必要探明白芍在治療過程中的機制。目前應(yīng)用整體動物實驗來研究藥物更接近動物的實際情況,使用體外培養(yǎng)的方法可得到相對均一的細胞群體，排除活體狀態(tài)下內(nèi)分泌、循環(huán)、體液等多種因素的影響。而用體外實驗體系體現(xiàn)藥物的體內(nèi)作用是血清藥理學(xué)最大優(yōu)點，它即能反映藥物中可吸收部分的直接作用，又能反映藥物在機體作用下形成的代謝產(chǎn)物和藥物引起的機體內(nèi)源性物質(zhì)的間接效果[4]。例如，孟凡榮等[5]利用滋腎通絡(luò)方含藥血清觀察高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞增殖的影響；田晨等[6]也采用補腎益髓生血法所治療的再生障礙性貧血大鼠含藥血清來探討其對骨髓造血干細胞紅系分化JAK2/STAT5信號通路的影響。因此，血清藥理學(xué)的中藥藥效研究可應(yīng)用細胞學(xué)和分子生物學(xué)手段闡述藥物作用機制[7]。

在采用血清藥理學(xué)方法進行試驗前,給藥后采血最佳時間的確定,可避免由藥效物質(zhì)被代謝減少或尚未吸收造成的假陰性結(jié)果[8]。前期本課題組也曾對該藥在體內(nèi)的代謝情況進行研究，所設(shè)定的采血點為末次給藥后不同時間點1、2、3、4、5、6 h（每個時間點5只大鼠，每只取血2次，即1 h與4 h組、2 h與5 h組、3 h與6 h組）[9],所得結(jié)果為末次給藥3.5 h芍藥苷含量達到峰值。但因該方法個體差異較大，時間點設(shè)置分散，故研究結(jié)果可信度不夠。近來，中藥血清藥理學(xué)實驗中常用的采血時間為60、90、120 min等,一般不超360 min。因此本研究將此次實驗的取血點設(shè)定為10、20、40、60、90、120、180、240、300、360 min，分別從同一只大鼠眼眶靜脈叢取血，采集白香丹膠囊和白芍提取物給藥后以上不同時間點的血清，因此可有效避免因個體差異帶來的誤差，且時間設(shè)置更為合理。通過本次研究所繪制給復(fù)方的藥時曲線我們發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)給予大鼠白香丹膠囊3天后，于末次給藥2 h，君藥白芍提取物主要成分芍藥苷濃度達到峰值，說明該復(fù)方中主要藥效成分芍藥苷在2 h后血藥濃度最大，可作為復(fù)方含藥血清提取的最佳采血時間，以糾正前期研究的失誤。

圖5 白香丹膠囊含藥血清芍藥苷濃度一時間變化曲線圖

綜上，本研究通過方法學(xué)考察說明所采用HPLC檢測方法具有較好的準確性和靈敏度，因此，所得復(fù)方含藥血清制備的最佳采血時間具有可信性，可為后續(xù)采用復(fù)方含藥血清進行相關(guān)機制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 Abdel-Hafez A A, Meselhy M R, Nakamura N, et al. Anticonvulsantactivity of paeonimetabolin-I adducts obtained by incubation of paeoniflorin and thiol compounds with lactobacillus brevis. Biol Pharmacol Bull, 1999, 22(5)∶ 491．

2 李秀玉.《傅青主女科》白芍應(yīng)用辨析.北京中醫(yī), 1999(3)∶ 16.

3 王景霞,張建軍,李偉,等.白芍提取物對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及大腦皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響.中華中醫(yī)藥雜志, 2010, 25(11)∶ 1895-1897.

4 吳玉梅,許漢鵬,王春婷,等.芍藥苷對培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元的保護作用.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2002, 16(3)∶ 172.

5 孟凡榮,馬建偉,趙宗江,等.滋 腎通絡(luò)方含藥血清對高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞增殖的影響.世界中醫(yī)藥, 2013, 8(4)∶ 431-433.

6 田晨,趙宗江,張新雪,等.補腎益髓生血法AA 大鼠含藥血清對大鼠造血干細胞紅系分化JAK2/STAT5信號通路的影響.世界中醫(yī)藥, 2014, 9(6)∶ 713-721.

7 崔曉蘭,賀玉琢,高英杰.中藥藥理研究的新思路——中藥血清藥理學(xué).中國中醫(yī)藥科技, 1997, 4(4)∶ 239-250.

8 謝錦玉.現(xiàn)代細胞化學(xué)技術(shù)及其在中西醫(yī)藥的應(yīng)用.北京:中醫(yī)古籍出版社, 1998∶ 64-83.

9 王海蘋. P MS肝氣逆證大鼠含藥血清對體外原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元活力及5-HT1A受體影響.濟南:山東中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2005∶ 3-13.

Detection of Time-Concentration Curve for Paeoniflorin of Baixiangdan Capsule with HPLC in Rats

Wang Jieqiong, Gao Dongmei, Yu Yanhong, Wei Sheng, Zhang Yuanyuan, Zhang Huiyun, Qiao Mingqi
(Laboratory of Traditional Chinese Medicine Classical Theory, Ministry of Education, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

The goal of the investigation was to detect the time-concentration curve of paeoniflorin of Baixiangdan capsule in rats in vivo with HPLC, and screen out the best drawing-blood time in order to lay the foundationfor further mechanism researches of Baixiangdan capsule. In this study, accuracy and precision of HPLC were determined in accordance with selected methodology inspection. Baixiangdan capsules were dissolved as l mL/100 g in proportion. Then administration of Baixiangdan solution was given twice a day for continuous three days. At 10, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360 min after administration, 1 mL of peripheral blood was collected from fundus oculi venous plexus of rats, a nd mixed with methyl alcohol by 1∶4, centrifuged at 3 000 rpm for 15 min at 4℃. Then serum was collected and dried with N2flow, and dissolved at mobile phase. It was found that the RSD for intra- and interday precision of HPLC was less than 3%, while the recovery rate was 98.0%-102.0%. The time-concentration curve showed that the content of serum paeoniflorin reached to the peak at 2 h after the last administration. All the results indicated a good condition of intra- and interday precision of HPLC. The recovery rate was in the standard range, and met the requirements of quantitative detection, while the timeconcentration curve suggested that blood concentration of paeoniflorin was at peak at 2 h after administrating Baixiangdan solution, which may provide scientific evidences for compound treatment mechanism studies in the future.

HPLC method, Baixiangdan capsule, paeoniflorin, serum, time-concentration curve

10.11842/wst.2016.02.026< class="emphasis_bold">中圖分類號：R

R285

A

（責任編輯：朱黎婷 張志華，責任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-10-29

修回日期：2015-12-22

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項目（81173163）：從谷氨酸-γ氨基丁酸代謝通路探討肝氣逆、郁兩證發(fā)病機制，負責人：張惠云。

＊＊ 通訊作者：張惠云，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥調(diào)肝方藥藥理研究。