葡萄酒中2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）檢測新技術的研究進展

周立華，牟德華，李　艷，2（.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊05008；2.河北省發(fā)酵工程技術研究中心，河北石家莊05008）

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葡萄酒中2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）檢測新技術的研究進展

周立華1，牟德華1，李艷1，2
（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

摘要：2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）是危害葡萄酒感官品質(zhì)的一種物質(zhì)，通常來自于葡萄酒封裝所用的軟木塞，也可能來自葡萄原料或釀酒過程中的污染，它的存在使葡萄酒產(chǎn)生不良氣味和口感。簡介了最近十幾年來檢測葡萄酒中TCA的新方法和新儀器，包括葡萄酒中TCA的萃取技術和檢測技術。并對這些新技術的特點、原理及應用優(yōu)勢進行了闡述。目的是為對葡萄酒中的TCA做到精確、低檢出限和高靈敏性的定性及定量測定提供參考，從而對葡萄酒中的TCA進行準確的監(jiān)測，最終提高葡萄酒的品質(zhì)。

關鍵詞：2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）；葡萄酒；萃??；檢測；新技術

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1545.009.html。

葡萄酒作為人們餐桌上的飲料酒，正在被越來越多的人們所接受，而隨著生活水平的提高，葡萄酒品質(zhì)問題也逐漸引起人們的重視，而葡萄酒中的2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）就是造成污染的原因之一。葡萄酒中含有極低量（ng/L級）的2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）即可影響葡萄酒的氣味和口感。TCA在葡萄酒中的感官閾值一般在1.4～4.6 g/L［1-2］，通常3.1ng/L為人們所接受的最高濃度［3］。據(jù)統(tǒng)計，有2%～5%的葡萄酒會受到TCA的污染［4］。在葡萄酒釀造過程中因原料和生產(chǎn)場地污染可能會產(chǎn)生極少量的TCA，但葡萄酒中TCA的來源主要是封裝酒瓶的軟木塞。因葡萄酒中TCA含量極低，要準確測定對萃取和檢測環(huán)節(jié)的要求極高。近年來國內(nèi)外學者研究開發(fā)出了很多新方法、新儀器和新技術，力求提高葡萄酒中TCA檢測的精準性。本文匯總闡述最近十幾年來檢測葡萄酒中TCA的新方法和新儀器，為精確、低檢出限和高靈敏性的定性和定量測定葡萄酒中TCA提供參考。

1葡萄酒中TCA的來源

20世紀末，某些歐洲國家進行了一項名為“櫟木工程”的研究，其主要目的是研究葡萄酒因為軟木塞污染而產(chǎn)生異味的原因。研究結果表明，80%出現(xiàn)軟木塞污染的裝瓶葡萄酒所散發(fā)出的霉味是由TCA造成的［5］。因此，TCA對葡萄酒的污染成為很多科研工作者的研究內(nèi)容。TCA最主要的來源是封裝葡萄酒的軟木塞。研究表明，在污染產(chǎn)黃青霉菌、擬青霉菌和光孢青霉菌的軟木塞中，TCA含量極高。軟木中的2，4，6-三氯苯酚（TCP）經(jīng)霉菌的甲基化作用產(chǎn)生TCA［6］。除軟木塞引入葡萄酒TCA外，葡萄原料和葡萄酒釀造過程、橡木桶陳釀過程等的污染也是葡萄酒中TCA的來源，如在葡萄生長過程中，為了防治病蟲害而使用的殺真菌劑、殺菌劑和除草劑等農(nóng)藥，橡木桶在制作過程中用到的含有五氯苯酚（PCP）、2，3，4，6-四氯苯酚（2，3，4，6-TeCP）和2，4，6-三氯苯酚（TCP）的木材防腐劑等［7-8］，都可能造成葡萄酒中TCA的污染。

2葡萄酒中TCA的常規(guī)萃取與檢測方法

國際標準化組織ISO在2007年制定，2014年修訂了檢測葡萄酒及軟木塞中可釋放TCA的標準ISO 20752—2014。該標準所規(guī)定的方法是用12%vol酒精-水溶液浸泡軟木塞24h，采用固相微萃取提取浸泡液中的TCA，再以2，4，6-TCAd5為內(nèi)標物，采用氣相色譜電子捕獲檢測器（GC-ECD）或氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）進行檢測［9］。然而該方法在實施過程中因樣品中TCA的萃取和檢測兩個最重要環(huán)節(jié)具體的TCA萃取條件、儀器類型、檢測人員等不同，致使檢測結果容易出現(xiàn)極大的誤差。

2.1樣品中TCA的萃取

2.1.1頂空固相微萃取法（Headspacesolid-phase microextraction，SPME）

固相微萃取一般也稱為頂空固相微萃取技術，是利用涂有特定高分子固相聚合物液膜的玻璃纖維萃取頭對樣品進行萃取，萃取頭在樣品液面之上，通過對樣品水浴使揮發(fā)性成分進入頂空中，從而被萃取頭所吸附［10］。該方法在萃取過程中萃取頭不與液體接觸，避免了樣品基質(zhì)的干擾，是目前較常見的富集萃取方法。ISO 20752—2014中是采用100μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂層的纖維頭對12%vol乙醇模擬葡萄酒基質(zhì)的軟木塞浸泡液進行頂空固相微萃?。℉S-SPME），應用GC-ECD或GC-MS測定TCA，其最低定量限（LOQ）可達到0.5ng/L。M.Riu等［11］在幾種軟木塞中的TCA及5種氯苯甲醚的檢測中對6種固相萃取頭進行了優(yōu)化選擇，以TCA的峰面積為比較對象，最終50/30μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）的萃取頭效果最優(yōu)，測得的TCA的檢測限為0.8ng/g，回收率在90.3%～105.8%，相對標準偏差（RSD）4%～13%。Lizarraga E等［12］利用頂空固相微萃取技術結合GC-MS對紅葡萄酒中的TCA等物質(zhì)進行檢測，同時優(yōu)選萃取頭，從5種萃取頭中選擇出100μm PDMS。經(jīng)檢測，TCA的回收率＞95%，RSD＜5%，LOQ為0.1ng/L。李艷等［13］采用L18（73）正交試驗法優(yōu)化了頂空固相微萃取TCA的條件，結果是：萃取頭涂層為聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB），12%vol乙醇軟木塞浸泡液體積10mL，平衡20min，萃取35min，30%NaCl，萃取溫度30℃，攪拌轉速40r/s，并且比較了GC-ECD和GC-MS兩種檢測方法，結果表明，GC-MS的回收率要優(yōu)于GC-ECD，但是檢出限GC-MS要高于GC-ECD，可見TCA萃取條件和萃取頭涂層對檢測結果都有影響。

2.1.2液液萃取法（Liquid-liquid extraction，LLE）

液液萃取法是應用較早的樣品前處理萃取技術，Pe?a-Neira A等［14］在對葡萄酒和軟木塞中的TCA等4種氯代苯甲醚和3種氯酚類物質(zhì)的檢測中應用了液液萃取技術，試驗中分別用10mL和5mL正戊烷在4℃下萃取軟木塞和葡萄酒樣中的TCA等物質(zhì)24h，共萃取3次，最后合并有機相，氮吹濃縮至50μL，用GC-ECD進行檢測，進樣量10μL，檢測結果顯示：TCA的LOD 0.5ng/L，并且驗證了葡萄酒的污染和軟木塞污染之間的相關性。該方法雖應用廣泛，但在TCA的萃取中應用較少，原因是該技術需要大量有機溶劑，萃取時間長，且萃取效果不佳，回收率低等［15］。

2.1.3固相萃取法（Solid Phase Extraction，SPE）

固相萃?。⊿PE）技術是從20世紀80年代中期開始發(fā)展起來的一項樣品前處理技術，具有回收率和富集倍數(shù)高、有機溶劑用量少、無相分離操作、能處理微量樣品和易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點［16］，該技術主要利用樣品流經(jīng)固體吸附劑時，不同化合物與吸附劑間的吸附與解吸附作用，將液體樣品中的目標化合物與樣品基底以及干擾化合物分離，再通過洗脫液迅速洗脫，達到分離和富集的效果［17］。固相萃取技術在TCA的檢測中具有較廣的應用前景，檢測的基礎是對固相萃取柱的填料進行選擇，常用的填料有C8、氰基、氨基、苯基、雙醇基填料，活性炭、硅膠、氧化鋁、硅酸鎂、聚合物、離子交換劑、排阻色譜填料、親合色譜填料等。Insa S等［18］以LiChrolut EN樹脂為填料進行固相萃取，處理前加入12.5mL甲醇和水溶液，添加1%的NaHCO3，對揮發(fā)性物質(zhì)進行去除，為了增加進樣量，試驗在進樣口增加了一個大容量注射器，進樣量為40μL，采用GC-MS對TCA和2，4，6-三溴苯甲醚（TBA）進行檢測，其RSD都小于6%，LOD值分別為0.2ng/L和0.4ng/L。

2.2測定TCA常用的方法

2.2.1氣相色譜電子捕獲檢測器（GC-ECD）測定TCA

在TCA的檢測中應用較為普遍的是GC-ECD技術，該法利用了ECD檢測器對鹵素較敏感［19］、高靈敏度和高選擇性的特點。Slabizki P等［19］利用SPME技術對葡萄酒及軟木塞中的TCA進行萃取濃縮，結合GC-ECD進行檢測，采用同位素內(nèi)標法進行定量，得出TCA的LOD為0.1ng/L，體現(xiàn)了高靈敏度。Vlachos P等［20］同樣利用SPME的前處理法對葡萄酒及軟木塞中的TCA進行萃取，以2，3，6-三氯甲苯（2，3，6-TCT）為內(nèi)標物，利用GC-ECD進行檢測，結果顯示：標準曲線R2＞0.99，RSD= 5.72%，回收率＞86%，葡萄酒中的LOD值在0.177～0.368ng/L之間，證明了很高的靈敏性。此外Riu M等［5，21］及ISO檢測標準［9］也利用了GC-ECD檢測方法對TCA進行檢測分析。該方法是對痕量物質(zhì)檢測中較為常見的檢測方法，可以進行葡萄酒及軟木塞中的TCA測定。

2.2.2氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）測定TCA

在葡萄酒及軟木塞中TCA的檢測中，也較常用GCMS，該方法在定性方面優(yōu)于GC-ECD，對目標物質(zhì)進行特征離子定性更準確。該方法包括了氣相色譜離子阱質(zhì)譜法（GC-ITMS）、氣相飛行質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-TOF-MS）、氣相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法（GC-MS）和氣相串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）等。Insa S等［18］以SPE法為TCA的前處理提取方法，以GC-ITMS檢測葡萄酒中的TCA，結果表明，LOD為0.2ng/L，體現(xiàn)了高靈敏性。Carasek E等［22］利用了內(nèi)部冷卻頂空固相微萃?。–F-HS-SPME）技術，以GCTOF-MS檢測軟木塞中的TCA，得出LOD=0.25ng/g，R2= 0.994的檢測結果。J?nsson S等［23］采用SPME處理樣品，通過氣相色譜-高分辨質(zhì)譜（GC-HRMS）檢測，以質(zhì)荷比（m/z）210、212為TCA的定性離子，174為其定量離子，結果顯示：LOQ值為30 pg/L，R2=0.9975，RSD=3.5%。

3 TCA萃取與檢測新技術

TCA檢測新技術是指近年來在檢測葡萄酒及軟木塞中應用的新方法和新儀器，在很多方面可以彌補傳統(tǒng)方法的不足，適合不同的檢測環(huán)境，包括樣品中TCA萃取和檢測兩方面，如多次頂空固相微萃?。∕HS-SPME）、內(nèi)部冷卻固相微萃?。–F-HS-SPME）、頂空單滴微萃?。℉S-SDME）、漩渦輔助液液微萃?。╒ALLME）、加壓流體萃?。≒FE/ASE）、超聲輔助乳化微萃?。║SAEME）、超臨界流體萃?。⊿FE）等TCA萃取法，大大縮短了萃取時間。在新檢測方法中毛細管柱分離和離子遷移質(zhì)色譜聯(lián)用檢測法（MCC-IMS）可以在毫秒級（ms）的檢測時間內(nèi)對TCA進行檢測，具有快捷、適合某些特殊環(huán)境檢測的特點。

3.1樣品中TCA萃取新技術

3.1.1以固相為萃取基質(zhì)的新方法

以固相為萃取基質(zhì)的方法是目前對痕量成分富集萃取最常見的方法，其操作步驟相對于溶劑萃取要簡單、不用大量有機溶劑、萃取時間短、需要樣品量少，對于一些珍貴酒樣的測量比較實用，但存在萃取頭易損耗的缺點。萃取前需對所用萃取頭涂層的種類和厚度進行選擇，對萃取條件，如離子強度（一般加入NaCl）、樣品量、萃取溫度、平衡時間、萃取時間和攪拌速率等進行優(yōu)化。

3.1.1.1空間分辨固相微萃?。╯pace- resolved solid phase microextraction，SR-SPME）

空間分辨固相微萃取技術是近年來應用于TCA的萃取方法，其低檢出限與靈敏性，可以極大程度的對目標物質(zhì)進行萃取，具有高度濃縮萃取的特點，目前被越來越多的人所應用，其主要的原理就是將萃取針頭分為兩部分，中間隔開，上下兩部分為具有不同萃取特點的固定相，可以對不同特點和極性的物質(zhì)進行萃取，可以部分與液體接觸。國內(nèi)的Liu M等［24］分別以石墨烯（graphene）和石墨烯氧化物（graphene oxide）為萃取纖維的涂層，對葡萄酒中的TCA和DBP（鄰苯二甲酸二丁酯）進行了萃取，石墨烯萃取涂層以頂空的形式對揮發(fā)的TCA進行萃取，而石墨烯氧化物涂層深入液體中對鄰苯二甲酸二丁酯進行萃取，結合GC-MS的檢測手段，最終得到TCA的檢測限為0.3ng/L，精密度達到了5.4%，回收率也達到了96.96%，通過建立空間分辨固相微萃取技術，達到了對葡萄酒中的TCA進行富集萃取的目的，進而對葡萄酒中的微量TCA進行測定。

3.1.1.2分散固相萃取（Dispersive solid phase extraction，DSPE）

DSPE和SPE技術相似，都是以固體為萃取基質(zhì)，不同之處是SPE一般利用萃取柱，而DSPE可以直接把萃取固體加入到樣品中，這種技術最早在2003年提出，具有快速、簡便、廉價、高效、耐用和安全的優(yōu)點［25］，但是一般LOD值較高。Patil S H等［26］以甲苯為萃取劑對酒樣進行萃取，萃取液加入到含100 mg無水CaCl2、25 mg乙二胺-N-丙基硅烷和50 mg無水MgSO4的萃取容器中進行分散固相萃取，同時利用氣相-飛行質(zhì)譜（GC-TOFMS）和氣相-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）進行檢測方法的優(yōu)化研究。結果表明，GC-TOFMS更省時間，而GC-MS/MS精確度高，LOD值為0.0083ng/L，回收率80%～110%，R2＞0.999。

3.1.1.3多次頂空固相微萃?。∕ultiple headspace solid phase microextraction，MHS-SPME）

MHS-SPME技術是指針對同一樣品進行多次連續(xù)萃取，目標分析物的總量為多次SPME量的總和，計算公式為：AT=A1/（1-β），β可由公式lnAi=（i-1）lnβ+ lnA1來確定，式中A1和AT分別代表第1次萃取和第n次萃取后色譜峰的總面積，A1和Ai分別代表第1次和第i次的萃取峰面積［27］。該方法無需考慮待分析物在頂空和固相微萃取涂層間的分配系數(shù)，而只需達到吸附平衡即可，因此可以去除頂空分析時的基質(zhì)效應。Ezquerro ó等［28］運用MHS-SPME技術萃取軟木塞中的TCA，使用的萃取頭是50/30μm DVB-CAR-PDMS，結合GC-MS分析檢測，結果LOD=0.006ng/mL，R2=0.995。MHS-SPME有更好的檢測靈敏性，更適合對軟木塞和葡萄酒中痕量的TCA進行精確的萃取和檢測。

3.1.1.4侵入式固相微萃?。↖ntrusive solid phase micro extraction，IS-SPME）

IS-SPME技術是將涂有萃取涂層的萃取纖維頭直接插入液體或者氣體樣品中進行萃取的一種萃取濃縮技術，該技術比SPME技術靈敏度更高［28］。Maggi L等［29］比較了攪拌棒吸附萃取法（SBSE）、頂空固相微萃?。℉SSPME）和侵入式固相微萃?。↖S-SPME）3種萃取技術。IS-SPME選用100μm PDMS萃取頭，在室溫、700r/min下對葡萄酒中的TCA等物質(zhì)進行萃取，再通過GC-MS/ MS技術進行檢測，結果顯示，IS-SPME的靈敏度是HSSPME的188.4倍，測得TCA的LOD值為0.46ng/L。

3.1.1.5內(nèi)部冷卻頂空固相微萃?。↖nternally cooled solid-phase microextraction，CF-HS-SPME）

CF-HS-SPME技術是在頂空固相微萃取裝置基礎上增加一個對萃取纖維頭進行冷卻的裝置，在對樣品進行加熱的同時，對萃取纖維進行冷卻，當揮發(fā)性成分在加熱條件下?lián)]發(fā)進入頂空時，遇到冷卻狀態(tài)下的萃取纖維頭，從而增加了分析物和纖維涂層之間的分配系數(shù)，被快速高度的濃縮［30］。Carasek E等［22］對比了CF-HS-SPME 和HS-SPME兩種萃取方法，CF-HS-SPME的萃取頭涂有聚二甲基硅氧烷涂層，結合GC-MS檢測軟木塞中的TCA等物質(zhì)，結果顯示，僅用10min的萃取效果遠遠超過了HS-SPME的75min萃取效果，TCA的LOD值為0.25ng/g，R2=0.994，其檢測效果優(yōu)于HS-SPME，萃取時間比常規(guī)方法短，并且達到不損害樣品檢測的目的。

3.1.1.6攪拌棒吸附萃取法（Stir bar sorptive extraction，SBSE）

SBSE萃取技術是將聚二甲基硅氧烷（PDMS）套在內(nèi)封磁芯的玻璃管上作為萃取涂層，對樣品中的待測物進行吸附，待萃取完成后，通過熱解吸儀對待測物進行熱解吸，供氣相色譜分析［31］。R.M.Callejon等［32］建立和檢測了軟木塞中TCA等8種物質(zhì)的檢測方法，在前期乙醇萃取中使用了大容量萃取和低容量萃取2種方法，乙醇萃取完成后，利用涂有聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂層的攪拌棒對萃取溶劑進行再一次的萃取，條件為700r/min下攪拌60min，結合GC-MS檢測，定性荷質(zhì)比為195，結果顯示：TCA的LOQ=1.2ng/g，R2=1。Cacho J I等［33］利用SBSE萃取結合GC-MS技術對包括干紅、干白和桃紅共30種葡萄酒中的TCA等物質(zhì)進行了檢測，萃取條件為：加入10%（w/v）NaCl，pH3.0，萃取2h，結果顯示，TCA 的LOD值為0.4ng/L，RSD 4.3%，6種酒樣中的TCA在32ng/L以上，屬TCA超標酒。

3.1.1.7攪拌棒-微波輔助萃取聯(lián)用法（stir bar sorptive extraction-microwave assisted extraction，SBSE-MAE）

在攪拌棒萃取的基礎上增加微波輔助萃取技術，對軟木塞中TCA的檢測時一般都要制備浸出液，浸出步驟操作簡單，但耗費大量時間，例如ISO標準中要在模擬酒樣中浸泡24h±2h才能進行后續(xù)其他步驟，微波輔助萃取法的應用縮短了這一操作時間。Jochen Vestner等［34］用10%vol乙醇溶液浸泡軟木塞，采用攪拌棒輔助微波萃取技術，優(yōu)化的萃取條件為40℃萃取2h，然后冷卻90min到室溫，與普通的浸泡萃取時間為24h作對比；再利用涂有0.5 mm PDMS涂層的攪拌棒進行1000r/min，60min吸附萃取，以GC-MS檢測，以同位素內(nèi)標法進行定量，和普通的浸泡萃取技術相比，結果顯示，以微波輔助技術對軟木塞進行浸泡，節(jié)省大量時間，RSD分別為9.1%～14.4%和11.6%～26.6%，且重復性更好，R2=0.9997，LOD=0.5ng/L。

3.1.2以液相為萃取基質(zhì)的新技術

以液相為萃取基質(zhì)的技術可以分為液液萃取和液液微萃取。液液萃取是利用有機溶劑對物質(zhì)進行萃取，一般有機溶劑用量較大，而液液微萃取有機溶劑用量相對少得多。目前對酒中和軟木塞中TCA的檢測中最近幾年發(fā)展最快的是微萃取技術，該方法可將目標物的萃取、純化、濃縮集中于一步操作中完成，經(jīng)濟并可循環(huán)利用，不存在萃取頭損耗的缺點［35］。影響該方法萃取效率的因素有離子強度、萃取溶劑、萃取溫度、萃取時間和樣品pH值等，在萃取前必須進行優(yōu)化實驗，以達到最有效的萃取效果。

3.1.2.1頂空單滴微萃?。℉eadspace single drop microextraction，HS-SDME）技術

HS-SDME利用了目標分析物在體系中三相之間的分配平衡，此三相分別為樣品溶液、萃取溶劑和萃取微滴所在的樣品溶液上方的氣相。操作步驟是將微量的有機溶劑或離子液體吸入微量進樣器中，將其插入裝有樣品的頂空瓶中，使溶劑懸掛于進樣器的頂端進行對揮發(fā)物的吸附，待萃取完成后抽回萃取液滴并將微量進樣器從樣品瓶中拔出，直接將此液滴注射到GC中進行分析［35］。吸附溶劑分2種：一種是有機溶劑，只要具有吸附性即可；另一種是離子液體，又稱室溫離子液體或室溫熔融鹽，由陰陽離子組成，室溫或低溫下呈液態(tài)［36］，主要有季磷酸鹽、季銨鹽、咪唑、噻唑、吡啶和吡咯啉類等。

Martendal等［35］以2μL有機溶劑1-正辛醇為萃取劑，對葡萄酒中TCA進行萃取，65℃萃取30min，利用GCECD檢測，結果顯示，LOD值為8.1ng/L；Márquez-Sillero I等［37］以離子液體1-己基-3-甲基咪唑雙（三氟甲基黃?；﹣啺符}（［Hmim］［NTf2］）為萃取溶劑，對葡萄酒中TCA進行前處理，樣品中NaCl含量為350 g/L，30℃萃取20min，攪拌速率500r/min，結合離子遷移譜法（IMS），得到TCA的LOD值為0.2ng/L，所建方法TCA 10ng/L時的精確度為1.4，RSD 2.2%。

3.1.2.2漩渦輔助液液微萃取（Vortex-assisted liquidliquid microextraction，VALLME）

VALLME是一種高效、快捷、方便和經(jīng)濟的方法，它允許重復測量，只需要小體積的提取溶劑，利用了微量萃取劑在樣品中擴散距離短和比表面積大的特性，使平衡更快。它是將微量有機溶劑加入到樣品中，漩渦一段時間，靜置分層，取出微量有機溶劑，進行檢測［38］。Pizarro C等［39］利用VALLME檢測葡萄酒中的TCA，利用響應面優(yōu)化萃取條件，結果為5mL葡萄酒加入到10mL小瓶中，加入135μL萃取溶劑，加0.28 g NaH2PO4使pH7.6，0.15 g NaCl，2500r/min漩渦輔助液液微萃取7min，萃取溶劑比較了四氯化碳、氯苯、氯仿、二硫化碳和四氯乙烯的萃取效率，最終發(fā)現(xiàn)，四氯乙烯為最適溶劑，收集萃取相，結合GC-μECD檢測，LOD值為2.1ng/L。VALLME具有方便和節(jié)省樣品處理時間的優(yōu)點。

3.1.2.3分散液液微萃取法（Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）

DLLME技術具有較高的富集能力，可以對極微量物質(zhì)進行萃取，是指萃取溶劑（密度大于水且不溶于水）和分散溶劑（和水及萃取劑有好的相容性）被注入到樣品中，進行快速萃取，萃取完成后進行離心使其分層，用進樣器取出萃取溶劑，進行儀器分析［40］。Pizarro C等［41］對軟木塞和葡萄酒中的TCA進行了萃取，在室溫下，5mL酒樣或軟木塞浸泡液倒入10mL玻璃管中，加入1.43mL丙酮為分散劑，173μL氯仿為萃取劑，不添加鹽類物質(zhì)，萃取結束后，5000r/min離心2min，用微進樣器在離心后的玻璃管底部分離出有機相，GC-MS/MS進行檢測，結果顯示：當S/N=3時，TCA的LOD值為5.0ng/L，R2= 0.995，RSD＜7.1%。

3.1.2.4加壓流體萃?。≒ressurized fluid extraction，PFE）技術

PFE也稱加速溶劑萃?。ˋSE），是一種主要對固體和半固體樣品進行目標成分萃取的樣品前處理方法，其原理為通過高壓，使溶劑和揮發(fā)性物質(zhì)即使在高溫環(huán)境下（高于沸點）依然保持液相狀態(tài)，從而降低溶劑和目標物質(zhì)的損失，提高萃取效率，該方法操作簡單、污染小、溶劑消耗量少、易于自動化［42］，對氯代苯類物質(zhì)的萃取效果靈敏，適合對TCA提取。PFE的萃取步驟為：①將樣品加入到提取池；②填充有機萃取溶劑；③加壓和加熱提取池，在設定的條件下提取；④收集有機萃取溶劑；⑤用新鮮溶劑進行清洗，用氮氣流進行吹洗；⑥萃取劑氮氣濃縮，進樣［36］。Ezquerro ó等［43］做了PFE、MHS-SPME和索氏提取法（Soxhlet procedures）對軟木塞中TCA和愈創(chuàng)木酚萃取效果的比較實驗，綜合多個因素考慮，PFE被選為樣品的處理方法，實驗中取0.75 g軟木塞用正戊烷分3次進行萃取，在壓力10.4MPa，150℃下萃取14min，結合GC-MS檢測，結果顯示：TCA的回收率101%，RSD 7%～11%間，證明了PFE是一種具有低溶劑消耗量和萃取時間短等優(yōu)點的前處理方法。

3.1.2.5超聲輔助乳化微萃?。║ltrasound-assisted emulsification microextraction，USAEME）

USAEME是一種在樣品中加入適合有機溶劑，然后進行超聲波處理，使溶劑和樣品達到均勻乳化狀態(tài)，快速達到傳質(zhì)平衡，進行高效萃取，然后離心分離，最后進行儀器檢測的快速、簡單和高效的樣品前處理方法［44-46］。Fontana A R等［47］取5mL酒樣放入10mL玻璃離心管中，加400μL 6.15mol/L NaCl溶液和500μL 0.013mol/L四硼酸緩沖溶液，25μL三氯乙烯為萃取溶劑，20℃超聲5min，3500r/min離心2min，分離離心管底部的溶劑，1μL用于GC-MS/MS檢測，結果顯示：TCA≤10ng/L時，LOD值為0.6～0.7ng/L，RSD≤11.3，R2=0.9995。

3.1.2.6超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）技術

SFE技術是利用了溶劑在超臨界狀態(tài)下呈現(xiàn)氣液不分的狀態(tài)，性質(zhì)介于氣體和液體之間，具有優(yōu)異的溶劑性質(zhì)，其密度接近于液體密度，并隨流體壓力和溫度的改變發(fā)生十分明顯的變化，而溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度隨超臨界流體密度的增大而增大。SFE正是利用這種性質(zhì)，在較高壓力下將溶質(zhì)溶解于流體中，然后降低流體溶液的壓力或升高流體溶液的溫度，使溶解于超臨界流體中的溶質(zhì)因其密度下降、溶解度降低而析出，從而實現(xiàn)特定溶質(zhì)的萃?。?8-49］，SFE最常用的溶劑是CO2。Taylor M K等［50］以CO2為提取溶劑對軟木塞中的TCA進行了萃取，經(jīng)過優(yōu)化：0℃為萃取溫度，25℃為解析溫度，在250 bar，CO2流量2mL/min，萃取時間15min，目標物在解析后用1mL/min甲醇進行再溶，結合GC-MSD進行檢測，同位素內(nèi)標法定量，結果顯示：LOD值為5pg/g，回收率97%～103%，可以看出，SFE是一種快速、高效和便于自動化的萃取技術。

3.2TCA檢測新方法

3.2.1毛細管柱分離和離子遷移譜聯(lián)用技術（Multicapillary column and ion mobility spectrometry，MCC-IMS）

MCC-IMS是利用毛細管色譜進行物質(zhì)分離，進入離子遷移譜儀后目標物質(zhì)被電離為離子，隨后被注入到一個均勻電場中進行定向遷移，由于各離子的質(zhì)量和大小等不同，所以在電場中的遷移速度不同，最終達到分離，按照先后順序得到譜圖對應不同物質(zhì)的特征時間峰［51］。離子遷移譜用于痕量物質(zhì)的檢測，LOD值一般為ng級，甚至為pg級，分析時間為s級。Márquez-Sillero I等［37］利用單液滴微萃取作為前處理方法，2μL進樣，經(jīng)50mL/min 的N2流儀器進入毛細管柱進行分離，然后進入離子遷移譜儀進行離子分離定性定量，結果顯示：TCA峰出現(xiàn)在6～8 ms時間內(nèi)，TCA的LOD值為0.2ng/L?？梢钥闯?，MCC-IMS檢測法的檢測時間短，是快速檢測的最優(yōu)選擇，在某些要求快速定量的狀況下被廣泛應用。

3.2.2氣相與原子發(fā)射光譜聯(lián)用（Gas chromatographyatomic emission detection，GC-AED）技術

原子發(fā)射光譜法（AED）是一種比質(zhì)譜靈敏性更高、選擇性更好、操作更簡單的檢測方法，是利用物質(zhì)在熱激發(fā)或電激發(fā)下，不同元素的原子或離子發(fā)射特征光譜的差別來判斷物質(zhì)的組成，進而進行元素的定性與定量分析的方法［52］。Campillo N等［53］利用吹掃捕集法對葡萄酒及軟木塞進行了前處理，物質(zhì)進入氣相進行分離，然后利用AED進行定性定量分析，檢測結果：軟木塞和酒中TCA的LOD值分別為25 pg/g和5ng/L，回收率在88.5%～102.3%之間。可以看出，GC-AED技術在對TCA的檢測中有很高的靈敏性，該技術可以對一些要求較高的葡萄酒中的TCA進行檢測。

3.2.3循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）

CV以等腰三角形的脈沖電壓加在工作電極上，得到的電流電壓曲線包括兩個分支，如果前半部分電位向陰極方向掃描，電活性物質(zhì)在電極上還原，產(chǎn)生還原波，那么后半部分電位向陽極方向掃描時，還原產(chǎn)物又會重新在電極上氧化，產(chǎn)生氧化波。因此一次三角波掃描，完成一個還原和氧化過程的循環(huán)，故該法稱為循環(huán)伏安法，其電流-電壓曲線稱為循環(huán)伏安圖，再通過峰面積減去空白的峰面積與相應濃度做線性，最終進行定量［54］。Peres A M等［54］利用CV法對軟木塞中的TCA進行了檢測，實驗采用乙腈和水3∶2（v/v），掃描速度為100 mV/s，結果為：LOD值為0.31ng/L，LOQ值為0.95ng/L，RSD＜3%，該方法的檢測限低，且重復性好。

3.2.4飛行質(zhì)譜電暈放電離子遷移光譜聯(lián)用（CD-IMS-oaTOF）技術

CD-IMS-oaTOF是在放電離子遷移譜法中增加電暈放電高壓電場，使物質(zhì)產(chǎn)生高能電子，再由電子遷移譜儀進行電子遷移，電子經(jīng)過遷移分離后進入飛行質(zhì)譜進行定性定量檢測［55］。Lichvanová Z等［55］利用CD-IMS-oaTOF技術定性定量測定TCA，TCA在氣相中LOD值為100 μg/L，在固相中RSD為150ng/L，檢測在20 ms內(nèi)完成。由檢測結果可以看出，該方法的檢測限靈敏度并不高，但節(jié)省檢測時間，對TCA能夠達到快速測定的目的，適合一些特殊情況下的檢測。

3.2.5其他檢測新技術

生物傳感器法（Biosensor）是利用生物膜系統(tǒng)免疫特性點識別檢測，生物點識別檢測是基于細胞膜內(nèi)含有人工制造的待測物特異性抗體，可與樣品中的待測物結合，使固定細胞的膜電位改變并對其識別，從而對待測物進行檢測［56］。Apostolou T等［56］以pAb78為多克隆抗體，在生物傳感器系統(tǒng)上樣品通過浸入軟木組織并直接與細胞生物識別元件相連，沒有干預萃取過程，以生物膜上電位的變化對軟木中的TCA進行檢測分析，得出R2=0.9864，LOD值為0.2ng/L，檢測時間5min。該方法快速、不用有機溶劑、便攜，可直接應用于現(xiàn)場，對軟木塞進行高通量篩選，無需任何類型的配套基礎設施。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是將抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合而建立的一種免疫分析方法，主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結合物仍保持其免疫活性和酶催化活性［57］。Moore E等［57］利用特異性酶聯(lián)免疫吸附法對TCA進行了測定，以堿性磷酸酶（AP）為標記物，通過TCA與半抗體的競爭關系對TCA進行特異性檢測，結果顯示LOD值為1ng/mL。該方法特異性強、簡單和快速，但靈敏性較差。

4 TCA污染的防治

對于葡萄酒行業(yè)，防治TCA污染是很嚴峻的問題，要想減少其對葡萄酒的污染，減少經(jīng)濟損失，就要在葡萄酒的制作原料、釀造過程和軟木塞封裝等環(huán)節(jié)進行嚴格防控。在葡萄生長成熟期嚴禁使用含有氯酚類物質(zhì)的除草劑、殺蟲劑等有機農(nóng)藥，減少TCA的污染。同時，嚴禁使用發(fā)霉的軟木塞封裝葡萄酒。在發(fā)現(xiàn)酒體或軟木塞污染了TCA后，在不影響葡萄酒品質(zhì)和不破壞軟木塞的前提下，利用一些手段對TCA進行去除，C.Pereira等［58］利用γ射線法降低了軟木塞中TCA的含量，試驗證明，當γ射線強度為100 kGy時，軟木塞中的TCA減少量為97.9%，對軟木塞中TCA的去除效果明顯，且不會破壞軟木塞；Vlachos P等［59］通過溶膠-凝膠法，以0.7 g Triton X-100［聚氧乙烯-（10）異辛基苯基醚］為表面活性劑，加入3.8mL乙醇、0.68mL冰醋酸和0.36mL異丙醇鈦，然后劇烈攪拌，制得二氧化鈦薄膜，把TCA加入到薄膜中，通過使用低強度黑光管發(fā)射的近UV光對其進行光解，對比臭氧和H2O2對TCA的去除效率，實驗結果表明，以二氧化鈦薄膜加以UV光對TCA進行光解的降解速率常數(shù)為0.084r/min，高于臭氧和H2O2對TCA的降解速率常數(shù)，是降低軟木塞中TCA含量的有效方法。

5結論與展望

TCA檢測新技術的開發(fā)重點正在向快速、高精準度、高靈敏性和低檢出限發(fā)展，這些新技術推動著TCA檢測標準向高專業(yè)性和高標準化發(fā)展。隨著人們對TCA污染問題的關注，對TCA檢測的新方法、新設備和新技術的開發(fā)與利用，將成為科研工作者研究的熱點課題，并會隨之產(chǎn)生很多新成績。但是，在目前的研究手段和方法下，我們也不得不承認，由于TCA低閾值的特點，集快速、高靈敏性、低檢測限和經(jīng)濟實用于一體的TCA萃取和檢測技術的開發(fā)研究對任何科研工作者來說仍然還是一個挑戰(zhàn)，這也會吸引大量的科研工作者為之努力。

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Research Progress in New Detection Technology of 2，4，6-Trichloroanisole in Grape Wine

ZHOU Lihua1，MOU Dehua1and LI Yan1，2
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018；2.Hebei Provincial R&D Center for Fermentation Engineering，Shijiazhuang，Hebei 050018，China）

Abstract:2，4，6-trichloroanisole（TCA）is a substance harmful to wine sensory quality.It usually comes from wine corks，and possibly comes from grape or wine-making process contamination.Its existence results in bad odor and bad taste in wine.In this paper，the new methods and instruments for the detection of TCA in wine in recent years were introduced including the extraction technology and detection technology of TCA in wine.And the characteristics，principles and application advantages of these new technologies were elaborated for the purpose of providing useful reference for achieving high-precision，low-detection-limit and high-sensitivity qualitative and quantitative determination of TCA in wine，further monitoring TCAin wine，and ultimately improving wine quality.

Key words:2，4，6-trichloroanisole（TCA）；wine；extraction；detection；new technology

中圖分類號：TS262.6；TS261.4；TS261.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）06-0108-09

DOI：10.13746/j.njkj.2016016

基金項目：河北省食品藥品監(jiān)督管理局2015年度食品藥品安全科技項目資助；項目名稱：葡萄酒中氯苯甲醚類物質(zhì)監(jiān)控技術研究；項目編號：ZD2015014。

收稿日期：2016-01-19

作者簡介：周立華（1988-），男，發(fā)酵工程專業(yè)，在讀碩士研究生。

通訊作者：李艷（1958-），女，教授，河北省發(fā)酵工程重點學科學術帶頭人，河北省發(fā)酵工程技術研究中心學術帶頭人，研究方向：傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術研究、葡萄酒和果酒釀造。