參苓白術(shù)散含藥血清影響A549/DDP的順鉑耐藥的研究

●史妍婷 丁福榮 陳芳 程海清 劉永

參苓白術(shù)散含藥血清影響A549/DDP的順鉑耐藥的研究

●史妍婷 丁福榮 陳芳 程海清 劉永

目的：研究參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)肺腺癌順鉑細(xì)胞株(A549/DDP)順鉑耐藥的影響。方法：動(dòng)物隨機(jī)分組，制備參苓白術(shù)散大中小劑量血清(給藥劑量分別為11.34，5.67，2.83g·kg-1·d-1)，將A549,A549/DDP細(xì)胞體外分為順鉑(DDP)組，空白血清+DDP組，含藥血清大劑量+DDP組，含藥血清中劑量+DDP組，含藥血清小劑量+DDP組，細(xì)胞對(duì)照組，經(jīng)過15%各組血清聯(lián)合DDP不同濃度(10，20，40，80，100，200 μmol·L-1)作用48 h,采用MTT法檢測參苓白術(shù)散不同濃度含藥血清對(duì)A549/DDP順鉑耐藥的作用；結(jié)果:與DDP組比較,參苓白術(shù)散不同濃度含藥血清作用于A549/DDP后IC50和耐藥倍數(shù)均有顯著降低(P＜0.05)，以中劑量組(等臨床劑量組)作用最為顯著(P＜0．01)。結(jié)論:參苓白術(shù)散能增強(qiáng)A549/DDP對(duì)順鉑的敏感性。

參苓白術(shù)散；腫瘤；A549/DDP

肺癌的發(fā)病率和死亡率高居惡性腫瘤的首位，對(duì)中晚期肺癌實(shí)施的以順鉑為主的聯(lián)合化療方案可顯著延長患者的生存期。但由于順鉑耐藥的發(fā)生，中晚期非小細(xì)胞肺癌經(jīng)驗(yàn)性化療療效長期停滯于平臺(tái)期[1，3]。因此尋找有效逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥的藥物是成功干預(yù)肺癌化療的關(guān)鍵。前期研究成果表明，參苓白術(shù)散可通過提高患者的免疫能力，抗癌，消炎，保護(hù)受累組織等方面對(duì)中晚期肺癌起到綜合性正性治療作用[2]。為深入探討其分子作用機(jī)制，我們運(yùn)用血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，體外研究參苓白術(shù)散對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株(A549)順鉑耐藥細(xì)胞系(A549/DDP)的影響.

1 材料

1.1 藥品和試劑

參苓白術(shù)散藥材購于濟(jì)南協(xié)和大藥房，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定符合藥典規(guī)定，將參苓白術(shù)散生藥飲片濃縮成每毫升相當(dāng)于原生藥材1.134g的藥液，冷卻后裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱保存。順鉑(DDP)(齊魯制藥廠,批號(hào)WA1A1104003),DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone，批號(hào)SH30022.01),胎牛血清(Hyclone，批號(hào)SV30087.02),MTT鹽溶液(Genview,批號(hào)DH343-3)

1.2 動(dòng)物

SD大鼠16只，許可證號(hào)SCXK（魯）2015-0001，雌雄各半，體重(190-230)g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 細(xì)胞株

A549/DDP,A549細(xì)胞株均購于中國醫(yī)學(xué)院腫瘤研究中心，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37℃，5%C02條件下培養(yǎng)。

1.4 儀器設(shè)備

EL340i酶標(biāo)儀(美國伯樂)，CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus)，TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡)，Thermo CO2培養(yǎng)箱(美國)，

2 方法

2.1 含藥血清的制備

動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4組，A組為參苓白術(shù)散含藥血清大劑量組(給藥劑量11.34g·kg-1)，B組為參苓白術(shù)散含藥血清中劑量組(給藥劑量5.67g·kg-1，相當(dāng)于臨床等效劑量)，C組為參苓白術(shù)散含藥血清小劑量組(給藥劑量2.83g·kg-1)，D組為空白對(duì)照組(灌服相應(yīng)體積的生理鹽水)。每組每天ig給藥1次，連續(xù)3 d給藥，末次給藥后禁食(12 h)，不禁水，再灌服1 d的量，1 h后，腹主動(dòng)脈取血，無菌分離血清，經(jīng)56℃，30min滅活處理后，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的A549,A549/DDP細(xì)胞以1×106/mL接種于25mL培養(yǎng)瓶中，加入4mL含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞基本長滿瓶壁后，用0．25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

2.3 MTT法檢測含藥血清聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后分別加入受試物，繼續(xù)培養(yǎng)48h，實(shí)驗(yàn)終止前4h加入MTT溶液(5mg·mL-1)20 μL,繼續(xù)孵育4 h，除去每孔培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，置搖床上振蕩10min至結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀以490 nm為測定波長，測每孔吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)DDP組，含藥血清大劑量+DDP組，含藥血清中劑量+DDP組，含藥血清小劑量+DDP組，空白血清+DDP組，細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。DDP分10，20，40，80，100，200 μmol·L-16個(gè)濃度級(jí)，細(xì)胞對(duì)照為不加藥物的細(xì)胞懸液，空白對(duì)照為DMSO液。按改良寇式法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）∶lgIC50=Xm-I [P-(3-Pm-Pn)/4](Xm∶lg最大劑量，I∶lg(最大劑量/相臨劑量)，P∶陽性反應(yīng)率之和，Pm∶最大陽性反應(yīng)率，Pn∶最小陽性反應(yīng)率)。按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=[1-(A藥物處理組/A空白對(duì)照組)/(A細(xì)胞對(duì)照組/A空白對(duì)照組)]×100%，耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17軟件包進(jìn)行One Way ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)用±s表示， P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP耐藥性的影響：

每組藥物處理48h后，參苓白術(shù)散含藥血清大、中、小劑量與DDP均存在協(xié)同作用，IC50和耐藥倍數(shù)均存在不同程度的降低，其中以中劑量組結(jié)果最為明顯(P＜0．01)，提示參苓白術(shù)散含藥血清可顯著逆轉(zhuǎn)肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP對(duì)DDP的耐藥，但無明顯改善DDP對(duì)A549的影響。

4 討論

參苓白術(shù)散全方補(bǔ)氣健脾，以治氣虛之本，升舉陽氣，調(diào)理全身氣機(jī)，為健脾益氣之首選方。臨床實(shí)踐表明，肺癌患者化療后常出現(xiàn)面色萎黃、惡心嘔吐、食少消瘦、神疲乏力等脾胃虛弱，氣血不足的表現(xiàn)，故改善肺癌耐藥當(dāng)以健脾益氣為主[4,5]。

順鉑(DDP)是臨床上常用的抗癌藥物之一，具有較廣的抗瘤譜。肺癌細(xì)胞對(duì)DDP產(chǎn)生耐藥性，是化療失敗的主要原因之一。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散含藥血清聯(lián)合DDP在體外有明顯的協(xié)同作用，可明顯降低A549/DDP對(duì)DDP的耐藥性，其中以參苓白術(shù)散等臨床劑量含藥血清(中劑量組)作用最為明顯，等臨床劑量組耐藥倍數(shù)由6.51倍下降至1.93倍，說明肺腺癌耐藥細(xì)胞經(jīng)參苓白術(shù)散含藥血清作用后發(fā)生了一系列生物學(xué)變化，使其對(duì)DDP的敏感性增強(qiáng)，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

（作者單位：山東協(xié)和學(xué)院）

[1]郭其森.非小細(xì)胞肺癌內(nèi)科治療的現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2009,16(10):721.

[2]李瑞池.參苓白術(shù)散治療晚期肺癌的體會(huì)[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006,15(3):343.