熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒定量檢測中的應(yīng)用

祖立闖，李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒定量檢測中的應(yīng)用

祖立闖1，李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病[1]，該病流行范圍廣、致死率高、危害性大，是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)殺手[2]。近年來我國豬瘟發(fā)病趨勢出現(xiàn)了明顯的變化，發(fā)病率明顯降低的同時(shí)出現(xiàn)了所謂的非典型豬瘟、溫和型豬瘟和無名高熱綜合征等[3]，使豬瘟野毒感染的臨床診斷以及豬瘟強(qiáng)毒株與疫苗毒的鑒別診斷變得非常困難但又十分必要，亟待建立一種可以準(zhǔn)確鑒別診斷豬瘟病毒強(qiáng)毒株敏感而特異的檢測方法。同時(shí)，由于豬瘟病毒不產(chǎn)生細(xì)胞病變，《中華人民共和國獸藥典》中對(duì)豬瘟疫苗的疫苗效力檢驗(yàn)采用兔體定型熱反應(yīng)方法[4]，該方法利用試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測，成本較高、周期較長、操作繁瑣，動(dòng)物個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，亟待建立新型實(shí)用、標(biāo)準(zhǔn)化的疫苗效力檢驗(yàn)替代方法。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[5]。通過對(duì)PCR過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，可專一、靈敏、快速、重復(fù)地精確定量起始模板濃度，真正實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，擁有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[6]，成為了分子生物學(xué)研究的重要工具，為豬瘟的臨床診斷以及鑒別診斷、豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)等提供了技術(shù)支持。本文就熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究、豬瘟病毒臨床診斷、豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)、豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株鑒別診斷等豬瘟病毒定量檢測中的研究與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為提高我國豬瘟防控水平提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究中的應(yīng)用

熒光定量PCR方法的敏感性高，能夠準(zhǔn)確定量，對(duì)分析病毒的組織定位及病毒刺激相關(guān)細(xì)胞免疫因子的定量檢測提供了技術(shù)支持。牛金鵬等[7]為分析急性感染期豬瘟病毒的組織定位，及豬瘟病毒感染導(dǎo)致豬急性死亡的致病機(jī)理，根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬瘟病毒石門株強(qiáng)毒基因序列，選擇5'UTR相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)引物，經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測豬瘟病毒的熒光定量RTPCR檢測方法，應(yīng)用該方法對(duì)人工感染豬瘟病毒死亡病例的心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦、骨髓、扁桃體、回腸、血清和腸內(nèi)容物等臟器中的豬瘟病毒進(jìn)行了定量檢測，扁桃體中豬瘟病毒含量最高，脾臟和回腸次之，心、肺、血清中病毒含量也比較高，淋巴結(jié)、肝臟、腎、骨髓和腦中病毒含量較低，該SYBR熒光定量PCR方法揭示了豬瘟強(qiáng)毒在急性感染期死亡豬體內(nèi)的分布情況，為豬瘟致病機(jī)理及感染控制的研究奠定了基礎(chǔ)。汪志艷等[8]為從細(xì)胞免疫水平評(píng)價(jià)豬瘟病毒弱毒疫苗的免疫效果，針對(duì)GenBank中豬IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，建立了檢測這3種細(xì)胞因子Taq Man熒光定量RT-PCR方法，應(yīng)用3種細(xì)胞因子Taq Man熒光定量RT-PCR方法對(duì)豬瘟活疫苗進(jìn)行細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)，IFN-γ、IL-2、TNF-α mRNA表達(dá)量在豬瘟病毒弱毒疫苗免疫后3～10 d之間均顯著升高，而IFN-γ在14 d仍保持高水平表達(dá)，表明在豬瘟活疫苗免疫后3 d，豬只已經(jīng)啟動(dòng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫系統(tǒng)，IFN-γ、IL-2、TNF-α的mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)，機(jī)體開始發(fā)揮其細(xì)胞免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，成功解釋了豬瘟疫苗免疫后2～3周才能夠監(jiān)測到中和抗體，但在疫苗免疫后2～4 d，豬只卻能夠?qū)?qiáng)毒攻擊產(chǎn)生一定抵抗力的原因。

2 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒臨床診斷中的應(yīng)用

目前，我國動(dòng)物疫病感染情況日益復(fù)雜，混合感染情況不斷增加，僅憑臨床癥狀很難對(duì)致病原進(jìn)行確診。一般確診豬瘟病毒主要依據(jù)病毒的分離鑒定、RT-PCR、ELISA、膠體金試紙條、熒光抗體試驗(yàn)等，但這些檢測方法均有其不足，比如病毒分離鑒定耗時(shí)長，ELISA、膠體金試紙條、熒光抗體試驗(yàn)等血清學(xué)方法敏感性較低、不能早期檢測，普通RT-PCR方法敏感性有限，且不能對(duì)病毒進(jìn)行定量。熒光定量PCR以其快速、高效、特異、靈敏、定量準(zhǔn)確等廣泛應(yīng)用到豬瘟病毒的臨床診斷中。2012年錦州市周邊一存欄200頭的豬場，突然暴發(fā)以肥育豬厭食、精神不振、體溫高熱達(dá)40℃、可視黏膜和皮膚有針尖大小密集出血點(diǎn)為主要特征的疫病，采集病死豬的組織病料，應(yīng)用豬瘟實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測證實(shí)此次疫病由豬瘟病毒感染所致[9]。熒光定量PCR技術(shù)特異、敏感，為臨床豬瘟病毒感染的診斷和制定科學(xué)合理的凈化方案提供了技術(shù)保障。

3 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟疫苗檢驗(yàn)中的應(yīng)用

豬瘟兔化弱毒疫苗在豬瘟防控中起著重要的作用，但豬瘟弱毒疫苗的抗原效價(jià)或疫苗效力檢驗(yàn)主要采用兔體定型熱反應(yīng)方法，該方法受試驗(yàn)操作、試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異、環(huán)境因素及原材料等多方面原因限制了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。鑒于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、高通量檢測等優(yōu)點(diǎn)，最主要的是能夠?qū)Σ《竞窟M(jìn)行定量監(jiān)測，已被廣泛地應(yīng)用于豬瘟疫苗的檢驗(yàn)中。范斌等[10]在豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒基因組5'非編碼區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品引物、1對(duì)特異性引物和1條探針，建立了評(píng)價(jià)豬瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測的敏感度達(dá)1.2×105拷貝/mL，應(yīng)用該方法對(duì)6個(gè)不同廠家生產(chǎn)的7種豬瘟兔化弱毒活疫苗的效價(jià)進(jìn)行檢測，不同廠家疫苗的效價(jià)差異明顯，最高可相差3個(gè)數(shù)量級(jí)，建議在選擇豬瘟疫苗免疫接種前應(yīng)該先定量檢測疫苗中病毒含量，根據(jù)病毒含量進(jìn)行免疫接種。章秋月等[11]收集福建省內(nèi)使用的10個(gè)不同廠家生產(chǎn)的23個(gè)批次豬瘟弱毒疫苗，應(yīng)用熒光定量RTPCR方法檢測疫苗中病毒核酸的含量，抽檢23個(gè)豬瘟疫苗樣品合格率僅為69.56%，其中傳代細(xì)胞苗的病毒含量相對(duì)較高，脾淋苗病毒含量優(yōu)于細(xì)胞苗，不同廠家生產(chǎn)的同類型疫苗病毒含量差異大，同一廠家生產(chǎn)的同類疫苗存在批間差異。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測豬瘟疫苗病毒含量是一種便捷、高效的方法，為豬瘟疫苗的檢驗(yàn)提供了科學(xué)、有效的指導(dǎo)依據(jù)。

4 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株鑒別診斷中的應(yīng)用

豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛使用對(duì)控制豬瘟的流行起到了關(guān)鍵作用，但由于該疫苗為活疫苗，且沒有分子標(biāo)記，使豬瘟疫苗免疫豬與豬瘟病毒強(qiáng)毒株感染豬難以區(qū)分，給豬瘟病毒強(qiáng)毒株的鑒別診斷帶來很大困難。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、兔體定型熱反應(yīng)法、動(dòng)物接種試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光試驗(yàn)、膠體金試紙條等檢測技術(shù)均不能對(duì)疫苗株和強(qiáng)毒株進(jìn)行區(qū)分，RT-PCR方法雖可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)毒株與疫苗株的鑒別診斷，但常規(guī)RT-PCR方法敏感性較低，容易漏檢。熒光定量RT-PCR方法的敏感性較常規(guī)RTPCR高，且可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，可以作為豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株的鑒別診斷技術(shù)在臨床中推廣應(yīng)用。杜冬華等[12]為建立豬瘟病毒野毒株和疫苗株快速定量鑒別檢測方法，分別根據(jù)野毒株和疫苗株E2基因序列差異設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物及1條TaqMan探針，建立了能同時(shí)檢測豬瘟病毒野毒株和疫苗株的雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測方法，該雙重TaqMan real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與1×101～1×106拷貝/μL之間的E2基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)10拷貝/μL，且特異性和重復(fù)性很好。豬瘟病毒野毒株與疫苗株熒光定量鑒別檢測方法可用于豬瘟病毒野毒株和疫苗株的鑒別診斷及病原定量分析，將為我國豬瘟病毒野毒株感染及疫苗免疫情況的調(diào)查與分析提供高效、快速的檢測手段，為更好地防控豬瘟的發(fā)生與流行奠定了基礎(chǔ)。

5 小結(jié)與展望

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是結(jié)合常規(guī)PCR技術(shù)和光譜技術(shù)發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)定量檢測技術(shù)，與常規(guī)PCR方法相比具有敏感性更高、特異性更強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)、自動(dòng)化檢測、不需核酸電泳檢測、高通量等優(yōu)點(diǎn)，成為目前豬瘟病毒檢測中最準(zhǔn)確的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日趨完善，其在豬瘟病毒的定量檢測中將會(huì)得到進(jìn)一步完善和應(yīng)用，將逐步成為豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的替代評(píng)價(jià)方法、豬瘟病毒臨床診斷尤其是豬瘟病毒強(qiáng)毒株與疫苗株鑒別診斷的主要方法，以及豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究必不可少的重要方法。雖然該技術(shù)需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備、試劑，但隨著國家對(duì)動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室建設(shè)資金投入的不斷增加，熒光定量PCR技術(shù)將逐步成為豬瘟病毒檢測中最準(zhǔn)確、適合現(xiàn)場應(yīng)用的方法，不斷為我國豬瘟的綜合防控事業(yè)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

[1]魏鳳，張文通，李峰，等.一起豬瘟的診治[J].養(yǎng)豬，2016（4）：108-109.

[2]任寶忠.豬瘟防控存在的問題與對(duì)策[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（3）：153.

[3]馬萍，李達(dá)，湯德元，等.鑒別豬瘟野毒與疫苗毒的單一與二重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（9）：2230-2239.

[4]王豐，馮志新，還紅華，等.自動(dòng)測溫技術(shù)用于豬瘟活疫苗兔體熱型判定研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（10）：1668-1673.

[5]歐陽松應(yīng)，楊冬，歐陽紅生，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，2004，24（1）：742-761.

[6]王季秋，趙欣，王照，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)及其在病原微生物檢測中的應(yīng)用[J].中國地方病防治雜志，2016，31（5）：517-519.

[7]牛金鵬，韓雪英，郝華芳，等.SYBR熒光定量PCR方法分析豬瘟石門強(qiáng)毒的組織分布[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（12）：1798-1801.

[8]汪志艷，劉永剛，王剛，等.豬全血中IFN-γ、IL-2、TNF-α Taq Man定量RT-PCR方法的建立及對(duì)豬瘟疫苗的免疫評(píng)價(jià)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（2）：164-168.

[9]李霞.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)一例豬瘟的診斷報(bào)告[J].中國動(dòng)物保健，2012，14（10）：61.

[10]范斌，許文花，韓建強(qiáng)，等.豬瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（12）：56-61.

[11]章秋月，馬華魁，鄭新平，等.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法比較豬瘟疫苗病毒含量[J].福建畜牧獸醫(yī)，2016，38（4）：3-6.

[12]杜冬華，薛擁志，王愛華，等.豬瘟病毒野毒株與疫苗株E2基因雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（12）：1898-1902.

（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0119-02

2016-10-13

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)任務(wù)（SDAIT-08-17）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:zulichuang2008@126.com