胡洪濤，朱志剛，閔勇，楊自文，黃大野，姚經(jīng)武，楊妮娜，龍同，程賢亮王開梅，朱文達(dá)，顏冬冬，陳偉，曹春霞，曹坳程，邱正明（.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢，006；.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥所；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所；.湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所）

安徽銅陵白姜姜瘟病病原鑒定

胡洪濤1，朱志剛1，閔勇1，楊自文1，黃大野1，姚經(jīng)武1，楊妮娜1，龍同1，程賢亮1王開梅1，朱文達(dá)2，顏冬冬3，陳偉1，曹春霞1，曹坳程3，邱正明4
（1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢，430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥所；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所；4.湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所）

通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，銅陵白姜姜瘟病在銅陵當(dāng)?shù)乇憩F(xiàn)出木質(zhì)部黃心和黑心2種癥狀，通過TTC平板分離、致病性測定、16S rDNA以及青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測表明，導(dǎo)致2種不同姜瘟病癥狀的病原菌均為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），但二者致病性存在明顯差異。

銅陵；白姜；姜瘟??；青枯雷爾氏菌；病原鑒定

由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）侵染造成的細(xì)菌性青枯病是世界性重要病害之一，該菌可侵染54個(gè)科的450多種植物[1]，但以茄科作物，如番茄、馬鈴薯等，受害最為嚴(yán)重。生姜青枯病，因其發(fā)病快、死亡率高、無有效防治手段，所以俗稱姜瘟病[2]。安徽銅陵白姜種植歷史悠久，姜塊色白鮮嫩汁多、香味純正、品質(zhì)優(yōu)良，并具藥用價(jià)值，宋朝時(shí)被列為朝廷貢品，被譽(yù)為銅陵“八寶”之一。銅陵白姜種植面積約為400 hm2，年產(chǎn)量約為4 000 t，年產(chǎn)值近億元，是當(dāng)?shù)刂匾奶厣r(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)[3]。銅陵市義安區(qū)是銅陵白姜主產(chǎn)區(qū)，近年來該區(qū)姜瘟病的發(fā)生日益嚴(yán)重，連作田發(fā)病率50%以上，重病田甚至絕收，已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了當(dāng)?shù)厣a(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。盡管對姜瘟病的研究進(jìn)行多年，然而對銅陵姜瘟病病原的研究甚少。為此，開展了銅陵白姜姜瘟病病原檢測的研究，以期為進(jìn)一步有效防治該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2016年5～8月，在銅陵市義安區(qū)興化村等主要白姜產(chǎn)區(qū)分別挖取葉部呈現(xiàn)萎蔫狀的生姜姜塊，用清水將其表面泥土沖洗干凈，吸水紙吸干，冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 病原菌分離

病原菌分離均于采樣后48 h內(nèi)在超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)A2）上完成。樣品先用無菌水沖洗3遍，晾干至表面無明顯水滴，在75%的酒精中浸泡2～3 min，再用無菌水沖洗3遍，晾干至表面無明顯水滴，用消毒刀片在姜塊中部表面切一道長2～4 cm、深約2 mm的切口，用消毒鑷子將其掰開，并用消毒牙簽蘸取姜塊中間部位汁液，在TTC平板上劃線分離[4]。將分離平板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h，所得單菌落超低溫（-80℃）保存于25%甘油管中。

1.3 致病性測定

病原菌制備∶將病原分離物，接種于SPA液體培養(yǎng)基[5]，搖床（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)DLHR-Q200）發(fā)酵48 h（28℃，150 r/min）后，將分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器721型）OD560值調(diào)至1.0，測定菌液濃度約為1×108CFU/mL，備用。

將溫室生長至5～8葉的銅陵白姜植株從營養(yǎng)缽中取出，用清水將根部沖洗干凈，用消毒針在莖基部刺3個(gè)深度和間隔均約為1 cm的針孔，而后將根系置入病原菌發(fā)酵液中浸泡20 min。無菌水處理作為對照。每處理5株，重復(fù)2次。處理后的植株立即種植于營養(yǎng)缽中，置于人工氣候箱（光周期12 h/8 h，溫度30℃，濕度85%）內(nèi)培養(yǎng)7～10 d。

1.4 16S rDNA檢測

純化后的病原分離物直接用PCR擴(kuò)增，采用16S rDNA通用引物對（F∶5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R∶5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反應(yīng)體系（50 μL）∶2×ES Taq Mix 25μL，正反引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件∶95℃1 min，95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃5 min。引物合成和PCR產(chǎn)物測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.5 青枯菌鞭毛基因（fliC）基因檢測

根據(jù)NCBI中青枯菌鞭毛基因（fliC）序列設(shè)計(jì)引物對（F∶5'-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3'，R∶5'-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3'）。反應(yīng)體系和條件同1.4。

1.6 進(jìn)化樹分析

進(jìn)化樹分析在MEGA 7.0中完成。首先，采用Clustalw進(jìn)行DNA序列比對 （DNA Weight Matrix∶IUB，其他采用默認(rèn)參數(shù)）。進(jìn)化樹的構(gòu)建采用Maxium Likehood方法、Tamura-Nei模式。

圖1 銅陵白姜姜瘟病田間病株

圖2 銅陵白姜姜瘟病分離物致病性測試

圖3 銅陵白姜姜瘟病病原16S rDNA進(jìn)化樹分析

2 結(jié)果與分析

2.1 姜瘟病田間癥狀

在銅陵義安村田間調(diào)查表明，感染植株在患病初期，葉片褪綠，葉尖和葉緣先黃化，逐漸萎縮反卷下垂（圖1A、B），病葉逐步從基部向上發(fā)展，至全株枯死。病株莖基部逐漸變軟，維管束變色褐化、呈水漬狀，擠壓時(shí)，有污白色菌膿流出。患病姜塊變軟、維管束變色，根據(jù)維管束顏色，可分為黃色和黑色2種，俗稱為黃心（圖1C-a）和黑心（圖1C-b）。黑心和黃心患病植株的姜塊木質(zhì)部分別呈現(xiàn)黃色、黑色，而地上部癥狀無明顯差異，但相對于黃心癥狀，黑心癥狀病株萎蔫更快，病程更短。

2.2 致病性測試

致病性測試結(jié)果顯示，在接種后12 d后，植株葉片呈現(xiàn)萎蔫狀、卷縮，葉尖和葉緣失綠黃化，與田間病株癥狀完全一致（圖2），表明所分離的病原物為姜瘟病病原。然而，接種黑心癥狀病原的植株萎蔫程度更甚、失綠更為嚴(yán)重，提示黑心癥狀病原的致病性可能更強(qiáng)。

圖4 青枯菌鞭毛基因（fliC）PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3 病原形態(tài)鑒定

導(dǎo)致白姜黑心和黃心癥狀的病原分離物在TTC培養(yǎng)基菌落均為近圓形或梭形，中間略微凸起、中間粉紅色至紅色、周圍為白色。病原菌均為單胞、桿狀，大小為（0.5～0.7）μm×（1.5～2.0）μm，革蘭氏染色陰性，而結(jié)晶紫染色顯示兩極著色深，與前人報(bào)道一致[6，7]。

2.4 16S rDNA測序

采用16S rDNA通用引物對擴(kuò)增和測序，結(jié)果表明，2種癥狀病原分離物的16S rDNA產(chǎn)物長度均為1 439 bp（NCBI序列 號(hào) ∶KX785159.1 和KX785160.1）。黃心和黑心癥狀病原的16S rDNA序列與NCBI里保存的青枯雷爾氏菌有高度相似性（＞99%）（圖3），而與其他菌如 Bukholderia、Bacillus等，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，表明無論是黃心還是黑心癥狀病原菌均為青枯雷爾氏菌。

2.4 青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測

為進(jìn)一步確定銅陵白姜姜瘟病病原，根據(jù)前人研究結(jié)果[8]，針對青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）在NCBI上設(shè)計(jì)了1對引物，用于青枯菌特檢測，結(jié)果如圖4所示。測序結(jié)果顯示，黃心和黑心癥狀的青枯菌 fliC基因PCR產(chǎn)物長度分別為 368、370 bp。由于5'端20～30 bp和3'端10 bp測序質(zhì)量較低，因此，將兩端低質(zhì)量的堿基去掉，所得序列與NCBI中所保存的青枯菌fliC基因序列進(jìn)行比對。如圖5所示，導(dǎo)致白姜黃心和黑心癥狀的青枯菌fliC基因序列與NCBI保存的青枯菌完全一致。綜上所述，可以確定導(dǎo)致銅陵白姜黃心和黑心癥狀姜瘟病的病原均為青枯菌。

圖5 銅陵白姜姜瘟病原fliC基因（部分）序列比對

3 討論與結(jié)論

銅陵白姜為我國具有地方特色的名特優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，而近年來，日益嚴(yán)重的姜瘟病已經(jīng)給當(dāng)?shù)匕捉a(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，制約了白姜產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。然而長期以來，缺乏對其病原菌的科學(xué)鑒定。本研究通過實(shí)地調(diào)研，發(fā)現(xiàn)姜瘟病病株表現(xiàn)為黃心和黑心2種不同癥狀，而通過TTC平板分離、形態(tài)學(xué)、致病性測定和分子生物學(xué)等手段，對銅陵白姜姜瘟病病株進(jìn)行分離和鑒定，明確其病原均為青枯菌，但二者的致病性存在明顯差異。

16S rDNA序列分析是植物病原細(xì)菌鑒定和分類的重要手段和依據(jù)[9]。經(jīng)序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析證明銅陵白姜姜瘟病2種癥狀的病原與已知青枯菌在同一分支。然而，盡管2種癥狀病原遺傳距離相當(dāng)近，但仍然存在微小差距。盡管青枯菌特異性鞭毛基因擴(kuò)增結(jié)果表明，黃心和黑心癥狀病原的序列與已知青枯菌完全一致，但由于致病性和16S rDNA序列存在差異，提示導(dǎo)致黃心和黑心癥狀青枯菌可能為不同的株系或者分化型[8]。前人研究表明，不同地區(qū)或寄主的青枯菌表現(xiàn)出明顯生理分化或菌系多樣性[10]，而在地理位置和寄主相同的情況下，發(fā)現(xiàn)毒力差異性的青枯菌的相關(guān)報(bào)道尚不多見。青枯菌的致病性受多種基因調(diào)控[11]，如果能從基因組學(xué)角度，深入研究其在DNA和轉(zhuǎn)錄組水平方面的差異，將有助于揭示青枯菌致病性的調(diào)控機(jī)制[12]。

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Pathogen Identification for Ginger Bacterial Wilt of White Ginger in Tongling of Anhui Province

HU Hongtao1,ZHU Zhigang1,MIN Yong1,YANG Ziwen1,HUANG Daye1,YAO Jingwu1, YANG Nina1,LONG Tong1,CHENG Xianliang1,WANG Kaimei1,ZHU Wenda2, YAN Dongdong3,CHEN Wei1,CAO Chunxia1,CAO Aocheng3,QIU Zhengming4
(1.Hubei Bio-pesticide Engineering Research Center,Wuhan 430064;2.Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer, Hubei Academy of Agricultural Sciences;3.Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences; 4.Institute of Economic Crops,Hubei Academy of Agricultural Sciences)

Field investigation revealed that plants infected with ginger bacterial wilt of white ginger showed two different symptoms,yellow-heart and black-heart in the xylem.Through the experiments of TTC plate separation,pathogenicity determination,sequencing of 16S rDNA and flagellum gene (fliC),we found that both the two different symptoms were caused byRlastonia solanacearum,but their pathogenicity had significant difference.

Tongling;White ginger;Ginger bacterial wilt;Ralstonia solanacearum;Pathogen identification

∶S632.5

∶A

∶1001-3547（2016）24-0075-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.24.029

湖北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （2016-620-000-001-039）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基金（2016NKYJJ31）

胡洪濤（1974-），男，博士，研究方向?yàn)樽魑锿羵餍圆『ι锓乐魏头肿又参锊±?，電話?27-59101937，E-mail：hzh0005@qq.com

曹春霞（1975-），女，通信作者，研究員，研究方向?yàn)樯镛r(nóng)藥劑型，電話：027-59101989，E-mail：cao-chunxia@163.com

曹坳程（1963-），女，通信作者，研究員，研究方向?yàn)橥羵餍圆『Ψ揽兀珽-mail：caoac＠vip.sina.com

2016-11-14