異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)和海

塔依爾?吐爾松 買吾拉尼江?依孜布拉 買地尼也提?尼亞孜 等

摘要：目的 觀察異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶、海馬CA1區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響，探討其作用機(jī)制。方法 選取3月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠并將其隨機(jī)分為模型組、陽性藥組和異常黏液質(zhì)成熟劑高、中、低劑量組，每組18只。另取18只3月齡C57BL/6J小鼠作為正常組。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)6個(gè)月。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力；HE染色光鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理形態(tài)；透射電鏡觀察小鼠海馬CA1區(qū)有髓神經(jīng)髓鞘、微管、微絲。結(jié)果 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠逃避潛伏期時(shí)間較正常組明顯延長(zhǎng)（P<0.01），空間搜索實(shí)驗(yàn)穿越原平臺(tái)位置次數(shù)較正常組明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，異常黏液質(zhì)成熟劑除低劑量組第1日外其余各劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05，P<0.01），異常黏液質(zhì)成熟劑低、高劑量組小鼠經(jīng)過有效區(qū)域次數(shù)明顯增加（P<0.05，P<0.01），異常黏液質(zhì)成熟劑各劑量組小鼠原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯增加（P<0.01）。HE染色顯示，異常黏液質(zhì)成熟劑各組小鼠腦組織海馬CA1區(qū)，錐體細(xì)胞層完整性稍好，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，均勻分布；電鏡觀察，與模型組比較，異常黏液質(zhì)成熟劑各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元核形不規(guī)則，核膜清楚，染色質(zhì)清晰，核仁明顯，細(xì)胞基質(zhì)均勻，細(xì)胞器豐富，分布均勻，線粒體嵴明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體多見。結(jié)論 異常黏液質(zhì)成熟劑顆?？筛纳艫PP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，減輕神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)受損。

關(guān)鍵詞：異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型；空間學(xué)習(xí)記憶；海馬CA1區(qū)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.011

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）04-0041-04

Effects of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules on Behavioristics and Hippocampus Pathomorphism of APP/PS1 Transgenic Mice TURSUN Tayerjan1， HIZBULLA Mawlanjan1， NIYAZI Maidiniyeti2， SHAWUTI Shadike3， AMAT Nurmuhammat1 （1. Uygur Medical School， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 2. First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 3. Affiliated Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules on spatial learning and memory， histopathology morphological change in hippocampus CA1 zone； To discuss its mechanism of action. Methods Three-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into 5 groups： model control group， positive control （donepezil 0.92 mg/kg） group， Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， and low-dose groups （3， 2， 1.5 g/kg）， 18 mice in each group. Another 18 three-month-old C57BL/ 6J mice were chosen as normal control group. All administration groups received relevant medicine for successive 6 months. Then the changes in learning and memory ability of mice were detected by Morris water maze test； pathomorphism in hippocampus CA1 zone was detected by HE staining method； changes of myelin sheath， microtubule， and

基金項(xiàng)目：教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃（NCET-11-1073）

通訊作者：努爾買買提·艾買提，E-mail：Oglan1972@126.com

microfilament in myelinated nerve of hippocampus CA1 zone were detected by electron microscope. Results Morris water maze test results showed that escape incubation period of APP/PS1 transgenic mice was significantly longer than the normal control group （P<0.01）， and the original platform time was significantly shorter than normal control group （P<0.01）； compared with model control group， Abnormal Phlegmatic Temperament Granules treatment groups escape latency time was significantly reduced （P<0.05， P<0.01）. Space experiments and escape incubation period of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， low-dose groups were significantly shortened （P<0.05， P<0.01）， and spatial searching test showed that the times of mice in Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， low-dose groups passing through effective area increased （P<0.01）. The integrity of HE staining pyramidal cell layer in the hippocampus CA1 zones of Abnormal Phlegmatic Temperament Granules high-， medium-， and low-dose groups was relatively good； cells arranged orderly； distribution was normal. Electron microscopic observation showed that compared with model control group， the hippocampus neurons nuclear had irregular shape； nuclear membrane was clear and complete； chromatin was clear； nucleolus was obvious； cell matrix was uniform； organelles were abundant； mitochondrial cristae was obvious； endoplasmic reticulum and free ribosomes were obvious. Conclusion Abnormal Phlegmatic Temperament Granules can improve spatial learning and memory in APP/PS1 mice， alleviate neuronal ultrastructure damage and ultimately improve cognitive function.

Key words： Abnormal Phlegmatic Temperament Granules； APP/PS1 double transgenic mice model； spatial learning and memory； hippocampus CA1 zone

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），是以記憶力喪失、認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)退行性障礙疾病。近年來，AD的患病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，加之晚期AD患者常伴有嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙和精神異常癥狀，由此帶來的社會(huì)、家庭、經(jīng)濟(jì)及公共衛(wèi)生問題將會(huì)越來越嚴(yán)重。AD屬維醫(yī)中異常體液導(dǎo)致的“失憶”“失眠”“愚蠢”“遺忘”等范疇。在早期的輕度認(rèn)知功能障礙期，異常黏液質(zhì)在臨床表現(xiàn)中占主要的地位[1]。臨床上異常黏液質(zhì)成熟劑對(duì)AD早期療效較好。本實(shí)驗(yàn)觀察該藥對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠90只，雄性，3月齡，體質(zhì)量23～27 g；SPF級(jí)C57BL/6J小鼠18只，雄性，3月齡，體質(zhì)量23～27 g；北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2009-0004。小鼠飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)。

1.2 藥物

異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒由新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院提供；鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號(hào)061653928914，使用前粉碎，用蒸餾水溶解。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅染液、4%多聚甲醛、50%戊二醛和白色素，南京建成生物有限公司。MT-200Morris視頻分析和跟蹤系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），100 ℃水浴鍋（常州國華電器有限公司），BS-1105型電子天平（北京賽多克斯天平有限公司），CX-3雙目顯微鏡（日本OLYMPUS公司），DM300圖像采集系統(tǒng)（德國Laica公司），1230透射電鏡（日本JEOL公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥

將90只轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、異常黏液質(zhì)成熟劑高、中、低劑量組和陽性藥組，每組18只；同時(shí)以18只同月齡C57BL/6J小鼠作為正常組。依據(jù)異常黏液質(zhì)成熟劑的臨床應(yīng)用劑量換算成小鼠給藥劑量，即異常黏液質(zhì)成熟劑低、中、高劑量組分別按1.5、2、3 g/（kg·d）灌胃異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒，陽性藥組予0.92 mg/（kg·d）多奈哌齊灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積1 g/0.1 mL。各組小鼠給藥6個(gè)月后，做行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)階段所有小鼠均正常飲食、飲水，每日1次。

2.2 行為學(xué)檢測(cè)

水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)持續(xù)4 d，記錄每只小鼠60 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，每日4次，不同象限入池，當(dāng)小鼠上到平臺(tái)后終止5 s記錄，休息10～20 min后進(jìn)行第2次實(shí)驗(yàn)?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)記錄小鼠60 s內(nèi)停留于原始平臺(tái)位置的時(shí)間，觀察并記錄小鼠通過原始平臺(tái)位置的次數(shù)[2]。

2.3 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后快速脫頸處死小鼠并取腦組織，貼上標(biāo)記，投入含20%蔗糖多聚甲醛固定液后固定24 h以上。室溫下切片，經(jīng)二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ10 min→無水乙醇→95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ→80%乙醇，水洗，蘇木素染10 min，鹽酸乙醇分化，水沖洗回藍(lán)，伊紅染5 min后水洗，再由低至高乙醇脫水，封片，光鏡下觀察海馬CAl區(qū)病理形態(tài)。

2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)

取海馬CA1區(qū)腦組織，切成1 mm3，放入4%戊二醛固定液內(nèi)固定2 h，PBS沖洗10 min×3次→1%鋨酸固定2 h→PBS沖洗10 min×3次→脫水→包埋，制成超薄切片，染色后透射電鏡觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

定位航行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈筇颖軡摲跁r(shí)間較正常組明顯延長(zhǎng)（P<0.01），異常黏液質(zhì)成熟劑除低劑量組第1日外其余各劑量組小鼠逃避潛伏期時(shí)間較模型組明顯縮短（P<0.05，P<0.01）；空間搜索實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)較正常組明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，異常黏液質(zhì)成熟劑低、高劑量組小鼠經(jīng)過有效區(qū)域次數(shù)明顯增加（P<0.05，P<0.01），異常黏液質(zhì)成熟劑各劑量組原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯增加（P<0.01）。結(jié)果見表1、表2。

4.2 異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

光鏡觀察正常組小鼠HE染色錐體細(xì)胞核排列整齊，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，分布均勻，數(shù)量較多，核異染色質(zhì)少，顏色淺，胞體胞漿淡藍(lán)色，細(xì)胞核核仁大而清楚，胞質(zhì)豐富，無核固縮或溶解現(xiàn)象，核膜清晰，可見少量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但無膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況；模型組小鼠HE染色可見神經(jīng)元數(shù)目減少、變性、壞死，錐體細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞縮小，核固縮，形態(tài)無規(guī)則，膠質(zhì)細(xì)胞增生；陽性藥組小鼠HE染色錐體細(xì)胞核排列整齊緊密，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量較多，形態(tài)正常，分布均勻，核異染色質(zhì)少，顏色淺，胞體胞漿淡藍(lán)色，胞質(zhì)豐富，無核固縮或溶解；異常黏液質(zhì)成熟劑低劑量組小鼠HE染色仍見錐體細(xì)胞帶紊亂、變細(xì)，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間隙大，與模型組比較有所改善；異常黏液質(zhì)成熟劑中劑量組小鼠HE染色可見少量分散的神經(jīng)元凋亡細(xì)胞，神經(jīng)元數(shù)量增多，錐體細(xì)胞紊亂減少，細(xì)胞體積增大、核固縮減輕；異常黏液質(zhì)成熟劑高劑量組小鼠HE染色見細(xì)胞排列整齊，錐體細(xì)胞層較完整，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)緊密，分布均勻，胞體胞漿淡藍(lán)色，細(xì)胞核大而清楚，胞質(zhì)豐富，可見少量的神經(jīng)元固縮狀壞死，核膜清晰，可見少量的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但無膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況。結(jié)果見圖1。

4.3 異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織海馬CA1區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察正常組小鼠海馬神經(jīng)元核圓形，核膜完整清晰，染色質(zhì)清晰，核仁明顯，細(xì)胞基質(zhì)密度均勻，細(xì)胞器豐富，均勻分布，線粒體嵴清晰可見，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離的核糖體；模型組小鼠神經(jīng)核形狀不規(guī)則，可見異染色質(zhì)和核仁邊集，細(xì)胞基質(zhì)密度稍微降低，部分線粒體微腫脹、線粒體基質(zhì)密度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；陽性藥組小鼠海馬神經(jīng)元核圓形，核膜清楚完整，染色質(zhì)細(xì)膩，部分神經(jīng)元細(xì)胞核形不規(guī)則；細(xì)胞基質(zhì)密度均勻一致，細(xì)胞器豐富，均勻分布，線粒體嵴清晰可見，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離的核糖體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稍擴(kuò)張；異常黏液質(zhì)成熟劑低劑量組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞核形狀極不規(guī)則，異染色多，細(xì)胞基質(zhì)密度略降低，個(gè)別線粒體輕微腫脹、空泡變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；異常黏液質(zhì)成熟劑中劑量組小鼠海馬神經(jīng)元核圓形，核膜清楚完整，染色質(zhì)細(xì)膩，核仁明顯，細(xì)胞基質(zhì)密度均勻一致，細(xì)胞器豐富，均勻分布，線粒體形態(tài)基本正常，游離核糖體多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略擴(kuò)張，細(xì)胞可見少量脂褐素；異常黏液質(zhì)成熟劑高劑量組小鼠海馬神經(jīng)元核形不規(guī)則，核膜完整清晰，染色質(zhì)清晰，核仁明顯；細(xì)胞基質(zhì)密度均勻，細(xì)胞器豐富，均勻分布，線粒體嵴清晰可見，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離的核糖體。結(jié)果見圖2。

5 討論

AD是一種與年齡相關(guān)、不可逆的神經(jīng)退行性疾病，以漸進(jìn)和永久失去學(xué)習(xí)記憶能力為主要特點(diǎn)，最初呈現(xiàn)輕度認(rèn)知功能障礙，逐漸發(fā)展到嚴(yán)重的記憶功能缺損[3]，疾病后期常常出現(xiàn)抑郁、焦慮和易怒等異常精神癥狀[4]，其病因包括APP、PS1基因的突變[5]。AD引起的神經(jīng)元損害已經(jīng)被認(rèn)可是一種重要的病理特征，在研究和開發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠的過程中起重要的作用[6]。

治療AD的常用西藥有膽堿酯酶抑制劑、抗Aβ治療的分泌酶抑制劑、非甾體類抗炎藥、神經(jīng)營養(yǎng)因子類藥物等，但這些藥物尚無任何一種可完全有效治療AD。維醫(yī)認(rèn)為，大腦是濕寒性臟器，黏液質(zhì)屬性也是濕寒，其中澀味黏液質(zhì)是黏液之中混入黑膽質(zhì)的異常體液，分量重、質(zhì)地稠，作為大腦病理產(chǎn)物在大腦中沉淀，從不同途徑和（或）不同程度上損傷神經(jīng)組織，影響正常細(xì)胞生理功能，易于形成神經(jīng)阻滯，進(jìn)而引起相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙和AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。異常黏液質(zhì)成熟劑具有成熟異常黏液質(zhì)、消炎解毒等功效。該藥藥性干熱，成熟異常黏液質(zhì)體液，糾正由異常黏液質(zhì)導(dǎo)致的人體機(jī)能的異常狀態(tài)，以維持人體體液的相對(duì)平衡。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，通過異常黏液質(zhì)成熟顆粒治療后，定位航行實(shí)驗(yàn)小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過有效區(qū)域次數(shù)增加，提示異常黏液質(zhì)成熟劑顆粒可有效地改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。病理觀察結(jié)果顯示，異常黏液質(zhì)成熟劑顆?？筛纳平M織結(jié)構(gòu)受損的腦神經(jīng)細(xì)胞，減少細(xì)胞損傷，降低神經(jīng)纖維纏結(jié)的程度和老年斑的形成，減輕神經(jīng)元細(xì)胞的受損，減輕粗面內(nèi)網(wǎng)和游離核糖體的損傷。提示異常黏液質(zhì)成熟劑能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元線粒體、突觸的結(jié)構(gòu)損傷。

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