Rg1聯(lián)合B族維生素對急性心肌缺血小鼠NO釋放及Rg1入腦量的影響

陳銀彬，王玉芳，侯志芳，王英平，符洋洋，鄭培和※

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春?130112；?2．北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京?100000)

血管中內(nèi)皮細胞在一氧化氮(NO)合成酶作用下合成NO，NO為血管舒張因子，能維持血管舒張狀態(tài)[1]。心肌缺血小鼠血清NO釋放量減少導(dǎo)致和加重了心肌缺血，能否促進NO釋放量的增加是評價藥物對心肌缺血模型是否具有治療作用的一個重要指標。人參皂苷Rg1可通過與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合促進血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生NO對缺血心肌進行保護。血栓通注射液的主要成分就是Rg1，其對心肌缺血性疾病的治療有肯定效果[2，3]。B族維生素也被報導(dǎo)能通過改善內(nèi)皮細胞功能促進NO釋放等途徑來降低心肌缺血損傷[4，5]。人參皂苷Rg1聯(lián)合B族維生素使用是否具有協(xié)同促進急性心肌缺血小鼠血清NO釋放方面的作用研究未見報導(dǎo)，同時，人參皂苷Rg1的入腦量較低[6]，具有極大的提高空間。本研究從藥物分布量是否改變的宏觀角度去探究協(xié)同作用產(chǎn)生的可能機制，為臨床應(yīng)用人參皂苷Rg1聯(lián)合B族維生素減輕急性心肌缺血損傷提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

ICR小白鼠50只，雄性，體重20g±2g，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，SPF級，合格證號：SCXK(吉)-2011-0004，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18℃～22℃，相對濕度50%～60%，定時通風(fēng)排氣，保持自然光照。動物每日喂食普通基礎(chǔ)飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d。

1.2 實驗藥品與試劑

人參皂苷Rg1單體化合物(純度大于98%，吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院)；VB1(≥99%)、VB2(≥98%)、VB3(≥99%)、VB5(≥99%)、VB6(≥99%)、VB7(≥97%)、VB9(≥97%)、VB12(≥98%)(上海源葉生物科技有限公司)；鹽酸異丙腎上腺素(濟南凱恩醫(yī)藥科技有限公司)；內(nèi)標化合物地高辛(純度大于98%，成都植標化純生物技術(shù)有限公司)；一氧化氮測定試劑盒(硝酸還原酶法，南京建成生物工程研究所)；甲醇和乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；氨水(色譜純，天津市光復(fù)精細化工研究所)。

1.3 實驗儀器

細胞組織破碎儀(美國NEXT ADVANCE公司)；3-30K高速臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)；微量樣品高靈敏度光吸收酶標儀(瑞士Tecan公司)；OasisHLB固相萃取小柱、UPLC/XEVO TQ超高壓液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；Milli-Q Advantage A10超純水器(美國Millipore公司)；XS205DU電子天平(1/100 000，瑞士Mettler Toledo公司)。

2 方法

2.1 實驗分組及急性心肌缺血模型制備

50只雄性ICR小白鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機分成對照組、模型組、Rg1組、B族維生素組、Rg1+B族維生素聯(lián)合組5組，對照組和模型組給予溶藥媒介0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，Rg1組給予人參皂苷Rg120mg/kg[2，7]，B族維生素組劑量為VB12.25mg/kg、VB22.25mg/kg、VB37.5mg/kg、VB53.45mg/kg、VB61.5mg/kg、VB722.5μg/kg、VB960μg/kg、VB121.5μg/kg[8，9]，聯(lián)合組同時給予Rg1(20mg/kg)和B族維生素，用法同上。連續(xù)灌胃給藥10d，記錄體重。除對照組外，其他4組在第8天、第9天和第10天在給藥30min后腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(ISO-HCl)20mg/kg，制造急性心肌缺血小鼠模型[10～12]。

2.2 樣品收集

在第10天注射鹽酸異丙腎上腺素3h后摘眼球取血并處死小鼠，取出完整大腦，用生理鹽水沖洗后濾紙吸干，用錫紙包好放-80℃冰箱保存待測。

2.3 血清NO含量測定

使用一氧化氮測定試劑盒(硝酸還原酶法)，嚴格按照使用說明書操作，用微量樣品高靈敏度光吸收酶標儀檢測。

2.4 腦組織樣品前處理

準確稱取Rg1組和聯(lián)合組小鼠大腦組織0.4g放入離心管中，加入1.2mL生理鹽水，利用細胞組織破碎儀勻漿2min，超聲10min，然后10 000r/min 4℃離心10min，取1.0mL上清液放入另一干凈離心管中，重復(fù)上述提取步驟1次，合并上清液。在上清液中加10μL內(nèi)標地高辛(10μg/mL)后過OasisHLB固相萃取小柱，小柱首先采用3.5mL甲醇活化，3.5mL去離子水平衡，然后上樣，再加1.0mL去離子水洗脫雜質(zhì)，最后用1.0mL純甲醇洗脫目標物。洗脫液40℃下氮氣吹干后，100μL 50%甲醇水溶液復(fù)溶待測。

2.5 LC-MS/MS檢測條件

2.5.1液相色譜條件色譜柱：ACQUIYT UPLCBEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)；流動相：A為乙腈(含1mmol/L氨水)，B為去離子水(含1mmol/L氨水)；梯度洗脫：0min～1min 28%～35%A，1min～1.5min 35%～75%A，1.5min～2.5min 75%A，2.5min～3min 75%～28%A，3min～4min 28%A；流速：0.4mL/min；進樣體積：5μL；柱溫35℃。

2.5.2質(zhì)譜條件ESI離子源；負離子模式檢測；毛細管電壓：2.8kV；源溫：150℃；脫溶劑氣流速：1000L/Hr；溫度：450℃；錐孔氣流速：50L/Hr；碰撞氣流速：0.16mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集模式；人參皂苷Rg1定量離子對：799.5957>637.4817(錐孔電壓52V，碰撞能量22V)；人參皂苷Rg1定性離子對：799.5957>475.4191(錐孔電壓52V，碰撞能量34V)；內(nèi)標地高辛定量離子對：779.6530>649.5557(錐孔電壓66V，碰撞能量32V)；內(nèi)標地高辛定性離子對：779.6530>475.4506(錐孔電壓66V，碰撞能量44V)。

2.6 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果與分析

3.1 人參皂苷Rg1和B族維生素對急性心肌缺血小鼠血清NO釋放量的影響

人參皂苷Rg1組、B族維生素組和聯(lián)合組血清NO釋放量分別為65.09μmol/L、67.97μmol/L和88.13μmol/L，人參皂苷Rg1和B族維生素血清NO釋放量顯著高于模型組，表明這2種物質(zhì)都具有提高急性心肌缺血小鼠血清NO釋放的作用，同時，聯(lián)合組促NO釋放效果明顯優(yōu)于各單一用藥組(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1人參皂苷Rg1和B族維生素對急性心肌缺血小鼠血清NO釋放量的影響

組 別GroupNO釋放量(μmol/L)TheNOlevel對照 Control8530±1514??模型 ISO-inducedmodel5108±998△△人參皂苷Rg1 GinsenosideRg16509±995?△△B族維生素 Bvitamins6797±1000?△△Rg1+B族維生素聯(lián)合Rg1andBvitaminscombined8813±1376??

注：與模型組相比，*．差異顯著(P<0.05)，**．差異極顯著(P<0.01)；與聯(lián)合組相比，△．差異顯著(P<0.05)，△△．差異極顯著(P<0.01)。

Note：Compared with ISO-induced model group,*.indicates significant differences(P<0.05),**.indicates extremely significant differences(P<0.01);compared with combined group,△.indicates significant differences(P<0.05),△△.indicates extremely significant differences(P<0.01).

3.2 Rg1入腦量檢測結(jié)果

3.2.1B族維生素對人參皂苷Rg1入腦量的影響

利用液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)對Rg1組和Rg1+B族維生素聯(lián)合組小鼠大腦組織中人參皂苷Rg1含量進行檢測。檢測采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，信號靈敏(圖1)。經(jīng)檢測得出各樣品中人參皂苷Rg1濃度，并根據(jù)腦組織重量換算成質(zhì)量含量。定量分析發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1入腦量較低，聯(lián)合組小鼠大腦組織中Rg1含量極顯著高于單一給藥的Rg1組(P<0.01)，提高了約6倍(表2)。

A.Total ion chromatogram(TIC) of Rg1in brain tissue;B.Extracted ion chromatogram(EIC) of quantitative fragment ions of Rg1in brain tissue;C.EIC of qualitative fragment ions of Rg1in brain tissue

圖1腦組織樣品Rg1總離子流色譜圖及提取離子流色譜圖

Fig.1TICandEICofRg1inbraintissue

表2B族維生素對人參皂苷Rg1入腦量的影響

組 別Group腦組織中Rg1含量(μg/kg)ThebrainconcentrationofRg1人參皂苷Rg1 GinsenosideRg1093±042Rg1+B族維生素聯(lián)合Rg1andBvitaminscombined609±460??

注：與Rg1組相比，*．差異顯著(P<0.05)；**．差異極顯著(P<0.01)

Note：Compared with Rg1group,*.indicates significant differences(P<0.05);**.indicates extremely significant differences(P<0.01).

3.2.2LC-MS/MS檢測方法學(xué)考察小鼠空白腦組織提取液配制成分別為80ng/mL、60ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL標準工作液，經(jīng)前處理后進行LC-MS/MS檢測，測得人參皂苷Rg1在1ng/mL～80ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 055)。將低濃度的標準工作液以小鼠空白腦組織提取液稀釋，經(jīng)前處理后測得該方法檢出限為0.25ng/mL(S/N=3)，定量限為0.8ng/mL(S/N=10)。利用小鼠空白腦組織提取液進行50ng/mL、20ng/mL、2.5ng/mL 3個添加水平的回收實驗，經(jīng)前處理后測得回收率為85%～96%，同一濃度工作液連續(xù)進樣測得日內(nèi)精密度為2.2%，日間精密度為4.8%。

3.3 小鼠血清NO釋放量和Rg1入腦量相關(guān)性分析結(jié)果

分別對Rg1組和Rg1+B族維生素聯(lián)合組小鼠血清NO釋放量和Rg1入腦量進行相關(guān)性分析(圖2)。由圖2可知，聯(lián)合組NO釋放量與Rg1入腦量成極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.844；Rg1組NO釋放量與Rg1入腦量成極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.789；2組結(jié)果都表明，NO釋放量與Rg1入腦量呈極顯著正相關(guān)。同時比較2組結(jié)果也可發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組NO釋放量與Rg1入腦量都比單一給藥的Rg1組要高，也印證了NO釋放量與Rg1入腦量成正相關(guān)。

4 討論

近年研究顯示，合成NO的一氧化氮合成酶主要有原生酶(cNOS)和誘生酶(iNOS)2大類。cNOS主要分布于血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)組織和血小板中；iNOS主要分布于巨噬細胞和血管平滑肌細胞中。NO對血管平滑肌和氣管平滑肌具有舒張作用，并具有介質(zhì)及細胞信號傳遞等調(diào)節(jié)功能，是機體內(nèi)重要的信使分子、效應(yīng)分子和免疫調(diào)節(jié)分子。病理情況下，血管內(nèi)皮的保護性機制減弱或消失，主要的血管收縮因子內(nèi)皮素和主要的血管舒張因子NO釋放失衡，收縮因子占優(yōu)勢，導(dǎo)致和加重了心肌缺血、高血壓等心血管疾病的發(fā)生，提高血清NO的釋放對減輕心肌缺血損傷具有極其重要作用[13]，血清NO釋放量的提高是評價藥物對心肌缺血疾病是否具有治療作用的重要指標。

*．顯著相關(guān)(P<0.05)；**．極顯著相關(guān)(P<0.01)

Note：*.indicates significant differences(P<0.05);**.indicates extremely significant differences(P<0.01).

圖2聯(lián)合組和Rg1組NO釋放量與Rg1入腦量相關(guān)性分析

Fig.2CorrelativeanalysisbetweentheNOlevelandthebrainconcentrationofRg1incombinedgroupandRg1group,respectively

本實驗發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1聯(lián)合B族維生素使用具有協(xié)同促進急性心肌缺血小鼠血清NO釋放的作用，并且人參皂苷Rg1聯(lián)合B族維生素給藥后Rg1的入腦量極顯著高于單獨給予人參皂苷Rg1的入腦量；通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清NO釋放量和Rg1入腦量具有極顯著正相關(guān)。人參皂苷Rg1具有改善腦缺血、心肌缺血、改善學(xué)習(xí)記憶功能、促進智力[14，15]等廣泛的藥理作用，人參皂苷Rg1在大腦神經(jīng)調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，但是進入腦組織中的量一直較低，具有很大的提高空間。藥物入腦量提高在一定范圍內(nèi)會產(chǎn)生更大的調(diào)節(jié)作用，合成NO的合成酶之一cNOS在神經(jīng)組織中也有分布，同時，相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，血清NO釋放量和Rg1入腦量具有極顯著正相關(guān)。綜上，提高Rg1入腦量可能是人參皂苷Rg1與B族維生素聯(lián)合使用協(xié)同促進NO釋放的主要途徑之一，具體調(diào)節(jié)機制值得進一步研究。

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