●路則寶

現(xiàn)代生物技術(shù)和化學(xué)分析技術(shù)在篩選藥用微生物資源中的應(yīng)用

●路則寶

藥用微生物主要包括放線菌、真菌和細(xì)菌等, 是一類(lèi)可持續(xù)發(fā)展利用的天然資源。以現(xiàn)代生物技術(shù) 和化學(xué)分析技術(shù)為核心的現(xiàn)代高技術(shù)在藥用微生物資源的研究開(kāi)發(fā)領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用,各種“組學(xué)”研究技術(shù)、基因工程以及生物轉(zhuǎn)化等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于藥用微生物資源的篩選。本文就各種現(xiàn)代生物技術(shù)和化學(xué)分析技術(shù)在藥用微生物資源篩選中的應(yīng)用情況, 進(jìn)行了綜述并就其研究前景進(jìn)行了初步的分析和預(yù)測(cè)。

藥用微生物；生物技術(shù)；化學(xué)分析技術(shù)；篩選

人類(lèi)對(duì)藥用微生物的研究開(kāi)發(fā)和利用已經(jīng)持續(xù)了半個(gè)多世紀(jì),而且新發(fā)現(xiàn)的藥用微生物及其活性化合物的數(shù)量仍在穩(wěn)步增長(zhǎng)。藥用微生物主要包括放線菌，真菌和細(xì)菌，其中從放線菌中所發(fā)現(xiàn)的活性化合物最多(約占70%)，其次分別為真菌(約占20%)和細(xì)菌(約占10%)。早期研究的放線菌絕大多數(shù)為鏈霉菌, 隨著對(duì)微生物資源研究和利用的不斷深入，人們對(duì)許多過(guò)去不常見(jiàn)的稀有放線菌、真菌也表現(xiàn)出了很大的興趣并從中發(fā)現(xiàn)了許多新結(jié)構(gòu)的活性化合物[1]。微生物作為一類(lèi)重要的天然藥用資源，曾經(jīng)為人類(lèi)的健康做出了巨大的貢獻(xiàn)，近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和化學(xué)分析技術(shù)的飛速發(fā)展，人們?cè)O(shè)計(jì)了許多特異性的針對(duì)各種微生物的藥用微生物篩選模型，使得從微生物中篩選新的藥用微生物資源的研究又迎來(lái)了一個(gè)新的春天[2]。

1 現(xiàn)代生物技術(shù)在海洋藥用微生物資源篩選中的應(yīng)用

目前，對(duì)海洋微生物研究的焦點(diǎn)集中在極端微生物和共附生微生物的研究方面?，F(xiàn)代生物技術(shù)在海洋微生物研究領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在利用各種分子標(biāo)記技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)( FISH)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析手段等開(kāi)展海洋微生物種質(zhì)資源的鑒定以及利用宏基因組(Metagenomics)研究技術(shù)開(kāi)展活性代謝產(chǎn)物的研究。宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)與細(xì)菌人工染色體技術(shù)的發(fā)展以及環(huán)境難培養(yǎng)微生物研究的需要有關(guān),是目前解決海洋難培養(yǎng)微生物天然活性成分的研究以及“藥源”問(wèn)題的一個(gè)重要途徑。大量的研究顯示：生物體內(nèi)與某一代謝途徑相關(guān)的功能基因往往以串聯(lián)的形式排列在一起形成基因簇,利用一些限制性內(nèi)切酶或通過(guò)超聲等物理方法將環(huán)境中的微生物(如難以培養(yǎng)的微生物或難以分離單菌落的微生物群落等)的遺傳物質(zhì)DNA切成大小合適的DNA片段,并將它們連接到合適的載體上,然后轉(zhuǎn)化到一些可培養(yǎng)的細(xì)菌(如:大腸桿菌、鏈霉菌或假單胞菌等)中,根據(jù)獲得的功能進(jìn)行篩選。宏基因組研究技術(shù)不僅有助于新化合物的發(fā)現(xiàn)和解決活性產(chǎn)物的生產(chǎn)問(wèn)題,同時(shí),也將有助于我們對(duì)一些重要功能基因的認(rèn)識(shí)[3,4]。

2 現(xiàn)代生物技術(shù)在自然界中難分離培養(yǎng)微生物的分離和應(yīng)用

由于在藥用微生物的篩選過(guò)程中，長(zhǎng)期使用傳統(tǒng)的菌種分離和鑒定技術(shù)，結(jié)果導(dǎo)致大量缺乏明確鑒定的分離菌株被重復(fù)分離和使用，嚴(yán)重地影響著新的生物活性物質(zhì)的篩選效率。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家為提高藥用微生物的篩選效率，在利用人功能基因組和微生物基因組研究的成果改進(jìn)或設(shè)計(jì)新的篩選系統(tǒng)的同時(shí)，正在開(kāi)展從自然生態(tài)環(huán)境中選擇性分離藥用微生物的分離技術(shù)研究。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外有些實(shí)驗(yàn)室采用在分離培養(yǎng)基中添加自然來(lái)源的抽提液,或加入一些特殊化合物,使其中處于Viable but non-culturable(VBNC)狀態(tài)的微生物恢復(fù)其生長(zhǎng)繁殖能力,從而得到分離。

近年來(lái)，直接從環(huán)境樣品中提取混合微生物總基因組DNA，利用可培養(yǎng)的宿主細(xì)菌構(gòu)建宏基因文庫(kù)，通過(guò)篩選目的克隆，尋找活性代謝產(chǎn)物，取得矚目進(jìn)展。這種避開(kāi)了傳統(tǒng)的微生物的分離培養(yǎng)，采用了直接開(kāi)發(fā)環(huán)境微生物功能基因的方法，能夠最大限度的開(kāi)發(fā)利用未培養(yǎng)或非可培養(yǎng)微生物的功能基因，直至獲得這些基因的表達(dá)生產(chǎn)的次級(jí)代謝活性產(chǎn)物。該領(lǐng)域的迄今研究結(jié)果表明，自然界中非可培養(yǎng)微生物作為巨大基因文庫(kù)是可以發(fā)掘利用的寶貴資源，通過(guò)基因工程手段從中尋找新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物是可行的[5]。

3 化學(xué)分析技術(shù)在篩選藥用微生物資源中的應(yīng)用

近年來(lái)應(yīng)用于藥用微生物資源篩選的化學(xué)分析技術(shù)主要有：滴定分析、氧化還原滴定法、重量分析法、和沉淀滴定法、分光光度法、原子吸收分光光度法、原子發(fā)射分光光度法、X射線熒光光譜分析、電位分析等技術(shù)。而且相信新的化學(xué)分析技術(shù)還將不斷應(yīng)用于篩選藥用微生物資源

4 現(xiàn)代生物技術(shù)和化學(xué)分析技術(shù)在篩選藥用微生物資源中的研究展望

綜合上述分析,可以看出,目前生物技術(shù)和化學(xué)分析技術(shù)在藥用微生物資源開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用主要集中在藥用微生物的分類(lèi)、鑒定、微生物的培養(yǎng)、天然活性成分的分離純化和生產(chǎn)以及重要功能基因和蛋白質(zhì)的研究方面,并分別在上述領(lǐng)域內(nèi)取得了一定的進(jìn)展。但是,藥用微生物資源的開(kāi)發(fā)畢竟是一個(gè)系統(tǒng)工程,利用各種現(xiàn)代生物技術(shù)的組裝和集成對(duì)藥用微生物資源進(jìn)行合理利用以實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展已成為國(guó)際社會(huì)的共識(shí)。大量的研究已證明天然活性成分的產(chǎn)生和蓄積并不是孤立的事件,它們?cè)诤艽蟪潭壬鲜艿江h(huán)境因素的影響,為提高藥物篩選和研制的效率,有必要整合藥用微生物的基因、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物以及環(huán)境因子的相關(guān)研究數(shù)據(jù),為新化合物的篩選以及化合物新活性的研究提供理論指導(dǎo)。

（作者單位：楚雄醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校）

[1]姜成林, 徐麗華編.微生物資源開(kāi)發(fā)利用[M].北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社,2001.

[2]張華等.藥用微生物資源[J].微生物學(xué)通報(bào),2004,31(2):152-153.

[3]葉波平等.現(xiàn)代生物技術(shù)在海洋藥用生物資源開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用[J].中國(guó)天然藥物,2006,1(4):5-9.

[4]Schirmer A , Gadkari R , Reeves CD , etal . Metagenomic Analysis Reveals Diverse Polyketide Synthase Gene Clusters in Microorganisms Associated with the Marine Sponge Discodermia dissoluta [J] . Appl Environ Microbiol , 2005 ,71 :4840-4849。

[5]許曉妍等.宏基因技術(shù)在開(kāi)拓天然產(chǎn)物新資源中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2005,32(1):108-102.

路則寶(1980～)，男,碩士研究生,講師，研究方向?yàn)槲⑸锱c免疫學(xué)。

資助課題：云南省教育廳科學(xué)研究基金指導(dǎo)性項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2017ZDX003。