祁 浩，劉新利

(齊魯工業(yè)大學生物工程學院，山東濟南 250353)

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大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)的研究進展

祁 浩，劉新利*

(齊魯工業(yè)大學生物工程學院，山東濟南 250353)

由于DNA重組技術和蛋白組技術的發(fā)展與成熟，外源基因表達技術備受關注。其在生物、食品、工業(yè)以及醫(yī)學領域發(fā)揮著舉足輕重的作用。以原核生物細胞及真核生物細胞作為表達系統(tǒng)，進行目的基因序列的表達以生產(chǎn)蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制劑等是近年來發(fā)酵工業(yè)的新型領域。原核和真核表達系統(tǒng)是近年來研究和應用最廣泛和最成熟的外源基因表達系統(tǒng)。對近年來關于大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)的研究進展進行了綜述。

大腸桿菌表達系統(tǒng)；酵母表達系統(tǒng)；表達載體；外源基因；宿主菌株

自20世紀七八十年代以來，由于分子生物學和蛋白組學的迅猛發(fā)展，各種外源基因表達的遺傳操作技術日趨成熟[1]。其中，大腸桿菌等原核表達系統(tǒng)具有遺傳背景研究清楚、操作簡單、生長繁殖快、成本低、產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物純化過程簡單、產(chǎn)物穩(wěn)定性好、不易污染以及應用范圍廣等優(yōu)點，是最早進行研究的外源基因表達系統(tǒng)，同時也得到了非常廣泛的應用，取得了巨大的科研價值和經(jīng)濟效益[2-3]。

酵母菌是一類單細胞真核微生物，尤其是對釀酒酵母的應用可以追溯到幾千年以前。同時，隨著科學技術的不斷發(fā)展，酵母的生物學和遺傳學背景也已經(jīng)研究得十分清楚。由于酵母菌具有生長旺盛、生長周期短等特性，近年來，在外源基因表達方面得到了深入研究和廣泛應用[4-5]。利用酵母系統(tǒng)表達外源基因時，既具有原核生物生長繁殖快、遺傳操作簡單的特點，又具有真核生物對外源蛋白進行翻譯后修飾加工的能力。表達外源基因常用的酵母種類有釀酒酵母和甲基營養(yǎng)型酵母[6]。隨著DNA技術的迅猛發(fā)展，利用大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)表達蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制劑等新型領域，開始進入產(chǎn)業(yè)化階段，但隨之帶來一系列問題。筆者對大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)的研究進展進行了綜述。

1　大腸桿菌表達系統(tǒng)

1.1大腸桿菌表達載體大腸桿菌作為原核生物，因其具有培養(yǎng)條件簡單、生長速度快、操作簡單以及不易污染等特點而成為原核表達系統(tǒng)中占據(jù)優(yōu)勢的菌株。表達系統(tǒng)中最重要的元件是表達載體，表達載體應當具有表達量高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣等優(yōu)點。表達載體主要包括啟動子、表達閱讀框、終止子、復制起點以及抗性篩選標記等重要元件[7-8]。

近年來的研究表明，在科研和工業(yè)上被廣泛應用的大腸桿菌表達載體主要有pGE系列、pQE系和pET系列，其中目前被廣泛應用的高效表達載體是pET。此系統(tǒng)是在大腸桿菌中表達外源蛋白最高效、產(chǎn)量最高、成功率最高的表達載體。 它最初是利用與啟動子配套并且能高效轉錄特定基因的外源RNA聚合酶構建的T7RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)，可以從各種基因(包括原核細胞、真核細胞)生產(chǎn)大量的目的蛋白[9]。

1.2外源基因結構外源基因是整個表達過程最關鍵的因素，因為它決定了通過表達系統(tǒng)是否得到目的產(chǎn)物。原核基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中可以直接進行表達，而真核基因屬于斷裂基因，其基因組DNA中的基因區(qū)別于原核基因，是不連續(xù)的，其中含有內含子序列，轉錄出的前體mRNA不能被大腸桿菌進行剪切，從而形成有功能的mRNA，不能完成正常的蛋白翻譯功能，因此無法在大腸桿菌表達系統(tǒng)中直接進行表達[10]。大腸桿菌不能識別真核基因轉錄和翻譯元件，所以必須提供大腸桿菌識別的轉錄及翻譯元件，以保證真核基因的表達。例如，真核基因的前導肽不能被大腸桿菌識別，因此在設計真核基因時應去除前導肽序列，必要時換以原核的信號肽序列。此外，許多蛋白質都是以無活性的前體蛋白的形式表達，必須通過翻譯后的加工修飾才能成為真正有活性的功能蛋白，因此在設計外源基因序列時應從活性蛋白質編碼序列開始[11]。

1.3表達宿主作為外源基因的表達宿主，對其表達活性和表達量會產(chǎn)生很大的影響。每個宿主細胞都可以被看成一個微觀的小型工廠，按照細胞固有的程序完成一系列活動。菌株內源的蛋白酶過多，可能會造成目的基因產(chǎn)物表達的不穩(wěn)定性，所以理想的宿主菌株往往是蛋白酶缺陷型的菌株。其中，最經(jīng)典的蛋白酶缺陷型菌株就是BL21系列菌株。BL21(DE3)是其中研究最成熟的菌株，添加了T7聚合酶基因，是為T7表達系統(tǒng)而設計的[12-13]。

1.4影響外源基因表達的關鍵因素不同的目的基因具有不同的結構多樣性，并且與大腸桿菌基因有明顯的差異性，因此不同外源基因的表達效率往往存在很大的差異。載體(啟動子)和宿主菌的選擇、密碼子的選用、mRNA的穩(wěn)定性、培養(yǎng)條件的控制和表達產(chǎn)物的后加工處理等因素都是影響大腸桿菌表達外源蛋白的關鍵因素。

表達載體是整個表達系統(tǒng)中最關鍵的元件。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中有很多的載體可以表達外源基因，這些載體通常具有以下共同的特征：高拷貝數(shù)、產(chǎn)量高、應用范圍廣、表達產(chǎn)物易純化以及在菌體內穩(wěn)定性好。研究表明，大腸桿菌表達外源基因適用的載體包括融合表達載體、分泌型表達載體和共表達載體等[14]。

1.4.1融合表達載體。表達載體可以插入目的基因之外的輔助基因序列，并且與目的基因構成融合蛋白基因序列進行表達，可以提高外源蛋白的活性和產(chǎn)量，并且可以簡化下游純化的操作等。融合蛋白基因與外源基因結合，可以利用融合信號肽將融合蛋白分泌到細胞周質或胞外表達，有利于形成二硫鍵以及避免胞質蛋白酶的水解，同時有利于目的蛋白的分離和純化[15]。研究表明，成功的融合表達載體包括GST(谷胱甘肽轉移酶)系統(tǒng)、半乳糖苷酶系統(tǒng)、麥芽糖結合蛋白(MBP)系統(tǒng)、蛋白A系統(tǒng)、純化標簽融合系統(tǒng)等[16]。

1.4.2分泌型表達載體。外源蛋白在大腸桿菌細胞內容易被宿主體內的蛋白酶降解，同時為了外源蛋白質能夠分泌到宿主體外進行正確折疊修飾和便于提純，所以被表達的外源蛋白需要分泌到宿主體外，因此分泌型載體是實現(xiàn)此步驟的關鍵因素，表達分泌蛋白防止宿主菌對外源蛋白的降解，同時減輕宿主細胞代謝負荷及對產(chǎn)物進行胞外正確折疊修飾，使其具有真正的生物學活性[17]。分泌型載體具有以下優(yōu)點：一些在胞內被蛋白酶降解的蛋白質在細胞周質中很穩(wěn)定；一些在胞內無活性的蛋白質分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白能夠正確折疊；產(chǎn)生的蛋白質沒有氨基酸末端甲硫氨酸，因為切割位點在信號肽與編碼序列之間，甲硫氨酸會影響許多蛋白質的活性[18-19]。

1.4.3共表達載體。絕大多數(shù)真核基因表達的產(chǎn)物若要表現(xiàn)出相應的生物活性都必須以多聚復合體的形式組合，因此構建共表達載體來表達這類外源基因是表達產(chǎn)物有無活性的最關鍵一步，同時新生蛋白質在后期的折疊和分泌過程中共表達策略也起到至關重要的作用。有研究人員構建了可與pET載體共表達的載體pOKD，用于表達異源二聚體外源基因，這種載體可以與大多數(shù)大腸桿菌表達載體共存于細胞中[20]。Marco 等[21]設計了共同表達分子伴侶的3載體系統(tǒng)，其中2種載體分別攜帶不同的分子伴侶，另外1種載體攜帶目的基因，分子伴侶與目的基因被分別獨立誘導。例如，從嗜冷菌中分離的一類分子伴侶Cpn60和Cpn10共同表達后可以使大腸桿菌在4 ℃低溫下生長，這樣的環(huán)境有利于蛋白的正確折疊，有利于提高表達產(chǎn)物的活性和產(chǎn)量[22]。

研究表明，大腸桿菌表達外源基因的技術越來越成熟，為今后的科學研究和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了極大的可能性和經(jīng)濟價值，但是目前仍然有關鍵問題需要解決，因為還有一部分與外源蛋白表達相關的調控通路未知，有些與大腸桿菌代謝途徑對外源基因表達影響的因素沒有解決。

2　酵母表達系統(tǒng)

酵母是低等的單細胞真核生物，遺傳背景清楚，既具有原核生物細胞生長迅速、容易培養(yǎng)、遺傳操作簡單等特點[23]，又具有真核生物表達外源蛋白時對蛋白質的翻譯后加工和修飾等功能。因此相對于大腸桿菌等原核表達系統(tǒng)，酵母表達出的蛋白是結構更加復雜、具有生物學活性且酵母表達系統(tǒng)比其他真核表達系統(tǒng)遺傳背景清楚、遺傳操作簡便、生長周期短，成本低。因此，酵母表達系統(tǒng)在表達外源蛋白方面有著明顯的優(yōu)勢[24-25]。

目前工業(yè)生產(chǎn)中最重要的外源蛋白表達系統(tǒng)是酵母表達系統(tǒng)，通過表達分泌途徑可以將目的蛋白分泌到細胞外，提取純化過程技術成熟簡便，為其大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎，并且在發(fā)酵生產(chǎn)中安全性較高。酵母表達系統(tǒng)既具有遺傳操作簡單和生長周期快等特點，又具有真核細胞的翻譯后修飾加工的優(yōu)勢，在工業(yè)生產(chǎn)中可以大規(guī)模生產(chǎn)，因此具有極大的經(jīng)濟價值[26]。酵母表達系統(tǒng)最常用的宿主菌株有釀酒酵母、畢赤酵母和裂殖酵母。

經(jīng)過多年的研究，大腸桿菌等原核生物表達系統(tǒng)得到了長足的發(fā)展，由于其安全性較差，因此在生物醫(yī)藥領域仍然具有很大的局限性?？紤]到醫(yī)藥蛋白的安全性與某些蛋白的特殊性，真核生物表達系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢[27-28]，如酵母表達菌株。以酵母表達系統(tǒng)來表達醫(yī)藥蛋白的宿主菌主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、畢赤酵母(Pichiapastoris)和耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)，其中以釀酒酵母的應用最為廣泛[29]。

2.1酵母系統(tǒng)表達載體酵母細胞體內本身不帶有質粒，外源基因若要進入酵母體內，只能利用整合型穿梭質粒作為載體攜帶外源基因先在大腸桿菌中復制擴增，然后導入酵母細胞中，再攜帶外源基因的表達載體與酵母細胞染色體基因組整合，進而表達外源基因[30]。在畢赤酵母表達系統(tǒng)中主要應用2種載體，分別為誘導型表達載體和組成型表達載體。組成型表達載體以磷酸甘油醛脫氫酶啟動子為外源蛋白表達啟動子，不需要誘導，而誘導型表達載體以醇氧化酶基因啟動子啟動外源基因的表達，外源基因只能在甲醇的誘導下才能進行轉錄。在釀酒酵母表達系統(tǒng)中，常用的表達質粒是在這個表達載體中，目的蛋白的表達受到半乳糖激酶啟動子的控制，宿主菌表達半乳糖激酶用來分解半乳糖獲得能量，獲取能量的同時啟動半乳糖激酶啟動子下游基因的轉錄，外源基因以此得到表達[31-32]。

載體轉化到酵母宿主中的方式包括原生質體轉化法、電轉化法、聚乙二醇法和氯化鋰轉化法。轉化效率較高的是原生質體轉化法和氯化鋰法，原生質體轉化法易形成高拷貝數(shù)，但是操作步驟十分繁瑣，操作過程中極易受到污染。電轉化法操作簡便，轉化效率高且不易污染，目前已被廣泛應用[33]。

2.2目的基因表達框的改造提高目的蛋白在酵母表達系統(tǒng)中的表達量，目的基因啟動子的改造或替換是非常關鍵的一步。在釀酒酵母表達系統(tǒng)中最常用的高效表達啟動子主要是TEF1和TDH3。近年來研究表明，主要通過隨機合成寡核苷酸技術和易錯PCR技術對啟動子進行突變，來達到符合研究的啟動子。同時，在畢赤酵母中通過隨機突變，三磷酸甘油醛GAP啟動子的活性同樣得到了提高[34]。

誘導型啟動子是另一種重要的酵母表達外源基因的啟動子。GAL1和GAL10是2種最常用的酵母誘導型啟動子。但是，這2個啟動子的誘導物都是半乳糖，半乳糖作為碳源被酵母消耗，從而導致對基因表達的控制變得復雜，加之半乳糖的價格較高，因此在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中未得到廣泛應用[35]。AOX1是畢赤酵母中最常用的誘導型啟動子。AOX1啟動子以甲醇為誘導物，因此在工業(yè)生產(chǎn)中安全性得不到保障。研究表明通過對啟動子進行改造，可以提高其轉錄效率并且可以替換甲醇作為誘導物[36]。

在酵母表達系統(tǒng)中，除了啟動子因素外，影響外源蛋白表達的重要因素還包括密碼子偏好性和質?？截悢?shù)?？梢詫ν庠椿虻拿艽a子進行優(yōu)化，使其更加適合宿主菌的密碼子的偏好性，并通過改變4種堿基的比例可以有效提高外源蛋白的表達效率，提高產(chǎn)量。同時，高拷貝的質粒有利于蛋白表達量的提高，但是蛋白表達過量會加重宿主菌的代謝負擔，造成表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性下降。通常情況下，將表達載體重組在宿主的基因組上，有利于外源基因的穩(wěn)定性[37]。

2.3宿主菌的改造對酵母宿主的改造是另一種重要的途徑。很多外源蛋白在酵母中能進行高效表達，但是它們需要分泌到細胞外才有意義。因此，若要提高目的蛋白的產(chǎn)量，可以通過改造酵母的分泌途徑來實現(xiàn)。外源蛋白的表達和分泌過程主要包括轉錄、翻譯、翻譯后修飾加工、蛋白折疊、糖基化、包裝、和分泌等步驟[38]。蛋白經(jīng)翻譯后首先會被轉移到細胞質基質中的內質網(wǎng)中，此過程中起到最關鍵作用的是信號肽與前導肽。由人工合成的α-交配因子的前導肽與酵母本身的前導肽在引導胰島素分泌的過程中具有類似的活性。在內質網(wǎng)中，最重要的就是蛋白的準確折疊，蛋白進入分泌途徑還是降解途徑由此來決定，若肽段錯誤折疊會加重內質網(wǎng)腔內的代謝負擔，引起未折疊蛋白反應[39]。過量表達內質網(wǎng)中蛋白質折疊因子和還原酶，可以有效改善內質網(wǎng)環(huán)境，促進蛋白質的折疊，從而提高蛋白質的分泌量。分泌過程的最后一步是目的蛋白從內質網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w，然后再次運輸?shù)郊毎诘哪遗葜校?個關鍵蛋白Sly1P、Sec1P的過量表達可以有效促進目的蛋白的分泌[40]。因此，對酵母宿主菌的改造不會只是局限于單個基因的缺失或過量表達，而是對一系列關鍵基因的共同改造，以此來提高目的蛋白的表達量。

3　展望

經(jīng)過近些年的不斷研究，現(xiàn)代分子生物學和DNA技術已經(jīng)得到了很大發(fā)展，發(fā)酵技術也日益成熟，微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)進入了飛速發(fā)展階段，由此開創(chuàng)了分子生物學和發(fā)酵領域巨大的科研和經(jīng)濟價值，在食品醫(yī)藥和保健品等領域都創(chuàng)造了巨大的價值。利用這些越來越成熟的科學技術，科學工作者構建了一系列的真核表達體系以及原核表達體系，構建了一系列高效的表達載體以及與其搭配的宿主菌，但是在各宿主菌中仍然存在一些問題。

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Research Progress of Expression Systems ofEscherichiacoliand Yeast

QI Hao, LIU Xin-li*

(Qilu University of Technology, Jinan, Shandong 250353)

Due to the rapid development of recombinant DNA technology and proteomic technology, exogenous gene expression technology has received much attention. It plays increasingly important role in the field of biological, foodstuff, industry and medical science. In recent years, the use of prokaryotic and eukaryotic expression systems for exogenous gene amplification and expression to produce proteins vaccines, nucleic acid vaccine and enzyme preparations, etc. is the emerging fields of fermentation industry. Prokaryotic expression and eukaryotic expression systems were commonly used to express exogenous gene. The research progress of yeast andE.coliexpression systems in recent years were reviewed.

E.coliexpression system; Yeast expression system; Expression vectors; Exogenous gene; Host bacteria

國家自然科學基金項目(31370110)；“泰山學者”建設工程專項。

祁浩(1990- )，男，山東淄博人，碩士研究生，研究方向：生物制藥工程。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事微生物代謝活性物質研究。

2016-04-23

Q 93

A

0517-6611(2016)17-004-03