湯謐，劉曄，任儉，張娜，曾紅霞，程維舜，李煜華，孫玉宏（武漢市農業(yè)科學技術研究院作物科學研究所，430345）

風味甜瓜中檸檬酸代謝研究進展及RNA-seq技術應用現(xiàn)狀

湯謐，劉曄，任儉，張娜，曾紅霞，程維舜，李煜華，孫玉宏
（武漢市農業(yè)科學技術研究院作物科學研究所，430345）

摘 要：隨著人們生活水平的提高，兼具品質、營養(yǎng)和健康特征的甜瓜新品種——風味甜瓜應運而生，探索適度的風味甜瓜糖酸比非常重要，而目前對甜瓜果實中主要有機酸成分檸檬酸的代謝機制尚不清晰，因此，綜述了風味甜瓜果實檸檬酸代謝特性的研究進展，并對利用RNA-seq技術分析甜瓜果實檸檬酸代謝關鍵基因的挖掘提出了一些展望。

關鍵詞：風味甜瓜；檸檬酸；RNA-seq技術；基因挖掘；研究進展

中圖分類號∶S651文獻標識碼∶A文章編號∶1001-3547（2016）24-0040-05

甜瓜（Cucumis meloL.），葫蘆科（Cucurbitaceae)甜瓜屬（Cucumis）一年生蔓性草本植物。其果實通常呈球形或長橢圓形，果皮平滑，有縱溝紋；果肉白色、黃色或綠色，味美甘甜；含有豐富的蛋白質、維生素、煙酸、鈣、鐵等營養(yǎng)物質，是夏季常見的消暑瓜果之一，在果蔬生產和消費中占據著重要地位。2012年全國甜瓜播種面積達41萬hm2，總產量高達1 330萬t，已穩(wěn)超麻類、煙草等經濟作物，成為農業(yè)增產、農民增收的高效園藝作物（《全國西瓜甜瓜產業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2015-2020年）》；2014年，全國甜瓜播種面積達43.89萬hm2，總產量達1 475.80萬t（《中國農業(yè)統(tǒng)計資料（2014）》）。但是隨著人們生活水平的提高，傳統(tǒng)的高糖純甜單一口味的甜瓜已不能滿足人們的多樣化需求，兼具品質、營養(yǎng)和健康特征的果蔬越來越受歡迎，糖、酸含量較高的甜瓜新品種——風味甜瓜因此問世。

外觀、營養(yǎng)和風味是決定甜瓜品質的關鍵，而風味品質是消費者尤為追求的。甜瓜風味品質主要由可溶性糖和有機酸的含量決定，適當的糖酸比有助于果實風味品質的提升，產生最佳的口感[1]。因此，研究這2種物質的調控機制和代謝轉化非常重要。研究表明，甜瓜品種不同，其果實內可溶性糖的成分和含量有差異，早熟甜瓜品種，由于生育期短，光合產物提前進入果實，因此其可溶性糖的主要成分是果糖和葡萄糖；中晚熟甜瓜品種，果實發(fā)育前期可溶性糖主要成分是果糖和葡萄糖，后期主要是蔗糖[2]，而總糖、果糖、葡萄糖和蔗糖含量均受主基因和多基因控制[3]；甜瓜果實中可溶性糖的積累主要發(fā)生在果實發(fā)育的中后期，其與蔗糖磷酸合成酶和酸性轉化酶的活性有關，若合成酶活性升高而轉化酶活性降低，糖分就會不斷積累[4]。除此之外，溫光因子也會影響糖分含量的積累，如日溫差積累對果實總糖含量有影響，有效積溫積累對果實葡萄糖含量有影響，而有效輻射積累對果實果糖和蔗糖含量均有影響[3]。

有機酸成分和含量也是影響果實風味品質的主要因素，其成分以檸檬酸為主，還包括蘋果酸、琥珀酸等。研究表明，甜瓜中有機酸積累的遺傳多態(tài)性較低；此外，日溫差積累對果實總酸、檸檬酸、蘋果酸含量影響較大[3]，而在目前研究中對于調控檸檬酸代謝的調控機制還不是特別清晰，其分子標記方面的研究也較少[5]，挖掘的關鍵基因也比較少，因此，運用RNA-seq技術研究甜瓜果實中檸檬酸代謝特性，并挖掘其中主要的調控基因，對提高甜瓜果實檸檬酸的含量具有重要作用。

1 檸檬酸代謝途徑研究進展

葡萄糖經過三羧酸循環(huán)生成丙酮酸，丙酮酸主要有兩方面的去處，一是在丙酮酸脫氫酶的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA（乙酰輔酶A），二是在丙酮酸羧化酶的作用下羧化生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA在檸檬酸合酶的作用下縮合生成檸檬酸。Lobit等[6]利用依賴于簡化的線粒體三羧酸循環(huán)表示的檸檬酸代謝模型預測了果實快速生長期檸檬酸的含量，該模型僅考慮了三羧酸循環(huán)的3個中間體（檸檬酸、蘋果酸和丙酮酸），并假設2個組分之間的流動僅受酶活性、溫度、初始濃度、目標組分濃度的影響，結果發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)產生的CO2被呼吸作用同化后，在細胞質和線粒體之間的流動除了受溫度和酶活性影響外，主要受兩區(qū)室之間的濃度梯度影響[3]。

1.1 風味甜瓜中的檸檬酸代謝

經過前人的研究可以看出，風味甜瓜果實中的有機酸主要是檸檬酸[7，8]，其含量占果實鮮質量的1.0%，而傳統(tǒng)甜瓜僅為0.2%[9]。研究表明，甜瓜中有機酸含量由主基因和多基因控制，而檸檬酸合成酶、乙烯、Ca2+-CaM信號系統(tǒng)這3類基因的上調表達均與檸檬酸積累有關[3]。湯謐[9]以風味3號甜瓜為研究對象，發(fā)現(xiàn)PEPC（檸檬酸合酶）、CS（丙酮酸羧化酶）、IDH（異檸檬酸合酶）和MDH（蘋果酸脫氫酶）這4種酶活性變化與檸檬酸含量的變化呈顯著相關?？梢?，在植物細胞中，檸檬酸的積累不是單一的某一生化反應的結果，而是一系列生理過程的綜合結果。

1.2 其他園藝作物中的檸檬酸代謝

檸檬酸代謝特性在柑橘類研究中已比較成熟。孫琦[10]指出檸檬酸降解有2條途徑∶一條途徑是在順烏頭酸酶（ACO）的催化下被轉化為異檸檬酸，另一條途徑是在ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-CL）的作用下，被分解為草酰乙酸和乙酰輔酶A。此外，檸檬酸通過谷氨酸代謝途徑也從兩方面實現(xiàn)了轉化和減酸，一是在GAD（谷氨酸脫羧酶）的作用下，檸檬酸進入GABA（γ-氨基丁酸）循環(huán)而被消耗，二是在GS（谷氨酰胺合成酶）的催化下形成谷酰胺，進入氨基酸代謝途徑。檸檬酸在柑橘中的代謝機制表現(xiàn)為檸檬酸→異檸檬酸、酮戊二酸和谷氨酸，此后谷氨酸被分解 （分解代謝的途徑為谷氨酸→GABA→琥珀酸半醛→琥珀酸）或者用于合成谷氨酸鹽[9]。在研究檸檬酸與蘋果酸的轉運途徑時，Rafaelr等[11]主要研究了其在檸檬酸通道中的作用，結果發(fā)現(xiàn)，蘋果酸能強烈地抑制檸檬酸離子通道運輸，但對依賴ATP的檸檬酸轉運影響很小，因此認為在柑橘果肉細胞中，檸檬酸及蘋果酸進入液泡的通道相同。檸檬酸從細胞質轉運到液泡時，需要通過液泡上的H+-ATP酶（V-ATPase）調節(jié)，同時在轉運的過程中也伴隨著質子的流動[12]。

2 風味甜瓜中調控檸檬酸代謝的主要基因研究進展

雖然對于風味甜瓜果實中檸檬酸的代謝機制的研究尚不清楚，但目前運用分子標記等現(xiàn)代生物技術已挖掘了其中的一些關鍵基因。Cohen等[13]將與檸檬酸含量有關的數量性狀位點（QTL）定位到連鎖群上，結果檢測到5個和檸檬酸含量有關的QTLs，其分別位于LGⅣ、LGⅧ、LGⅪ、LGⅫ上。朱慧芹[14]利用六世代聯(lián)合分離分析法發(fā)現(xiàn)，檸檬酸含量受1對加性-顯性主基因和加性-顯性上位性多基因（DO）控制。朱慧芹等[15]以口感酸甜味差異明顯的甜瓜品種為研究對象，定位了3個與檸檬酸含量有關的QTL（cit7.1、cit8.1、cit8.2），結果發(fā)現(xiàn)其分別位于LGⅦ、LGⅧ上；林瓊[16]發(fā)現(xiàn)在柑橘中，其檸檬酸降解以谷氨酰胺途徑為主，而最有可能與CitCHX、CitALMT和CitDIC這3個轉運蛋白基因有關。

3 RNA-seq技術的發(fā)展現(xiàn)狀及其在主要作物中的應用

3.1 RNA-seq技術及其發(fā)展現(xiàn)狀

RNA-seq就是通過高通量測序技術，檢測mRNA、smallRNA、LncRNA等的序列信息，研究其表達水平的一種方法。現(xiàn)如今，高通量測序技術已廣泛運用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領域，并在農業(yè)領域獲得諸多成果。例如在果蔬作物的研究中，已完成對葡萄、番木瓜、蘋果、草莓、香蕉、梨、甜橙、克里曼丁柑橘和桃等作物的全基因組測序，這有助于在相關物種上開展基因和啟動子挖掘、分子遺傳標記開發(fā)、全基因組關聯(lián)分析、比較基因組學等研究[17]。轉錄組是連接基因組與代謝組的紐帶，轉錄組測序是對已完成全基因組測序物種進行深入研究的有效方法[18]。相較于基因組學，轉錄組學針對的是被轉錄表達的部分特定基因，其研究范圍縮小，針對性更強。

與傳統(tǒng)的EST測序或芯片技術相比，RNA-seq技術對轉錄物及其可變剪切體表達水平的檢測更加精確，并有助于新的基因、轉錄產物的發(fā)掘及基因結構變化的發(fā)現(xiàn)。因此，RNA-seq被認為是轉錄組研究的一個革命性工具[19，20]。目前應用比較普遍的測序平臺是Illumina，如運用HiSeq 2000測序儀，采用邊合成邊測序的技術手段，能同時檢測數億條序列信息，并對表達豐度極低的序列有較好的檢測效果[21]。

3.2 RNA-seq技術在農業(yè)領域中的應用

對于已知全基因組序列的物種，比對轉錄組測序信息，可以研究基因的表達差異、結構變化，并發(fā)現(xiàn)新基因。近年來，該技術得到廣泛運用，并取得了良好結果。Filichkin等[22]對擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉錄組進行測序，發(fā)現(xiàn)至少42%的內含子基因存在可變剪接；Zhang等[23]對水稻（Oryza sativa）轉錄組進行深度測序，發(fā)現(xiàn)了7 232個有組織特異性的新轉錄本和23 800個可變剪接，為分析水稻復雜的轉錄機制提供了廣泛的依據；李瀅等[24]應用Roche 454（GS FLX Titanium System）對二年生丹參根的轉錄組進行測序，研究其基因表達譜，挖崛其功能基因，共獲得18 235條Unigene，其中，13 980條Unigene為首次發(fā)現(xiàn)。于安民[25]采用高通量RNA-seq測序技術，首次獲得了陽春砂的轉錄組信息和3個不同發(fā)育期果實的表達譜信息，為陽春砂果實發(fā)育過程中糖和萜類代謝的研究提供了重要的遺傳信息，為深入研究陽春砂果實發(fā)育及次生代謝調控的分子機制奠定了重要基礎。

3.3 RNA-seq技術在園藝作物中的應用

Zenoni等[26]通過Illumina GAⅡ測序平臺，對葡萄（Vitis vinifera）坐果、著色、成熟3個發(fā)育期的果實進行轉錄組研究，通過與參考基因組比對，發(fā)現(xiàn)了多個MYB轉錄因子家族、谷胱甘肽轉移酶家族的新基因以及可變剪接。楊侃侃[27]通過RNA-seq技術，檢測了黃皮、綠皮西瓜在不同生長時期的基因表達變化，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因主要體現(xiàn)在細胞組成、分子功能、生物過程等方面。馮超[28]對楊梅不同時期的果實進行RNA-seq，分析了楊梅的密碼子偏好性并鑒定出4個高頻密碼子，檢測到果實成熟期蔗糖累積和有機酸降解的關鍵基因，分別是蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因和GAD基因；對不同有機酸含量的楊梅品種進行進一步RNA-seq發(fā)現(xiàn)，液泡H+-ATPase（V-ATPase）B亞基的基因可能對不同品種楊梅的有機酸含量起決定作用。魏海蓉[29]通過對不同品種的櫻桃進行RNA-seq，共發(fā)現(xiàn)18個與花青素生物合成相關的基因。

4 RNA-seq技術在甜瓜中的應用及對果實檸檬酸代謝特性的分析展望

高通量測序技術在甜瓜的研究中也有著廣泛的應用。2012年甜瓜基因組測序完成，為關鍵基因發(fā)掘奠定了重要基礎。牛鵬輝[30]通過對甜瓜的全基因組數據分析，共鑒定出56個轉錄因子基因家族，并篩選出14個候選的內參基因。陳嘉貝等[31]對在鹽脅迫環(huán)境下不同品種甜瓜進行RNA-seq分析，共發(fā)現(xiàn)27個響應鹽脅迫的轉錄因子，其中18個轉錄因子表達量下調，9個上調。

目前，檸檬酸代謝的調控機制還不明確，也只是運用傳統(tǒng)的分子標記來進行基因定位。而利用RNA-seq技術進行全基因組測序已成為時代的潮流，運用RNA-seq技術研究甜瓜果實檸檬酸代謝特性，并挖掘其中主要的調控基因，將會為豐富風味甜瓜的品質研究提供可能。

鑒于如今RNA-seq技術的快速發(fā)展，以及RNA-seq技術自身的優(yōu)勢，已在很多物種上開展基因和啟動子挖掘、分子遺傳標記開發(fā)、全基因組關聯(lián)分析、比較基因組學的研究。在甜瓜檸檬酸代謝研究中運用RNA-seq技術，將有助于在甜瓜中挖掘更多調控檸檬酸代謝的基因。下一步我們的研究也將引入轉錄組學的研究策略，對不同發(fā)育時期（前期、中期、后期）的果實進行RNA-seq測序，系統(tǒng)研究果實發(fā)育不同階段的轉錄組變化，對基因的差異表達進行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因所參與的主要生物學過程，挖掘與檸檬酸代謝有關的基因，構建相關基因的調控網絡，分析相關基因在果實不同發(fā)育時期的表達水平，同時測定相關基因編碼酶在果實不同發(fā)育時期的活性以及檸檬酸含量，為揭示風味甜瓜檸檬酸積累的分子機制奠定基礎，也為豐富甜瓜果實的品質研究提供可能。

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Research Progress of Citrate Metabolism and Application Status of RNA-seq Technology on Flavor Melon

TANG Mi,LIU Ye,REN Jian,ZHANG Na,ZENG Hongxia,CHENG Weishun,LI Yuhua,SUN Yuhong
(Institute of Crop Sciences,Wuhan Academy of Agricultural Science and Technology,430345)

With the growth of the living standard,traditional melon with high sugar can't meet consumers'diversification demands,so flavor melon,a new melon cultivar is born at the right moment with the speciality of quality,nutrition and health.It is very important to excogitate the best sugar-acid ratio,since the metabolic mechanism of the main organic acid of citric acid in melon is not clear.This paper summarized the research progress of citrate metabolism on flavor melon,and put forward the prospect about exploring some key genes related with citrate metabolism on flavor melon using the RNA-seq technology.

Flavor melon;Citric acid;RNA-seq;Gene discovery;Research progress

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.24.017

湯謐（1981-），女，高級農藝師，從事西瓜甜瓜品種選育與栽培技術研究工作，E-mail：344463296@qq.com

孫玉宏（1968-），通信作者，女，正高職高級農藝師，常年從事西瓜甜瓜品種選育和相關栽培技術研究與推廣工作

2016-11-08