板藍(lán)根類(lèi)制劑抑菌生物效價(jià)測(cè)定方法的研究

●饒單平

板藍(lán)根類(lèi)制劑抑菌生物效價(jià)測(cè)定方法的研究

●饒單平

板藍(lán)根是臨床治療中比較常用的一種中藥制劑，具有較好的抑菌和滅菌效果。同時(shí)，板藍(lán)根中包含了很多藥理成分，只采用指紋圖譜對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，會(huì)導(dǎo)致有效含量含義不足。本文將通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究，對(duì)其抗菌活性以及生物效價(jià)的測(cè)定方法進(jìn)行了綜述分析。

板藍(lán)根類(lèi)制劑；抑菌生物效價(jià)；測(cè)定方法

中藥中的活性成分較多，使其具有多方面的藥理作用。目前，理化測(cè)定是控制中藥質(zhì)量的主要方法，也就是對(duì)其中的化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。但是，中藥的藥效并不是某一種具體活性成分的單一作用，也不是多種活性成分的簡(jiǎn)單相加，復(fù)方制劑更是如此。所以，只對(duì)少數(shù)幾種成分進(jìn)行測(cè)量和控制并不能完全對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制，也無(wú)法準(zhǔn)確反映其臨床療效。為了提高中藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，確保藥品臨床使用的安全性，有必要在原來(lái)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)上，增加新的測(cè)定方法——生物活性檢測(cè)，對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)和控制。板藍(lán)根具有清熱解毒、利咽消腫等功效，本文就以板藍(lán)根類(lèi)制為例，對(duì)其抑菌生物效價(jià)的測(cè)定方法進(jìn)行如下綜述。[1]

1 測(cè)定設(shè)備和主要方法

1.1 測(cè)定設(shè)備

板藍(lán)根類(lèi)制劑抑菌生物效價(jià)的檢測(cè)涉及到的檢測(cè)設(shè)備和儀器較多，主要包括：①多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀（北京先驅(qū)威鋒，ZY-300IV）；②高效液相色譜儀（日本島津，LC-2010A）和色譜工作站（LC Solution）；③生化培養(yǎng)箱（蘇州威爾，HPY300）；④色譜柱、4.6mm×250mm Agilent C18和8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；⑤單人單凈化工作臺(tái)（蘇州凈化，VS-840-1（2））；⑥高壓蒸汽滅菌器（英國(guó)AS，AMA440N）；⑦雙頻脫氣智能型超聲混均儀（深圳雷邦電子，PS-100AD）。[2]

1.2 測(cè)定方法

①制備板藍(lán)根提取液。取4份10克板藍(lán)根對(duì)照藥材，各加入80克水、乙醚、乙醇與丙酮，放置在500W超聲下提取30分鐘后蒸干。將50毫升蒸餾水加入提取物后，再用超聲提取60分鐘，過(guò)濾，濃縮為含1g/ml生藥的提取液，放置在4℃環(huán)境中密封保存。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇的提取效果最佳。

②選擇實(shí)驗(yàn)菌株。板藍(lán)根具有比較廣泛的抗菌譜，其提取液對(duì)多種細(xì)菌，例如傷寒沙門(mén)氏菌、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，都有較好的抑制效果。采用國(guó)家規(guī)范文件中的二倍稀釋法，對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC（最小抑菌濃度）進(jìn)行檢測(cè)，并使用平板轉(zhuǎn)染法測(cè)定其MBC（最小殺菌濃度）。

③制備雙碟。取2個(gè)直徑9厘米，高1.6～1.7厘米的平底碟，分別注入20毫升經(jīng)濕熱滅菌溶化后的培養(yǎng)基，使其在碟底內(nèi)均勻分布，并放置在無(wú)菌水平工作臺(tái)上，待其自然凝固后作為底層。然后再加熱融化100毫升滅菌培養(yǎng)基，待其溫度下降到48～50℃后，加入100μL枯草芽孢桿菌菌懸液106cfu/ml，將其搖晃均勻后，在2個(gè)碟內(nèi)分別添加5毫升，并在底層上均勻分布，作為菌層，自然冷卻即可。

上述操作完成后，依次進(jìn)行培養(yǎng)基和緩沖液對(duì)抑菌影響的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳的培養(yǎng)條件、中心濃度，然后經(jīng)過(guò)多次對(duì)比實(shí)驗(yàn)確定生物效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最后完成回收率實(shí)驗(yàn)，對(duì)板藍(lán)根的抑菌生物效價(jià)和板藍(lán)根片的HPLC進(jìn)行評(píng)價(jià)。[3]

2 生物測(cè)定法的評(píng)價(jià)

2.1 適用范圍

生物測(cè)定法在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍比較廣泛，其中常見(jiàn)的有測(cè)定藥物效價(jià)、建立檢驗(yàn)方法、比較藥物作用強(qiáng)度、檢測(cè)微量生理活性物質(zhì)和檢測(cè)農(nóng)藥殘留等方面。在有效物質(zhì)不明確，或者有效物質(zhì)含量較低，以及化學(xué)結(jié)構(gòu)化的中藥材、中藥材制劑、生物制劑中，生物檢測(cè)法是一種經(jīng)常使用的質(zhì)量控制方法。

2.2 選擇合適的藥材提取方法

在本次實(shí)驗(yàn)研究中，我們對(duì)生物檢測(cè)法對(duì)板藍(lán)根藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制進(jìn)行了初步探索。因?yàn)橹兴幍乃幱眯Ч麜?huì)受到提取溶液因素的較大影響，所以選擇了4種具有不同極性的凸起溶劑來(lái)提取，對(duì)板藍(lán)根類(lèi)制劑使用生物測(cè)定法時(shí)，提取溶劑的選擇進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用乙醇的提取效果最佳。在提取方法方面，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)水煎和超生提取的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，超聲提取的效果優(yōu)于水煎。

2.3 回收率和穩(wěn)定性

生物檢測(cè)法的重復(fù)性較差，所以很多文件都對(duì)其可信限率進(jìn)行了規(guī)定?？尚畔蘼士梢钥刂品椒ㄟ_(dá)到一定的精密度。因此可信限率的大小與實(shí)驗(yàn)的各個(gè)方面均有密切關(guān)系。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的回收率均位于90～110%之間，可信限率均在10%以?xún)?nèi)，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有一定的穩(wěn)定性。

2.4 應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

首先，生物檢測(cè)法能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地、不同生產(chǎn)廠(chǎng)家、不同生產(chǎn)批次樣品的抗菌效力進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確有效地評(píng)價(jià)該藥品的抗菌活性，進(jìn)而準(zhǔn)確反應(yīng)出中藥中有效組分的整體抗菌效力。其次，在中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系中引入生物活性檢測(cè)法，既可以對(duì)中藥的品種和質(zhì)量進(jìn)行鑒定，又可以有效提高藥效評(píng)價(jià)。如果將該檢測(cè)方法和傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法結(jié)合起來(lái)，還能夠?qū)λ幤返馁|(zhì)量進(jìn)行更好的控制。

（作者單位：解放軍第184醫(yī)院）

[1]李遠(yuǎn),郭輝,李海濱,等. 基于生物熱動(dòng)力學(xué)分析的板藍(lán)根抑菌效價(jià)檢測(cè)方法的建立[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,01（27）:24-27.

[2]鄢丹,任永申,駱驕陽(yáng),等. 中藥質(zhì)量生物測(cè)定的思考與實(shí)踐——以板藍(lán)根為例[J]. 中國(guó)中藥雜志,2010,19（06）:2637-2640.

[3]李寒冰,武彥舒,肖小河,等. 基于抗病毒活性檢測(cè)的板藍(lán)根質(zhì)量生物評(píng)價(jià)方法及優(yōu)化研究[J]. 中草藥,2011,08（34）:1560-1565.