譚國浩 譚翰清

實時熒光PCR在食源性致病菌食物中毒應急處置中的應用

譚國浩 譚翰清

目的探討實時熒光PCR在食源性致病菌食物中毒快速應急檢測中的應用價值。方法對一起食物中毒進行流行病學調(diào)查，采集患者、相關(guān)食品、廚房工作人員和廚具拭子等標本，對前增菌液進行食源性致病菌實時熒光PCR快速篩查，同步進行分離培養(yǎng)。結(jié)果該事件39名聚餐人員中共有22人發(fā)病，罹病率達59.5%，對采集的36份標本進行實時熒光PCR和分離培養(yǎng)，其中8份患者標本和3份食品標本副溶血性弧菌實時熒光PCR陽性，并相應分離出11株血清型為O3∶K6的副溶血性弧菌。結(jié)論本次食物中毒是由冰鮮海魚中的副溶血性弧菌污染熟食品而引起的，實時熒光PCR快速、特異、靈敏，可為食物中毒快速處置提供依據(jù)。

副溶血性弧菌;食物中毒;實時熒光PCR

副溶血性弧菌、沙門氏菌是主要的食源性致病菌［1］，可引起食物中毒，常規(guī)檢測方法經(jīng)過増菌、分離、生化試驗、血清學反應等過程，操作繁瑣，檢測周期長，約5～7天，不利于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應急處置。快速、特異、靈敏的實時熒光PCR技術(shù)在病原微生物檢測中應用廣泛［2-4］。本研究探討實時熒光PCR技術(shù)在一起食源性致病菌引起的食物中毒中的快速檢測應用效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與培養(yǎng)試劑

實時熒光PCR儀(LighCycler1.5)、核酸提取儀(西安天隆NP-960)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械一廠)等;胰大豆蛋白胨肉湯、緩沖蛋白胨肉湯、GN肉湯、3%NaCl堿性蛋白胨肉湯、堿性蛋白胨肉湯、7.5%NaCl肉湯、李斯特氏菌增菌液、B-P瓊脂平板、血平板、HE平板、TCBS平板、血漿凝固酶試劑盒、腸桿菌生化鑒定試劑盒、弧菌生化鑒定試劑盒等増菌、分離、生化鑒定試劑均由廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實時熒光PCR檢測試劑

磁珠法DNA/RNA快速提取試劑盒(廣州華銀醫(yī)藥科技有限公司);常見的食源性致病菌實時熒光PCR檢測試劑盒包括了:金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單核增生李斯特氏菌、腸出血性大腸O157∶H7(深圳生科源生物技術(shù)有限公司)。

1.3 樣本采集與前處理

食物中毒應急隊員到現(xiàn)場開展流行病和衛(wèi)生學調(diào)查，追蹤病例和個案調(diào)查。根據(jù)現(xiàn)場調(diào)查情況，用無菌棉簽采集患者和廚房工作人員肛拭子、環(huán)境拭子，放置5mL TSB保存液，無菌瓶或樣本袋子采集可疑引起食物中毒的留樣食品，并在2 h內(nèi)迅速送回實驗室。檢驗人員收到樣本后，立即開展樣本的前增菌實驗，37℃溫箱培養(yǎng)6～8 h。

1.4 DNA提取與實時熒光PCR檢測

取前增菌后的樣本200 μL，采用DNA/RNA快速提取試劑盒(磁珠法)提取核酸DNA，在NP-960核酸提取儀上進行，30min可完成提取。按照實時熒光PCR檢測試劑盒說明書，分別配制沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌等常見食源性致病菌實時熒光PCR反應體系，在實時熒光PCR儀上設(shè)置循環(huán)條件如下:95℃預變性2min;95℃變性10 s、60℃延伸40 s(收集熒光)，40個循環(huán)。

1.5 傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)

按照食品安全國家標準及現(xiàn)行有效的微生物檢驗技術(shù)規(guī)范和相關(guān)傳染病診斷標準進行食源性致病菌分離鑒定，對實時熒光PCR陽性的標本進行重點分離，鑒定結(jié)果與實時熒光PCR方法比較。

2 結(jié)果

2.1 流行病和衛(wèi)生學調(diào)查概括

本次食物中毒集中發(fā)生在某公司在該酒家進行聚餐的39名員工中，餐后22人相繼發(fā)病，以腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱為主，罹病率達59.5%，潛伏期最短1.5 h，最長25 h，平均潛伏期約12 h。個案調(diào)查發(fā)現(xiàn)，15名發(fā)病的員工均進食了聚餐的各類食物，2名無發(fā)病的員工沒有進食或很少進食餐前小吃、鹵水拼盤、扣肉和魚食物。該餐前的所有餐次，員工各自在家進餐，其家屬未見發(fā)病，且聚餐前均無另外進食。對酒家廚房的衛(wèi)生學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，熟食間冰箱內(nèi)有冰鮮海魚、生鮮雞肉與鹵熟食物混放。

根據(jù)現(xiàn)場調(diào)查情況，采集了患者肛拭13份、酒家廚房工作人員肛拭5份、手拭1份，廚房用具容器和工作臺物表涂抹5份、相關(guān)食物12份(咸香雞腳、鹵大腸、熟食間冰鮮海魚、麻油、豉油、鹵牛展、鹵掌翼、鹵鴨掌、鹵鴨頭、芫茜蔥、潮式富貴拼、白切雞)。

2.2 實時熒光PCR結(jié)果

所采集的標本經(jīng)TSB溫箱培養(yǎng)6 h后，進行常見的食源性致病菌實時熒光PCR檢測，包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、大腸桿菌O157、副溶性血弧菌。結(jié)果顯示，36份標本中有11份副溶血性弧菌核酸擴增陽性，其中包括8份患者樣本和3份食品標本(圖1、圖2)，食品樣本分別為冰鮮海魚、咸香雞腳、鹵大腸，其它食源性致病菌實時熒光PCR檢測結(jié)果均為陰性。

圖1 患者標本副溶血性弧菌實時熒光PCR擴增結(jié)果圖

圖2 食物標本副溶血性弧菌實時熒光PC擴增結(jié)果圖

2.3 傳統(tǒng)細菌分離鑒定結(jié)果

同時按現(xiàn)行有效的微生物檢驗技術(shù)規(guī)范和相關(guān)傳染病診斷標準進行食源性致病菌分離鑒定，檢測項目包括了沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、蠟樣芽胞桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌。重點分離實時熒光PCR陽性的標本，以副溶血性弧菌為重點目標，按食品安全標準進行副溶血性弧菌分離、生化反應、血清學試驗。結(jié)果，從實時熒光PCR陽性的8份患者樣本和3份食品標本中檢出生物學特性一致的副溶血性弧菌，血清型為O3∶K6，其中食物標本為咸香雞腳、鹵大腸、熟食間冰鮮海魚。副溶血性弧菌實時熒光PCR檢測結(jié)果陰性的標本均未分離出副溶血性弧菌，兩種方法檢測結(jié)果完全一致，其分布情況見表1。

表1 兩種檢測方法在各類標本中對副溶血性弧菌的結(jié)果分布

2.4 食物中毒結(jié)果判定

根據(jù)現(xiàn)場流行病學調(diào)查、結(jié)合臨床表現(xiàn)以及實驗室檢驗結(jié)果進行綜合分析，依據(jù)《食物中毒診斷標準及技術(shù)處理總則》［5］、《副溶血弧菌食物中毒診斷及處理原則》［6］可判定本次疫情為一起副溶血性弧菌污染食物引起的食物中毒。實時熒光PCR檢測結(jié)果為疫情早期快速處置提供了依據(jù)，也為后續(xù)分離培養(yǎng)工作指明方向，提高疾病預防控制工作效率。

3 討論

近年來，我國食品安全問題依然形勢嚴峻，食源性致病菌污染為引起食物中毒的主要原因，集體食堂、家庭和飲食服務單位是中毒的高發(fā)場所。副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus，VP)是一種嗜鹽性細菌，屬弧菌科(Vibrio)弧菌屬，主要存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚類、蝦類、貝類、牡蠣等海產(chǎn)品中，人們多因食用被本菌污染而又未煮熟的海產(chǎn)品而引起腹瀉癥狀，在細菌性食物中毒中所占比例高，我國每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的報道，發(fā)病率呈上升趨勢［7-8］。往年主要集中發(fā)生在沿海地區(qū)，但隨著海鮮市場經(jīng)貿(mào)往來、區(qū)域一體化、物流的發(fā)展，使得該類食物中毒在全國范圍內(nèi)均可發(fā)生。而引起副溶血性弧菌聚集性食物中毒的主要原因多為餐飲廚房衛(wèi)生管理混亂，生熟食物混放而交叉感染，夏季溫度升高，細菌更容易繁殖。在本次食物中毒中，引發(fā)中毒的原因是酒家食品安全衛(wèi)生管理不規(guī)范，冰鮮海魚與熟食混放，其所含有的副溶血性弧菌間接污染了熟食，某公司22名員工共同進食了受污染的食物而引發(fā)了此次食物中毒。

細菌性食物中毒常規(guī)檢測方法經(jīng)過増菌、分離、生化試驗、血清學反應等過程，操作繁瑣，檢測周期長，約5～7天，而且引起食物中毒的細菌種類較多，每一個細菌都要開展分離所花費的時間特別長，耗費大量的人力和物力，不利用疫情的快速處置。實時熒光PCR技術(shù)具備快速、特異、靈敏、簡便等特點，可在數(shù)小時內(nèi)出初步的結(jié)果，指明了引發(fā)食物重點的罪魁禍首，因此，該技術(shù)在細菌性食物中毒快速檢測中被廣泛應用［9-11］。在本次食物中毒應急處置過程，應用實時熒光PCR技術(shù)對患者標本、可疑食品進行常見食源性致病菌進行快速篩選，結(jié)合傳統(tǒng)細菌分離鑒定技術(shù)，根據(jù)實時熒光PCR檢測結(jié)果，縮少了致病菌的范圍，集中有限的實驗室力量，對副溶血性弧菌核酸擴增陽性的標本開展細菌分離、培養(yǎng)、鑒定工作，使實驗人員可集中精力在種類繁多的標本中盡快地分離出引起食物中毒的病原菌，避免了其它細菌的干擾，提高工作效率，快速地為疫情控制處理提供科學準確的病原學依據(jù)。

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Study for the Application of Real-Time Fluorescence PCR in Emergency Disposal of Food Poisoning Caused by Food-Borne Pathogenic

TAN Guohao，TAN Hanqing

ObjectiveTo discuss the value of real-time fluorescence PCR applied in the rapid detection of food poisoning caused by food-borne pathogenic.MethodsAccording Field Epidemiology study for one case of food poisoning，samples were collected from patient，food，related waiter and cooking-tool，and tested by real-time PCR and conventional culture method，simultaneously.ResultsThe attack rate was59.5%for22 people got sick in39 people who had lunch together.Vbrio parahaemolyticus was detected in eight patient and three food-samples out of thirty-six samples by real-time fluorescence PCR and conventional culture method.The serotype of11 strains of vibrio parahaemolyticus was O3∶K6.Conclusion This case of food poisoning was caused by vibrio parahaemolyticus which contaminated from raw fish to cookedfood.The real-time fluorescence PCR was rapid，specific and sensitive，providing a basis for disposal of food poisoning.

Vibrio Parahaemolyticus;Food Poisoning;Real-Time Fluorescence PCR

Guangning County Center for Disease Prevention and Control，Guangning526300，China

R446.5;R155.3+1

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.12.023

譚國浩:廣寧縣疾病預防控制中心 廣東廣寧 526300

譚翰清:肇慶市疾病預防控制中心 廣東肇慶 526060

譚翰清