朱若楠，騰可心，王語涵，孫長霞

(1.北京林業(yè)大學材料科學與技術(shù)學院，北京100083；2.北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京100083；

3.北京林業(yè)大學理學院，北京100083)

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堅果果殼色素的純化和結(jié)構(gòu)解析研究進展

朱若楠1，騰可心1，王語涵2，孫長霞3

(1.北京林業(yè)大學材料科學與技術(shù)學院，北京100083；2.北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京100083；

3.北京林業(yè)大學理學院，北京100083)

摘要：色素作為著色劑被廣泛應用于食品行業(yè)，天然色素色澤自然，對人體無毒副作用，且不少品種兼有營養(yǎng)和藥理作用，所以合成色素漸漸被天然色素取代。堅果果殼作為剩余物，往往作為廢棄物，既浪費又污染環(huán)境。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，堅果果殼中含有很多活性成分，可以提取出色素作為天然食用色素被應用于奶制品、糕點等食品中，從而做到廢棄物的高價值利用。國內(nèi)在堅果果殼色素的純化和結(jié)構(gòu)解析研究領(lǐng)域有一定的進展，其中包括膜分離、柱層析、溶劑分離的純化方法，以及化學、紅外光譜、紫外光譜法探究堅果果殼色素結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：堅果果殼色素；純化；結(jié)構(gòu)解析

堅果果殼往往被視為廢棄物，但是，有的堅果果殼中含有豐富的天然色素。天然色素的開發(fā)與應用己成為各行業(yè)科技工作者普遍關(guān)注的課題。

不同堅果殼中提取的不同種類的天然色素往往有著不同的功效。例如，山竹果殼色素作為食用天然紅色素應用，對于山竹果殼資源充分利用將具有較好的價值和應用前景。且對藤黃球菌、枯草芽孢桿菌、八疊球菌等細菌有著顯著的抑制作用[1]；蘇芡種殼中含有較多的棕色素，其主要成分為多元酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)具有抗腫瘤、抗氧化以及抗菌等多種生理功能[2]。堅果果殼中的色素經(jīng)過提取和純化，可廣泛應用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。

本文對堅果果殼中的天然色素的純化及結(jié)構(gòu)解析的方法進行介紹，主要介紹了國內(nèi)現(xiàn)有研究的最新進展，為堅果果殼的色素純化和結(jié)構(gòu)解析提供了資料。其中大孔樹脂純化法為眾多色素純化中較常用的方法。使用這些純化方法近來也帶來了巨大的經(jīng)濟效益。是可靠的純化方法；而色素的結(jié)構(gòu)解析，對探究色素的作用機理起著不可或缺的作用。

1純化方法

1.1大孔樹脂純化法

大孔吸附樹脂的吸附性是由于范德華引力或產(chǎn)生氫鍵結(jié)果，分子篩性是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)的性質(zhì)所決定。大孔樹脂以范德華力從很低濃度的溶液中吸附有機物，其吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質(zhì)，根據(jù)樹脂的表面性質(zhì)，可分非極性、中極性和極性三類。大孔樹脂的多孔性，使其具有巨大的比表面積，能夠依靠和被吸附分子之間的范德華力或氫鍵進行物理吸附，同時，其多孔性還對分子量大小不同的化合物具有篩分作用。在確定樹脂的型號及分離條件時應綜合考慮被分離物極性大小、分子量、溶液的pH值等的影響，以及數(shù)字化柱的清洗、洗脫液的選擇等因素。

劉平[3]對板栗殼棕色素的吸附分離試驗進行了研究，結(jié)果表明,當pH=5，上樣濃度在2.0mg/mL時，吸附流速為1.8mL/min，DA-201樹脂對板栗殼棕色素的純化效果最好；使用80%的乙醇進行洗脫，洗脫速度為0.9mL/min，色素回收率可達75%。展亞莉等[4]對大孔樹脂吸附法精制板栗殼天然棕色素試驗進行了研究，結(jié)果表明：pH為5.5左右，吸附流速為0.5BV，35°C，pH為7.0的乙醇進行解析，xda-6型樹脂對板栗殼棕色素的純化效果最好，得到的解析液減壓濃縮即可得到純化后的棕色素。

姚麗敏等[5]利用大孔樹脂對榛子殼棕色素粗提液進行了純化研究，結(jié)果表明:pH=4，樣液稀釋倍數(shù)為25倍，上樣體積為110mL,上樣流速為1.5～2.0mL/min,AB-8樹脂對榛子殼棕色素的純化效果最好；使用70%乙醇作為棕色素的洗脫劑，洗脫流速為1.5mL/min。王靜[6]對榛子殼棕色素的純化及性質(zhì)進行了研究，結(jié)果表明：當pH=6.0，上樣液濃度為2.0mg/mL，上樣液溶液吸附流速1.0mL/min，D4020樹脂對榛子殼棕色素的純化效果最好；洗脫劑乙醇濃度為80%，洗脫流速確定為0.5mL/min，洗脫劑乙醇的用量為150mL就可以達到洗脫效果。

魏麗等[7]對向日葵籽殼紅色素的純化進行了研究，結(jié)果表明:pH=3,上樣液濃度為0.283mg/mL,吸附流速為4mL/min，HPD-400樹脂對向日葵籽殼紅色素的純化效果最好；解吸條件為解吸液濃度50%乙醇，pH=2,流速3.0mL/min,經(jīng)純化后的色素為紫黑色粉末，其色價為未純化的2.2倍。王鵬等[8]對葵花籽殼紅色素提取純化進行了研究，結(jié)果表明:pH=4，色素液質(zhì)量分數(shù)1%，流速為1.5mL/min,HPD-400樹脂對葵花籽殼紅色素的純化效果最好；解吸條件為解吸液質(zhì)量分數(shù)50%，pH=3流速為3.0mL/min。張海悅等[9]對黑葵花籽殼紅色素的純化進行了研究，結(jié)果表明：pH=2.5，吸附流速為3.0mL/min，AB-8型樹脂對黑葵花籽殼紅色素的純化效果最好；洗脫條件為洗脫劑(乙醇)體積分數(shù)為70%，洗脫流速為1.5mL/min,洗脫量為250mL。

大孔樹脂的孔徑與比表面積都比較大，在樹脂內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu)，所以具有物理化學穩(wěn)定性高，比表面積大、吸附容量大。大孔樹脂的選擇性好，吸附速度快，解吸條件溫和，再生處理方便，使用周期長使用方便，可重復使用，降低成本。但是大孔樹脂種類有限，所以想要選擇合適的樹脂會受限，而且操作比較復雜。同一型號的大孔樹脂不同批次之間的比表面積和功能基團含量差別大。有機殘留物高，預處理難度大，給實驗增加了難度。大孔樹脂強度較差，使用過程中破碎比較嚴重。因此，如果選擇使用大孔樹脂純化色素時，就要充分考慮到其優(yōu)缺點，根據(jù)所純化物質(zhì)的性質(zhì)選擇合適的大孔樹脂進行實驗。

1.2膜分離方法

膜分離技術(shù)(Membrane Separation Technology)以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，當膜兩側(cè)存在某種推動力(如壓力差、濃度差、電位差等)時，原料側(cè)組分選擇性地透過膜，以達到分離、提純的目的。膜分離技術(shù)以其低能耗、高效率被認為是理想的分離技術(shù)之一。由于其兼有分離、濃縮、純化和精制的功能，又有高效、節(jié)能、環(huán)保、分子級過濾及過濾過程簡單、易于控制等特征，因此，目前已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、生物、環(huán)保、化工、冶金、能源、石油、水處理、電子、仿生等領(lǐng)域，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，已成為當今分離科學中最重要的手段之一。常用的膜分離技術(shù)分為超濾膜和納濾膜分離。

1.2.1超濾法

選用適當孔徑的超濾膜，使水分子甚至小分子雜質(zhì)通過超濾膜，而使溶劑中有效成分被阻留，從而使色素達到某種程度的純化和高倍數(shù)濃縮。超濾膜分離技術(shù)作為現(xiàn)代分離技術(shù)，因其具有設(shè)備簡單、能在低溫下操作、能耗小、生物活性物質(zhì)不易失活、效率高等特點，近年來被廣泛應用于生物活性物質(zhì)的分離、濃縮和純化。國外已經(jīng)使用超濾膜精制天然色素，我國也有這方面研究。

超濾技術(shù)分離效率高，對稀溶液中的微量成分的回收、低濃度溶液的濃縮均非常有效。且超濾過程僅采用壓力作為膜分離的動力，因此分離裝置簡單、流程短、操作簡便、易于控制和維護。但是超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑。

1.2.2納濾法

納濾又稱為低壓反滲透，是膜分離技術(shù)的一種新興領(lǐng)域，其分離性能介于反滲透和超濾之間，允許一些無機鹽和某些溶劑透過膜，從而達到分離的效果。

1.3溶劑分離法

溶劑分離法是根據(jù)色素與雜質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異，由低極性到高級型進行分離提純，除去雜質(zhì)。一般包括酸沉淀法、純沉淀法、重結(jié)晶法。

1.3.1醇沉法

醇沉法利用雜質(zhì)和色素在不同乙醇濃度下溶解度的不同對色素和雜質(zhì)進行分離。其關(guān)鍵點在于找到乙醇的濃度，過高和過低的乙醇濃度都會造成雜質(zhì)的又一次溶解。

1.3.2酸沉法

酸沉法是利用不同的pH下色素的溶解度的差異，對含有多酚類色素十分有效。

1.3.3重結(jié)晶法

結(jié)晶法是利用溫度的差異純化色素。但是結(jié)晶法并不容易控制，任何微小的溫度差異和波動都會造成結(jié)晶的失敗。

李永祥等[13]在板栗殼色素提取、純化和穩(wěn)定性研究中便采取了以上3種方法 ，并且通過硅膠板薄層層析法鑒定純化效果，確定出重結(jié)晶法和醇沉法獲得純化色素的層析效果沒有酸沉法好。重結(jié)晶法和醇沉法色素沉淀不徹底 、效率低，且醇沉法較浪費試劑、費用較高；酸沉法色素沉淀徹底、效率高。因此，實際應用中可以先用酸沉法，起到濃縮色素的目的，當色素濃度較高時選用醇沉法，最后選用重結(jié)晶法。

1.4硅膠柱層析法

硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離， 一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。

李永祥等[14]對板栗殼棕色素的純化實驗進行研究，優(yōu)化了色素純化方法，結(jié)果表明:當洗脫劑為30%乙醇、雙蒸水、1% NaOH，層析柱大小為1cm×50cm，硅膠為6～100目時，采用硅膠柱層析法，洗脫后得到明顯的洗脫峰，表明改良后的純化方法有效。

硅膠的活度大，容易再生，但在高溫下會被破壞失去活性?？傊?，硅膠柱層析是純化色素的一種簡單有效且經(jīng)典的方法[15]。

2結(jié)構(gòu)解析方法

2.1化學方法

以物質(zhì)的化學反應為基礎(chǔ)建立起來的分析方法，可進行定性定量分析。當組分含量為1%～100%時可利用化學方法進行分析，分析誤差為0.1%～0.2%。

王靜[5]在榛子殼棕色素提取純化及性質(zhì)研究中通過硼酸顯色反應，發(fā)現(xiàn)榛子殼棕色素中有5-羥基結(jié)構(gòu)，通過與三氯化鐵反應發(fā)現(xiàn)榛子殼棕色素黃酮類化合物中含有3-羥基，5-羥基或鄰二羥基，又通過熒光反應發(fā)現(xiàn)色素中有黃酮體或其甙類物質(zhì)，由這3個實驗初步定性榛子殼棕色素為黃酮類物質(zhì)。

2.2紅外可見光譜法

紅外可見光譜法：又稱“紅外分光光度分析法”。分子吸收光譜的一種。利用物質(zhì)對紅外光區(qū)的電磁輻射的選擇性吸收來進行結(jié)構(gòu)分析及定性和定量分析的方法。被測物質(zhì)的分子在紅外線照射下，只吸收與其分子振動、轉(zhuǎn)動頻率相一致的紅外光譜。對紅外光譜進行剖析，可對物質(zhì)進行定性分析。化合物分子中存在著許多原子團，各原子團被激發(fā)后，都會產(chǎn)生特征振動，其振動頻率也必然反映在紅外吸收光譜上。據(jù)此可鑒定化合物中各種原子團，也可進行定量分析。具有特征性強、測定快速、不破壞試樣、試樣用量少、操作簡便、能分析各種狀態(tài)的試樣、分析靈敏度較低、定量分析誤差較大的特點。

陳曉等[17]在山核桃殼棕色素的生物活性及其紅外光譜分析中，利用紅外可見光譜法研究山核桃殼棕色素的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：山核桃殼棕色素中含有苯環(huán)和酚羥基。張曉云等[2]在蘇芡種殼棕色素的提取及紅外光譜分析中，利用紅外可見光譜發(fā)現(xiàn)蘇芡種殼中的兩種棕色素都存在芳香環(huán)，棕色素一中存在酯羰基結(jié)構(gòu)，且具有C-N，而棕色素二中不存在這些結(jié)構(gòu)，但其芳香環(huán)上具有棕色素一沒有的取代基。

2.3紫外可見光譜法

紫外可見吸收光譜法是利用某些物質(zhì)的分子吸收10～800nm光譜區(qū)的輻射來進行分析測定的方法，這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于有機和無機物質(zhì)的定性和定量測定。該方法具有靈敏度高、準確度好、選擇性優(yōu)、操作簡便、分析速度好等特點。

閻炳宗等[18]在板栗殼棕色素性質(zhì)的研究中利用紫外光譜法研究了板栗殼棕色素的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：板栗殼棕色素的結(jié)構(gòu)與可可色素的結(jié)構(gòu)類似，都為聚黃酮類。具體操作為：取一定粉末狀色素，用蒸餾水配制成0.01%色素水溶液。1cm石英比色皿，以蒸餾水為空白對照，用紫外可見分光光度計，由波長190～900nm進行掃描。

3總結(jié)

與人工合成色素相比，絕大多數(shù)天然色素對人體無毒副作用，安全性高；很多天然色素中含有人體必須的營養(yǎng)物質(zhì)，例如，很多天然色素具有活性物質(zhì)，具有抗氧化性；且有的還有藥理作用，對某些疾病有預防作用，所以天然色素漸漸取代合成色素。但是由于天然色素色澤不穩(wěn)定，在其使用中由于各種因素的影響而發(fā)生褪色等現(xiàn)象，這就嚴重制約了天然色素取代人工色素的進程。堅果果殼色素作為天然色素的一部分，目前國內(nèi)對于其研究利用還不是很多，尤其是對堅果果殼色素結(jié)構(gòu)的研究非常不完善， 堅果果殼色素的純化以及結(jié)構(gòu)解析對于堅果果殼色素的開發(fā)利用尤為重要。

參考文獻

[1]彭文書，陳毅堅，鐘文武. 山竹果殼色素的穩(wěn)定性及抑菌活性研究[J]. 食品研究與開發(fā),2011,32(12)：55-59.

[2]張曉云，盧昊. 蘇芡種殼棕色素的提取及紅外光譜分析[J].食品工業(yè)科技,2013,34(21)：250-253.

[3]劉平.板栗殼棕色素提取、純化及抗氧化性的研究[D]. 武漢:武漢工業(yè)學院，2008.

[4]展亞莉，劉曉波，展康華,大孔樹脂吸附法純化精制板栗殼天然棕色素的研究[J].中國食品添加劑,2015(5)：105-109.

[5]姚麗敏. 大孔樹脂純化榛子殼棕色素粗提液的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(20)：317-321.

[6]王靜. 榛子殼棕色素提取、純化及性質(zhì)研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學，2010.

[7]魏麗.大孔樹脂純化向日葵籽殼紅色素的研究[J].食品工業(yè)科技,2010，31(6)：263-266.

[8]王鵬，陳寅初，李萬云，等,葵花籽殼紅色素的提取純化研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2008(11)：61-63.

[9]張海悅，徐鶴，王蕾.黑葵花籽殼紅色素的純化及主要成分結(jié)構(gòu)鑒定[J].食品科學,2010,31(17)：36-40.

[10]段蕊，張俊杰.板栗殼棕色素的純化和初步定性[J].淮海工學院學報(自然科學版),2000(3).

[11]劉志強，張初署，孫杰，等.膜分離技術(shù)純化花生衣中的原花色素[J].食品科學,2010,31(20)：183-186.

[12]宋新新，鄧理陽，范倩，等.納濾膜分離純化榛子殼棕色素粗提液的研究[J].中國調(diào)味品，2015，40(2)：114-119.

[13]李永祥，詹少華，蔡永萍. 板栗殼棕色素提取、純化及穩(wěn)定性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報， 2008(9).

[14]李永祥，詹少華，樊洪泓，等.板栗殼色素化學性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的初步研究[J].食品科學,2008,29(12)：51-54.

[15]Tan Guojin,Jiang Linbin,Huang Renjin,et al.Current research situation of natural edible plant-pigment and its prospect[J].Tochnology and Development of Chemical Industry,2005,34(6):25-29.

[16]陳曉，葉明，陳煒.山核桃殼棕色素的生物活性及其紅外光譜分析[J].食品科學,2011,32(5)：115-118.

中圖分類號:TS264.4

文獻標識碼:A

作者簡介：朱若楠(1993-)，女，北京林業(yè)大學材料科學與技術(shù)學院本科生；*通訊作者：孫長霞(1975-)，女，高級實驗師，主要從事食品分析與檢測方面的研究，E-mail:starsix04@126.com。

基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(YX2015-07)；北京林業(yè)大學大學生創(chuàng)新訓練項目(X201510022134)

收稿日期：2015-09-30

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.01.034