多囊卵巢綜合征孕婦胎盤類固醇的研究

郭江虹（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南衡陽421001）

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多囊卵巢綜合征孕婦胎盤類固醇的研究

郭江虹
（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南衡陽421001）

摘要：目的評估多囊卵巢綜合征（PCOS）孕婦胎盤類固醇硫酸酯酶（STS）、3β-羥基類固醇脫氫酶1型（3β-HSD-1）和P450芳香化酶（P450arom）活性。方法研究對象為足月分娩的20例PCOS孕婦和30例健康對照孕婦。分娩后采集胎盤組織和臍帶血樣本。孕34周時采集母體血液樣本。評估胎盤組織中STS、3β-HSD-1和P450arom活性。測定血液樣本內(nèi)孕酮、硫酸脫氫異雄酮（DHEAS）、脫氫表雄酮（DHEA）、雄烯二酮、睪酮、雌酮、雌二醇和總雌三醇含量。結(jié)果與健康對照組孕婦比較，PCOS孕婦胎盤組織中3β-HSD-1含量較高，而P450arom活性較低。此外，PCOS孕婦雄烯二酮和睪酮濃度比對照組孕婦高（P=0.016和0.025）。相較于對照組女性新生兒，PCOS組女性新生兒臍帶血內(nèi)雄烯二酮較低，而雌三醇濃度較高（P=0.038和0.031）。結(jié)論PCOS孕婦胎盤組織內(nèi)參與類固醇合成的兩個重要酶活性發(fā)生改變，3β-HSD-1升高，而P450降低，該變化可引起懷孕期間雄激素分泌增加。

關(guān)鍵詞：多囊卵巢綜合征；胎盤；3β-羥基類固醇脫氫酶；P450芳香化酶

多囊卵巢綜合征（Polycysticovarysyndrome，PCOS）是常見內(nèi)分泌代謝紊亂癥，影響約5％～10％的育齡期婦女，其主要特點是排卵/月經(jīng)不規(guī)則、多囊性卵巢和高雄激素血癥[1]。PCOS影響患者生育能力，PCOS妊娠并發(fā)癥和不良后果發(fā)生率較高[2]。此外，PCOS婦女妊娠期間表現(xiàn)出雄激素濃度顯著增加[3-4]。有趣的是，還有研究發(fā)現(xiàn)先兆子癇和妊娠期糖尿病婦女中雄激素水平也升高[5-6]。

懷孕期間，胎盤是產(chǎn)生類固醇的重要器官，但是目前尚未見胎盤類固醇生成對PCOS婦女雄激素水平影響的研究。人胎盤吸收的雄激素主要是來自胎兒和母體腎上腺的C19雄激素，其主要成分為硫酸脫氫異雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEAS）。胎盤組織中硫酸基團(tuán)經(jīng)類固醇硫酸酯酶（steroid sulfatase，STS）裂解，未結(jié)合的甾族化合物經(jīng)活化3β-羥基類固醇脫氫酶1型（3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1，3β-HSD-1）轉(zhuǎn)變成雄烯二酮，隨后又被17β-羥基類固醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為睪酮[7]。此外，胎兒腎上腺DHEAS也可以經(jīng)16α-羥基化作用形成合成雌三醇的雄激素前體16α-羥基-脫氫表雄酮-硫酸酯（16α-OH-DHEAS）。因此，PCOS婦女胎盤中STS、3β-HSD-1和/或P450芳香化酶（P450 aromatase，P450arom）活性變化可導(dǎo)致產(chǎn)婦或胎兒血液循環(huán)中雄激素濃度增加。

本研究主要評估PCOS婦女在妊娠期間胎盤STS、3β-HSD-1和P450芳香化酶的活性，并通過測定母體血和臍帶血中的類固醇濃度來探討酶活性變化的臨床意義。

1　資料與方法

1.1研究對象

采用病例對照研究設(shè)計，20例PCOS孕婦為研究組，對照組為30例月經(jīng)正常、無高雄激素血癥的孕婦。所有PCOS孕婦2014年1月-2014年12月就診于南華大學(xué)婦產(chǎn)科。主要臨床表現(xiàn)為閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)、月經(jīng)量少、不孕、多毛、肥胖等；實驗室檢查，基礎(chǔ)體溫測定呈單相，血、血清睪酮濃度>0.6 ng/ml和/或游離雄激素指數(shù)（free androgen index，F(xiàn)AI）>5.0，雄（甾）烯二酮濃度>3.0 ng/ml以及超聲下可見獨特的卵巢形態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：高泌乳素血癥、雄激素分泌瘤、庫欣綜合征和遲發(fā)性21-羥化酶缺乏癥、甲狀腺疾病患者及接受克羅米芬或外源性促性腺激素等誘發(fā)排卵類藥物治療的PCOS患者。所有患者接受生活方式評估，大部分PCOS患者服用500～2 000 mg二甲雙胍，PCOS患者妊娠測試陽性即停止服用二甲雙胍。對照組孕婦社會經(jīng)濟(jì)水平、年齡等與PCOS組患者匹配。對照組婦女具有28～32 d的規(guī)律月經(jīng)周期史，無多毛癥和高雄激素血癥的其他表征，無溢乳及甲狀腺功能異常。所有孕婦都是健康的，未接受任何藥物治療。

1.2標(biāo)本采集

1.2.1血液樣本所有受試者孕34周時采集血液樣本，臍帶血樣品為分娩時臍動脈-靜脈混合臍帶血樣本。血液樣本立即離心，血清置入-80℃冰箱冷凍保存，待進(jìn)一步分析。

1.2.2胎盤組織順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)后立即收集足月妊娠（孕37～40周）胎盤。使用無菌解剖刀在每個胎盤臍帶插入位置（約5 cm）橫切，將絨毛膜表面至基板部分分成3個水平段并分別編碼為：S1，靠近絨毛膜層；S2，絨毛膜層和基底膜層間區(qū)域；S3，靠近基底膜層。

1.3標(biāo)本檢測

1.3.1酶學(xué)檢測STS活性檢測：酶溶液（100 mg蛋白質(zhì)）與40 mmol/L預(yù)冷DHEAS和[1，2，6，7-3H] DHEAS（20 nmol）混合，37℃孵育30 min，加入2.0 ml甲苯終止酶反應(yīng)，渦旋混勻1min，600×g離心5 min，分離DHEAS（水相）與脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）（有機(jī)相）。收集甲苯層，并利用液體閃爍計數(shù)器（美國Packard儀器有限公司）進(jìn)行測定。胎盤3β-HSD活性檢測：將100 mg蛋白、200 mmol磷酸鈉緩沖液（pH=8.9）、100 mmol/L DHEA和40 ml甲醇混合，得到溫育混合物1 ml。加入4.0 mmol/L的1-萘乙酰胺（1-naphthyl acetamide，NAD）后，檢測340 nm處光密度（optical density，OD）值，通過在OD 340與空白（無NAD）對照組比較，測得酶活性。芳香化酶活性檢測：來自于微粒體部分的100 mg蛋白與50 nmol [1β-3H]-雄甾-4-烯-3、17-二酮（比活性23.5 Ci/mmol）、0.5 ml磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）和1.2 mmol/L還原型輔酶Ⅱ混合。將反應(yīng)混合物在37℃恒溫水浴中振蕩30 min。用1 ml的20％三氯乙酸終止反應(yīng)，12000×g離心10min。將上清液與4.0ml氯仿混合，渦旋混合3min，600×g離心10min。取水相500 ml與0.5 ml的5％木炭懸浮液混合，孵育30 min后，12000×g離心15min，液體閃爍計數(shù)器計數(shù)上清液。

1.3.2類固醇檢測測定母血和臍帶血血清中的孕酮、DHEAS、DHEA、雄烯二酮、睪酮、雌酮、雌二醇和雌三醇。所有檢測在同一批次的PCOS組和對照組間進(jìn)行。孕酮和雌三醇總量用酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）測定。DHEAS、DHEA、雄烯二酮、睪酮、雌酮和雌二醇由放射免疫法測定。檢測敏感性分別為0.3ng/ml、2.0ng/ml、1.0mg/dl、0.1 ng/ml、0.1 ng/ml、0.1 ng/ml、5.0 pg/ml和8.0 pg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為孕酮4.0％和7.0％、雌三醇4.8％和8.8％、脫氫表雄酮5.1％和11.0％、脫氫表雄酮3.8％和8.6％、雄烯二酮5.0％和5.0％、睪酮4.2％ 和5.2％、雌酮4.3％和6.0％以及雌二醇4.0％和4.2％。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)（四分位間距）表示，正態(tài)分布用Kolmogorov-Smirnov檢驗評估。分類數(shù)據(jù)用χ2或Fisher精確檢驗進(jìn)行分析，當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時組間比較用t檢驗或用Mann-Whitney檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1臨床特征

兩組孕婦間年齡、初始體重、初始體重指數(shù)和身高等參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但是PCOS孕婦在妊娠末期體重較對照組孕婦更重（P=0.020），懷孕期間體重增加組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3例PCOS孕婦合并妊娠糖尿病。剖腹產(chǎn)率組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（對照組：60.0％，PCOS組：70％）。對照組47％和PCOS組60％為初產(chǎn)婦。見表1。

表1　兩組產(chǎn)婦和新生兒一般特征

兩組新生兒在胎齡、體重、身長、體重標(biāo)準(zhǔn)差積分（weight standard deviation scores，SDS）和身長標(biāo)準(zhǔn)差積分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，兩組胎盤重量、女胎比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（60％和50％，P=0.112）。

2.2酶活性

對照組和PCOS組胎盤組織3個位置的STS活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PCOS組孕婦在S1、S2 和S3處表現(xiàn)出較高的3β-HSD-1活性[S1：（40.0± 4.3）vs（56.0±4.4）u/（min·mg蛋白），P=0.014；S2：（63.0±5.2）vs（83.0±6.8）u/（min·mg蛋白），P=0.020；S3：（42.0±6.4）vs（63.0±6.2）u/（min·mg蛋白），P= 0.049]。此外，PCOS組在S2處的3β-HSD-1活性高于S1和S3處（P=0.002和0.030）。另一方面，PCOS組胎盤組織3個位置的P450芳香酶活性較對照組低[S1：（1.25±0.12）vs（0.92±0.06）pmol/（min·mg蛋白），P=0.036；S2：（1.18±0.09）vs（0.88±0.08）pmol/（min·mg蛋白），P=0.042；S3：（1.35±0.14）vs（0.81± 0.21）pmol/（min·mg蛋白），P=0.025]。胎盤組織3個位置P450芳香酶活性，無論是對照組還是PCOS組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見附圖和表2。

表2　PCOS組和對照組孕婦孕34周時血清性激素含量比較

2.3類固醇濃度

PCOS組孕婦孕34周時血清中雄烯二酮和睪酮濃度明顯高于對照組（見表2）。PCOS組新生兒臍帶血中雄烯二酮低于對照組新生兒，而雌三醇濃度高于對照組。此外，PCOS組新生兒臍帶血雌激素酮濃度通常低于對照組新生兒（P=0.061）。男性新生兒中，PCOS組雄烯二酮水平有較對照組低的傾向，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.054）（見表3）。

附圖　對照組和PCOS組胎盤組織不同部位3β-HSD-1和P450芳香酶活性比較

表3　PCOS組和對照組新生兒臍帶血性激素含量比較

3　討論

本研究提高對多囊卵巢綜合征婦女懷孕的認(rèn)識，并為胎盤類固醇能夠改變PCOS女性妊娠期間內(nèi)分泌水平的觀點提供新的實驗依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者孕34周時血清雄激素濃度升高，與以往研究結(jié)果一致[3-4]。由于3β-HSD-1能夠催化5-3β-羥基類向4-3-17-酮甾類轉(zhuǎn)化[7]，胎盤組織里3β-HSD-1活性增加可能導(dǎo)致PCOS患者合成更多的雄性激素，雄性激素經(jīng)芳香化酶P450迅速芳香化，產(chǎn)生雌激素，因此筆者推測，胎盤組織里P450活性降低可引起雄激素底物積累，本研究中母體血液雄激素含量偏高可能是由于胎盤類固醇異常引起。

目前，關(guān)于胎盤組織里3β-HSD-1和P450芳香化酶活性調(diào)控機(jī)制的研究較少。通常PCOS婦女早期到晚期妊娠階段胰島素抵抗程度和胰島素水平較高，而胰島素和胰島素樣生長因子能夠抑制人類滋養(yǎng)細(xì)胞中P450芳香化酶活性，并激活3β-HSD-1[8]。妊娠糖尿病和先兆子癇等情況下，孕婦胰島素抵抗加劇，并伴有高胰島素血癥，將引起胎盤芳香化酶活性降低。因此，PCOS女性妊娠期間代謝異常是胎盤3β-HSD-1和P450芳香化酶活性變化的可能原因。

PCOS女性胎盤組織中3β-HSD-1和芳香化酶P450活性對胎兒的影響呈不確定性，胎盤中芳香酶將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的能力較強，以至于<1％的酶活性都能通過母體雄激素增加防止胎兒男性化[9]。盡管本研究未在女嬰中觀察到男性化跡象，但是，不能排除PCOS患者胎盤酶活性異?？蓪β殉不虼x功能產(chǎn)生影響，因為PCOS女性分娩的女兒幼年時有卵泡質(zhì)量和胰島素抵抗變化。Barry等[10]發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合征孕婦的女性新生兒臍靜脈內(nèi)睪酮濃度較高，提示雄激素可能部分來自胎盤。本研究未發(fā)現(xiàn)PCOS組和對照組胎兒睪酮濃度差異，可能是因為本研究檢測標(biāo)本是混合臍帶血。Anderson等[11]發(fā)現(xiàn)PCOS患者的女性新生兒混合臍血內(nèi)雄烯二酮和血清雌二醇濃度較低，而本研究也發(fā)現(xiàn)女性多囊卵巢綜合征孕婦的新生兒臍血內(nèi)雄烯二酮減少，雌三醇水平增加。雌三醇是16a-OH-雄烯二酮芳香化的產(chǎn)物，而胎盤中雄激素16α-羥基化可能的主要部位是肝臟，并與CYP3A7酶活性有關(guān)[12]。PCOS組新生兒臍帶血雌三醇含量增加可能有2個原因：①與新生兒腎上腺產(chǎn)生的DHEAS 16α-羥基化增加有關(guān)；②胎盤合成的雄烯二酮在胎兒體內(nèi)被肝臟或腎上腺代謝為16α-OH-雄烯二酮，隨后由胎盤組織芳香化為雌三醇。雌三醇是胎兒腎上腺活性和胎兒健康的有效標(biāo)志物。孕中期母體血清雌三醇含量低與唐氏綜合征、18三體綜合征、類固醇硫酸酯酶缺乏征等代謝性疾病和胎兒死亡有關(guān)[13-15]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)臍帶血中雌三醇含量升高與不良妊娠結(jié)局有關(guān)。

總之，本研究表明，PCOS女性胎盤組織能夠促進(jìn)雄激素產(chǎn)生，而大部分雄激素又能被母體血液循環(huán)清除。PCOS組女性新生兒臍血雄烯二酮水平下降，雌三醇水平提高，提示PCOS組胎兒類固醇代謝發(fā)生改變。

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（申海菊編輯）

Placental steroidogenesis in pregnant women with polycystic ovary syndrome

Jiang-hong Guo
(Department of Gynaecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang, Hunan 421001, China)

Abstract:Objective To evaluate the activity of steroid sulfatase (STS), 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (3β-HSD-1) and P450 aromatase (P450arom) in placenta of pregnant women with polycystic ovarian syndrome (PCOS).Methods Twenty pregnant women with PCOS and 30 control pregnant women who delivered at term were studied.Samples of placental tissue and cord blood were obtained after delivery.A maternal blood sample was obtained during the 34th week of gestation.In placental tissue, the activity of STS, 3β-HSD-1 and P450arom was evaluated.The content of progesterone, dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), dehydroepiandrosterone(DHEA), androstenedione, testosterone, estrone, estradiol and total estriol was determined in the blood samples.Results In placental tissue from women with PCOS, higher 3β-HSD-1 and lower P450 aromatase activity was observed compared to the control women.Moreover, women with PCOS showed higher androstenedione and testosterone concentrations compared to normal pregnant women (P = 0.016 and 0.025, respectively).In cord blood, the female newborns of the women with PCOS exhibited lower androstenedione and higher estriol concentrations compared to the daughters of the control women (P= 0.038 and 0.031).Conclusions Placental tissue from women with PCOS shows changes in the activity of two important enzymes for steroid synthesis, i.e.higher 3β-HSD-1 and lower P450, which could increase androgen production during pregnancy.

Keywords:polycystic ovary syndrome; placenta; 3β-hydroxysteroid dehydrogenase; P450 aromatase

收稿日期：2015-09-25

文章編號：1005-8982（2016）01-0094-05

中圖分類號：R711.75

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B