王全民，馬遙，劉麗鈞，朱軍，劉智

華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074

霍亂弧菌生物被膜發(fā)育與環(huán)境調(diào)控

王全民，馬遙，劉麗鈞，朱軍，劉智

華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074

生物被膜狀態(tài)的霍亂弧菌具有極強的環(huán)境適應(yīng)性和超高的感染性，生物被膜的發(fā)育調(diào)控研究對霍亂弧菌的宿主感染和環(huán)境適應(yīng)非常重要。本文綜述了近年來霍亂弧菌生物被膜研究結(jié)果，包括霍亂弧菌生物被膜的組成、發(fā)育和環(huán)境調(diào)控，尤其著重闡述了各種環(huán)境因子對霍亂弧菌生物被膜發(fā)育的影響，包括細(xì)菌自體信號分子、自然環(huán)境因子和宿主信號分子。

生物被膜，霍亂弧菌，環(huán)境因子

霍亂是人類歷史上一類嚴(yán)重的流行性傳染病，其典型癥狀是腹瀉和嘔吐，造成感染者大量失水甚至死亡?；魜y曾經(jīng)在世界范圍內(nèi)造成7次大流行[1]，至今霍亂依舊危害著人類的生命健康，據(jù)WHO資料，每年有300–500萬起病例報道，包括10–12萬例的致死病例[2]。霍亂弧菌包含O1血清型和非O1血清型兩類。O1血清型是造成霍亂流行的病原菌，根據(jù)臨床癥狀的差異和主要毒力因子調(diào)控的不同，又分為古典型和El Tor型[3]。古典型霍亂弧菌是前6次霍亂流行的病原菌，而El Tor型霍亂弧菌造成了第7次流行[1]。

自然生境中，霍亂弧菌主要存活于海水環(huán)境中，在富含幾丁質(zhì)的甲殼類水生生物體表形成生物被膜。生物被膜形式的霍亂弧菌能夠抵御各種逆境環(huán)境，包括氧脅迫、低溫、貧營養(yǎng)等，而且能夠有效抵御浮游生物的攝食。生物被膜在霍亂弧菌的感染過程中同樣起著重要作用，紗布簡單過濾能夠去除水體中99%的霍亂弧菌[4]，在孟加拉國農(nóng)村65個村莊，約133000人群中進(jìn)行的一項實驗表明，紗布過濾能使霍亂感染降低48%[5]。

自然生境中生物被膜內(nèi)的霍亂弧菌具有超感染性，發(fā)病感染劑量少至懸浮態(tài)細(xì)菌數(shù)量的1/10，乃至1/100[6]。霍亂弧菌一般是通過食道攝入方式進(jìn)入宿主體內(nèi)的，生物被膜能夠有效抵御宿主胃酸的侵襲，同時在感應(yīng)腸道信號時，能夠有效解離，釋放出的霍亂弧菌穿透小腸粘液層，最后定殖到腸道上皮細(xì)胞上[7]?；魜y弧菌在宿主腸道內(nèi)也可以形成生物被膜，這種體內(nèi)形成的生物被膜相對于懸浮態(tài)細(xì)菌而言，具有更強的感染性和環(huán)境適應(yīng)性[8]。

文中，我們對近年來霍亂弧菌生物被膜的組成和發(fā)育過程的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，主要討論環(huán)境因子對霍亂弧菌生物被膜發(fā)育的調(diào)控分子機理。這些環(huán)境因子包括微生物自身產(chǎn)生的小分子化合物、自然環(huán)境信號因子和宿主體內(nèi)存在的環(huán)境因子等。

1 霍亂弧菌生物被膜的化學(xué)構(gòu)成和相關(guān)合成基因

霍亂弧菌生物被膜主要構(gòu)成部分包括表面多糖(VPS)、基質(zhì)蛋白(Biofilm matrix protein)和胞外DNA(Extracellular DNA，eDNA)。霍亂弧菌生物被膜的50%以上組成部分是表面多糖，表面多糖對于生物被膜三維結(jié)構(gòu)的形成具有決定性的作用[9]。NMR解析霍亂弧菌表面多糖的部分化學(xué)結(jié)構(gòu)式是[→4)-α-L-GulpNAcAGly3OAc-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→4)-α-D-Galp-(1→]n，其中20%左右的α-D-Glc被替換為α-D-GlcNAc。表面多糖與一些結(jié)構(gòu)未知的物質(zhì)結(jié)合在一起，導(dǎo)致霍亂弧菌表面多糖呈現(xiàn)高粘度的特性[9]。負(fù)責(zé)合成 VPS的基因被分成兩個基因簇，其中12個基因定位于vps-1(vpsU，vpsA–K)，另外6個定位于vps-2(vpsL–Q)，vpsA和vpsL分別是兩個操縱子的第一個基因[10]?；魜y弧菌VPS合成主要受 VpsR調(diào)控，VpsR是細(xì)菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component signal transduction system，TCS)應(yīng)答調(diào)控家族成員，磷酸化修飾的VpsR能夠直接結(jié)合到vps基因簇的啟動子區(qū)域，正向調(diào)控vps基因的表達(dá)[11]?；魜y弧菌的VpsT蛋白屬于一類應(yīng)答調(diào)控蛋白，也能通過與vps基因啟動子區(qū)域結(jié)合，直接調(diào)控vps基因的表達(dá)[12-13]。VpsT對vps基因表達(dá)的調(diào)控活性需要結(jié)合c-di-GMP，但與蛋白質(zhì)磷酸化修飾無關(guān)[13]。vpsR和vpsT的操縱子區(qū)域嚴(yán)重重疊，導(dǎo)致這兩個蛋白彼此調(diào)控對方的基因表達(dá)[14]?；魜y弧菌群體感應(yīng)核心調(diào)控蛋白HapR能夠抑制vpsR和vpsT的表達(dá)[14]，同時還可以直接結(jié)合到vpsL基因調(diào)控序列上，抑制VPS的合成[15]?；魜y弧菌vpsT基因表達(dá)還受到毒力調(diào)控蛋白AphA和Sigma因子RpoS的正向調(diào)控，以及類組蛋白核苷結(jié)構(gòu)蛋白H-NS的負(fù)向調(diào)控[14,16-17]。H-NS蛋白是細(xì)菌體內(nèi)的一種豐度很高的蛋白，主要功能是調(diào)控核苷的構(gòu)象和附著在具有富含AT序列和高度彎曲構(gòu)象特點的啟動子上，抑制基因的表達(dá)。H-NS還能與vpsL和vpsA的啟動子區(qū)域結(jié)合，直接抑制生物被膜 VPS的合成[17]。我們的研究還表明，霍亂弧菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 VqmA能激發(fā) HapR和VqmR的表達(dá)，抑制生物膜的合成，vqmR位于vqmA上游，編碼小RNA(Small RNA)，能夠降解vpsTmRNA，從而抑制vpsT的表達(dá)[18-19]。

基質(zhì)蛋白包括 RbmA、RbmC、Bap1，它們的基因分布在兩個vps基因簇之間[20]，被認(rèn)為是生物被膜的骨架，粘合生物被膜中的組成部分，包括介質(zhì)表面、細(xì)菌菌體、VPS、eDNA等。晶體結(jié)構(gòu)顯示 RbmA蛋白有兩個Ⅲ型纖連蛋白(Fibronectin type Ⅲ)折疊位點，用于促進(jìn)生物被膜的凝聚以及招募細(xì)胞粘附到生物被膜中[21-22]。RbmA蛋白是在單層細(xì)胞粘附和 VPS產(chǎn)生之后開始累積在細(xì)胞表面，因此也被認(rèn)為對于維持液氣界面間薄膜狀生物被膜(Pellicle)的彈性和皺褶起著重要作用[23]。Bap1蛋白含有4個相互重疊的Vibrio-Colwellia-Bradyrhizobium-Shewanella(VCBS)重復(fù)結(jié)構(gòu)域，和4個FG-GAP結(jié)構(gòu)域，前者可能用于細(xì)胞之間的粘附，而后者推測用于識別和結(jié)合一些誘導(dǎo)物[24-25]。Bap1蛋白對于維持液氣界面間薄膜狀生物被膜(Pellicle)的機械張力非常重要，同時負(fù)責(zé)薄膜狀生物被膜的疏水特性[23]?；魜y弧菌的RbmC蛋白同樣含有4個VCBS結(jié)構(gòu)域，但只含有2個FG-GAP結(jié)構(gòu)域。RbmC蛋白還含有2個羧基端β-prism結(jié)構(gòu)域和2個未知功能的氨基端結(jié)構(gòu)域[26]，其中 β-prism結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為具有結(jié)合糖類物質(zhì)的特性[27]。

霍亂弧菌通過二型分泌系統(tǒng)(Type Ⅱsecretion system，T2S)負(fù)責(zé)上述3種基質(zhì)蛋白的分泌[28]，而它們在細(xì)胞表面的累積是依賴于VPS的存在[24]。基質(zhì)蛋白表達(dá)調(diào)控方面的研究較少，生物信息學(xué)分析表明，rbmA啟動子序列能夠被VpsR和VpsT結(jié)合，而rbmC和bap1的啟動子序列只有VpsR識別[12]。有文獻(xiàn)報道，霍亂弧菌的小RNA vrrA和rbmC基因的mRNA的5′端非翻譯區(qū)域相匹配，從而抑制rbmC的表達(dá)[29]。

胞外DNA(Extracelluar DNA，eDNA)被認(rèn)為能維持生物被膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但其與生物被膜中其他組分相互作用的精細(xì)分子機理尚待研究[30]。核酸酶 Dns和 Xds參與生物被膜中eDNA的降解，調(diào)控生物被膜的解離和脫落[30]。研究表明，霍亂弧菌能通過CytR蛋白抑制核苷的攝入和代謝，從而抑制生物被膜的發(fā)育[31]。

2 霍亂弧菌生物被膜的發(fā)育過程

霍亂弧菌生物被膜的發(fā)育過程，可以簡單分為3個過程：單層細(xì)胞粘附、微菌落形成和生物被膜成熟、生物被膜脫落。單層細(xì)胞粘附過程中，霍亂弧菌借助鞭毛在介質(zhì)表面游動，尋找合適的粘附位點，游動同時，霍亂弧菌的甘露糖敏感性凝聚素纖毛(Mannose-sensitivehaemagglutinin，MSHA pili)會與無機介質(zhì)發(fā)生粘附。MSHA纖毛與表面介質(zhì)之間粘附力增強，細(xì)菌運動方式由隨機漫游(Roaming)形式轉(zhuǎn)變?yōu)榫窒迏^(qū)域性運動(Orbiting)，最終完成粘附，進(jìn)入微菌落形成階段。霍亂弧菌還可以利用N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合蛋白GbpA(N-acetylglucosaminebinding protein)[32]，以及霍亂毒素共調(diào)控纖毛(Toxin coregulated pillus，TCP)[33]與宿主腸道內(nèi)的黏蛋白或宿主外骨骼上的幾丁質(zhì)層相結(jié)合。

微菌落形成過程中，鞭毛合成基因受到抑制，霍亂弧菌開始大量分泌表面多糖(Vibriopolysaccharide，VPS)，并在生物被膜成熟的整個過程持續(xù)分泌[34]。隨后，RbmA也開始在細(xì)胞表面累積，使細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞(Daughter cell)與親本細(xì)胞(Parental cell)互相粘附[14]?；|(zhì)蛋白 Bap1被分泌到在不同細(xì)胞之間的間隙中，并逐漸在臨近區(qū)域積累，因為Bap1蛋白在親本細(xì)胞(最初粘附在介質(zhì)表面的細(xì)胞)臨近的區(qū)域濃度最高，因此認(rèn)為Bap1負(fù)責(zé)生物被膜與介質(zhì)表面粘附，同時認(rèn)為親本細(xì)胞和它們的早期后代主要負(fù)責(zé)Bap1的合成[24]。隨著生物被膜的繼續(xù)發(fā)育和更多的細(xì)菌分裂繁殖，基質(zhì)蛋白 RbmC在細(xì)胞表面特定的位置分泌，RbmC和Bap1蛋白形成一個包裹細(xì)菌菌體的囊膜狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠隨著細(xì)菌細(xì)胞的分裂而生長變大[24]。除此之外，胞外DNA(Extracellular DNA，eDNA)[30]和外膜顆粒(Outer membrane vesicles，OMV)[35]等也參與生物被膜的構(gòu)成，這些物質(zhì)隨著細(xì)胞分裂逐漸累積，形成動態(tài)、柔韌、有序的粘液狀物理結(jié)構(gòu)，包裹著聚簇狀分布的細(xì)菌細(xì)胞，共同組成了霍亂弧菌的生物被膜成熟狀態(tài)[24]。

生物被膜發(fā)育的最后階段是生物被膜解離，霍亂弧菌細(xì)胞脫離生物被膜結(jié)構(gòu)，開始新一輪生命周期。胞外核酸酶 Dns和 Xds能夠通過降解eDNA調(diào)控生物被膜的解離[30]。rbmB基因負(fù)責(zé)編碼一個疑似多糖裂解酶，敲除rbmB能夠抑制霍亂弧菌生物被膜的生長，因此RbmB被認(rèn)為可能參與霍亂弧菌生物被膜解離和細(xì)菌的釋放過程，但該蛋白的酶學(xué)活性沒有得到試驗證實[36]?；魜y弧菌分泌的鋅依賴性金屬蛋白酶血凝集素/蛋白酶(Hemagglutinin HA/protease)HapA被稱作霍亂弧菌生物被膜的解離酶(Detachase)，HapA是一種黏蛋白酶(Mucinase)，能夠降解腸道粘液蛋白[37]，降解連接霍亂弧菌與粘液蛋白的GpbA粘附素蛋白[38]，以及霍亂弧菌生物被膜中的基質(zhì)蛋白RbmA[21]。

我們的研究結(jié)果表明，霍亂弧菌生物被膜中群體感應(yīng)信號分子 CAI-1的濃度比培養(yǎng)基中高10000倍以上，導(dǎo)致群體感應(yīng)主要效應(yīng)蛋白HapR的大量表達(dá)[39]，進(jìn)而除了激發(fā)hapA基因的表達(dá)外[40]，還減少胞內(nèi)c-di-GMP的濃度[41]，低濃度的c-di-GMP在霍亂弧菌中能通過激發(fā)鞭毛調(diào)控蛋白FlrA的活性而促進(jìn)鞭毛蛋白表達(dá)，同時降低VPS的分泌，減輕VPS對鞭毛的束縛，最終達(dá)到增強細(xì)菌運動能力，利于細(xì)菌脫離生物被膜的目的[42]。

3 環(huán)境因子與生物膜發(fā)育調(diào)控

3.1 菌體自身信號

3.1.1 群體感應(yīng)

群體感應(yīng)是細(xì)菌通過識別自身分泌的小分子自體誘導(dǎo)物，調(diào)控與群體密度相關(guān)基因表達(dá)的現(xiàn)象，被稱為細(xì)菌之間交流的互聯(lián)網(wǎng)。與其他病原菌不一樣，霍亂弧菌中群體感應(yīng)是抑制生物被膜的形成?；魜y弧菌能分泌兩種信號分子CAI-1和 AI-2，CAI-1 是(S)-3-hydroxytridecan-4-one，一種新型的細(xì)菌自體誘導(dǎo)物，主要負(fù)責(zé)霍亂弧菌之間的信號交流，AI-2分子式是 furanosyl borate disaster(2S,4S)-2-methyl-2,3,3,4-tetrahydroxy tetrahydrofuran borate，被認(rèn)為用于霍亂弧菌與其他細(xì)菌之間的交流[43]。CAI-1和 AI-2的受體蛋白分別是CqsS和LuxPQ，歸屬于組氨酸激酶，在細(xì)菌群體低密度時磷酸化LuxO蛋白，進(jìn)而激發(fā)qrr1-4小RNA的合成，這些小RNA能夠降解hapR的mRNA[44]。高細(xì)菌群體密度情況下，HapR大量表達(dá)，可以直接抑制VPS合成基因vpsL[15]，VPS調(diào)控基因vpsR、vpsT的表達(dá)[14]，也可以通過抑制AphA的表達(dá)[16,45]，以及減少c-di-GMP的胞內(nèi)濃度[15]，從而在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后修飾水平影響 VpsT的活性，達(dá)到抑制霍亂弧菌生物被膜形成的目的[13,45]。HapR還可以通過激發(fā)蛋白酶 HapA的表達(dá)，降解生物被膜合成關(guān)鍵蛋白GpbA[38]、RbmA[21]，誘導(dǎo)生物被膜解離。我們的研究表明，這種群體感應(yīng)調(diào)控的生物被膜解離對于霍亂弧菌在宿主體內(nèi)定殖非常重要[7]。

3.1.2 c-di-GMP

環(huán)化雙鳥苷酸(c-di-GMP)是細(xì)菌胞內(nèi)第二信使，參與調(diào)控霍亂弧菌游動性和生物被膜形成[46]。c-di-GMP合成代謝由具有GGDEF結(jié)構(gòu)域的雙鳥苷酸環(huán)化酶(Diguanylate cyclases，DGCs)負(fù)責(zé)，分解代謝由EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(Phosphodiesterases，PDEs)負(fù)責(zé)[46]?；魜y弧菌中有31個蛋白具有 GGDEF結(jié)構(gòu)域，12個蛋白具有 EAL結(jié)構(gòu)域，9個蛋白具有HD-GYP結(jié)構(gòu)域，同時還有10個蛋白同時含有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域[47]。可以想象，霍亂弧菌對體內(nèi)c-di-GMP濃度控制非常精密，霍亂弧菌可能利用c-di-GMP濃度的精細(xì)改變來調(diào)控不同基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組研究表明，VpsR和 VpsT能夠上調(diào) DGCs，抑制 PDEs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[14,48]。啟動子序列分析推測，VpsR能夠直接結(jié)合c-di-GMP代謝基因cdgA、cdgC、cdgD和vca0165的啟動子區(qū)域，從而直接調(diào)控c-di-GMP的生成[48-49]。與VpsR和VpsT相反，HapR抑制DGCs，上調(diào)PDEs的表達(dá)[14-15]，我們的研究進(jìn)一步表明HapR能特異性地結(jié)合cdgA、cdgG、vca0080、vc2370、vc1851和vc108650[50]。此外，群體感應(yīng)系統(tǒng)小RNA Qrr1-4、蛋白酶LonA也參與調(diào)控霍亂弧菌體內(nèi)c-di-GMP的水平[41,51-52]。

提高霍亂弧菌體內(nèi)c-di-GMP水平會激發(fā)編碼MSHA纖毛的msh基因，合成表面多糖的vps基因以及其他生物被膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時抑制細(xì)菌鞭毛基因的表達(dá)[53]。進(jìn)一步研究表明，小分子c-di-GMP能夠結(jié)合ATP酶MshE，影響MshA纖毛的產(chǎn)生[54]；結(jié)合表面多糖主要調(diào)控蛋白VpsT和VpsR，影響VPS的合成[13,55]；結(jié)合鞭毛合成調(diào)控蛋白 FlrA，抑制細(xì)菌鞭毛的合成[42,56]?；魜y弧菌中 PilZ蛋白也能特異性地和c-di-GMP結(jié)合，調(diào)控霍亂弧菌生物被膜形成、菌體游動性和毒力[57-58]。

3.1.3 (p)ppGpp

鳥苷四磷酸(Guanosin3′5′-bis(diphosphate)，ppGpp)和鳥苷五磷酸(Guanosine3′-diphosphate5′-triphosphate，pppGpp)是細(xì)菌在營養(yǎng)缺乏時合成的小分子化合物[59]?；魜y弧菌利用RelA、RelV和SpoT催化底物GDP、GTP合成(p)ppGpp，SpoT還負(fù)責(zé)該類小分子的分解代謝，通過水解反應(yīng)，將其分解成催化底物和磷酸分子[49,59-60]。研究表明，vpsR的轉(zhuǎn)錄需要上述3種(p)ppGpp合成酶同時存在，而vpsT的轉(zhuǎn)錄只是依賴于RelV[59]，同時發(fā)現(xiàn)，脅迫應(yīng)答調(diào)控因子 RpoS也參與(p)ppGpp對霍亂弧菌生物被膜的調(diào)控[59]。

3.1.4 cAMP

細(xì)菌的第二信使分子環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通常在碳源營養(yǎng)缺乏時，由腺苷環(huán)化酶 CyaA合成，結(jié)合cAMP受體蛋白(cAMP recetor protein，CRP)，啟動細(xì)菌碳源代謝的抑制過程。cAMP在霍亂弧菌中，抑制生物被膜的形成，其作用機制包括直接下調(diào)生物被膜合成關(guān)鍵基因rbmA、rbmC、bap1、vpsR和其他vps基因[61]，抑制c-di-GMP合成相關(guān)基因rocS、cdgA、cdgH和cdgI[61]，激發(fā)霍亂弧菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)。cAMP可以直接上調(diào)群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)控因子HapR的表達(dá)，也可以激發(fā)霍亂弧菌群體感應(yīng)自體誘導(dǎo)物CAI-1的生物合成，間接增強hapR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[61-62]。

3.1.5 甲精胺和精胺

多胺類物質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的有機陰離子[63]，霍亂弧菌體內(nèi)重要的多胺類物質(zhì)包括甲精胺(Norspermdine)和精胺(Spermdine)，它們對生物被膜的調(diào)控作用是相反的。甲精胺(Norspermdine)能夠促進(jìn)霍亂弧菌生物被膜的形成，生物合成基因的敲除會極大地降低霍亂弧菌生物被膜的產(chǎn)生[63]。甲精胺的合成酶是 NspC，該酶的過表達(dá)會導(dǎo)致霍亂弧菌vps基因表達(dá)的增強，產(chǎn)生大量的生物被膜[64]。甲精胺的受體蛋白是 NspS，兩者結(jié)合后，能夠與含有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的內(nèi)膜蛋白MbaA相互作用，影響MbaA抑制生物被膜的能力[65]。精胺通過底物結(jié)合蛋白 PotD1進(jìn)入霍亂弧菌細(xì)胞內(nèi)[66]，potD1缺失株生物被膜合成能力極大增強，而外源添加精胺具有顯著抑制霍亂弧菌生物被膜產(chǎn)生的作用[66]。

3.2 自然環(huán)境信號分子

3.2.1 糖類和糖類運輸PTS系統(tǒng)

自然狀態(tài)下，霍亂弧菌生存在營養(yǎng)貧瘠的水體環(huán)境中，主要通過高度保守的磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphoenolpyruvate phosphotransferae system，PTS)調(diào)控特定碳水化合物的運輸和攝取[67]。在PTS系統(tǒng)中，糖的轉(zhuǎn)運和磷酸化途徑包含通用組分酶Ⅰ(EI)，組氨酸蛋白(Hpr)和糖特異性酶Ⅱ(EII)[68]。在葡萄糖、甘露糖等匱乏的環(huán)境中，霍亂弧菌會激發(fā)cAMP的合成，形成cAMP-CRP復(fù)合物調(diào)控營養(yǎng)獲取和利用的相關(guān)基因的表達(dá)，同時激發(fā)生物被膜的合成[21,61]。糖類調(diào)控霍亂弧菌生物被膜形成是依賴于PTS系統(tǒng)運輸?shù)腫68]，已經(jīng)報道有4種獨立的PTS系統(tǒng)參與調(diào)控霍亂弧菌的生物被膜形成[42,60]。

霍亂弧菌中，PTS系統(tǒng)的關(guān)鍵酶還直接參與生物被膜的合成。例如，磷酸化的EI和HPr能夠抑制vps基因的表達(dá)[36,68-69]；葡萄糖特異性酶 EIIA(Glc)在非磷酸化條件下，直接結(jié)合在GGDEF-EAL蛋白CsrD的EAL結(jié)構(gòu)域上，從而影響c-di-GMP的產(chǎn)生[70]；EIIA(Glc)激活霍亂弧菌生物被膜合成基因的表達(dá)[71]，還能夠通過結(jié)合MshH蛋白，阻止 MshH對生物被膜合成的抑制[45]。

3.2.2 磷(PhoBR)

霍亂弧菌生存的水體資源很多都是磷素資源貧瘠，在人體小腸環(huán)境中，磷元素也是限制營養(yǎng)元素之一[72]?；魜y弧菌通過雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PhoR/PhoB來應(yīng)答磷缺乏的刺激，組氨酸激酶PhoR通過PTS系統(tǒng)磷酸化PhoB，磷酸化的PhoB能夠直接降低vpsR的表達(dá)[73]，也可以通過調(diào)控c-di-GMP代謝酶AcgAB的表達(dá)[65]，抑制霍亂弧菌生物被膜的合成。在幼鼠小腸定殖模型中，PhoB對霍亂弧菌生物被膜的抑制調(diào)控主要發(fā)生在感染后期，因此該調(diào)控被認(rèn)為與霍亂弧菌生物被膜的解離相關(guān)[56,65]。

3.2.3 鈣離子

環(huán)境中鈣離子濃度能夠調(diào)控霍亂弧菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)CarR/CarS的表達(dá)，抑制生物被膜vps基因的表達(dá)，并且促進(jìn)生物被膜的解離[74-75]。

3.2.4 鐵離子

鐵缺乏條件下，霍亂弧菌生物被膜合成能力下降，鐵離子和鐵離子依賴Fur蛋白抑制小RNA RyhB的合成，Microarray結(jié)果表明，霍亂弧菌RhyB可能通過調(diào)控鞭毛基因的表達(dá)或干擾鞭毛依賴的信號途徑來影響生物被膜的形成[76]。

3.2.5 鹽離子濃度和滲透壓

水體環(huán)境中鹽離子濃度和滲透壓同樣影響霍亂弧菌生物被膜的形成[77]。低鹽濃度激發(fā)oscR基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 OscR抑制vps的表達(dá)，促進(jìn)霍亂弧菌的游動性[78]。相反，在高鹽濃度情況下，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OscR激發(fā)VPS的產(chǎn)生，抑制霍亂弧菌的游動性[79]。

3.2.6 冷環(huán)境

一般的環(huán)境溫度為15℃或25℃，人體腸道為37℃，霍亂弧菌在感染周期中，不斷循環(huán)接觸這兩種溫度。Townsley等的研究結(jié)果表明，低溫能夠增加胞內(nèi)c-di-GMP的濃度，從而促進(jìn)霍亂弧菌的生物被膜形成[80]。進(jìn)一步研究表明，冷休克蛋白CspV參與這一過程[81]。但Stauder等也比較了溫度對霍亂弧菌生物被膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)生物被膜在25℃比15℃形成得更好，可能與gbpA和mshA在25℃有較高表達(dá)相關(guān)[82]。不同實驗室結(jié)果之間的沖突可能與所用實驗菌株不同有關(guān)。

3.3 宿主環(huán)境信號分子

上文提到，在經(jīng)過食道進(jìn)入腸道的感染途徑中，霍亂弧菌必須從生物被膜中逃逸，然后穿透小腸粘液層，最終定殖到小腸上皮細(xì)胞上[7]。同時，研究表明霍亂弧菌在宿主體內(nèi)也形成生物被膜，這種體內(nèi)形成的生物被膜具有超感染性和環(huán)境抗逆能力[8]。腸道環(huán)境內(nèi)的許多生理和化學(xué)信號參與調(diào)控霍亂弧菌生物被膜的發(fā)育，包括溫度、pH、氧脅迫、滲透壓、膽鹽等。

我們的研究表明，宿主小腸內(nèi)的厭氧環(huán)境能夠通過刺激毒力調(diào)控因子AphB235位半胱氨酸的還原，形成AphB分子間的二聚體，毒力調(diào)控活性增強[83]。而腸道內(nèi)的初級膽鹽(Taurocholate、Glycocholate等)能夠通過刺激膜蛋白TcpP在周質(zhì)空間內(nèi)形成分子間的相互作用，提高下游毒力基因的表達(dá)[84]。毒力基因的核心調(diào)控因子ToxT受到激發(fā)后，會抑制MshA纖毛的合成，并通過控制蛋白酶表達(dá)，降解已有的MshA，影響生物被膜的形成[85-86]。同時 ToxT會激發(fā)TCP纖毛的合成，有利于霍亂弧菌與腸道上皮細(xì)胞粘附，以及在幾丁質(zhì)介質(zhì)表面形成生物被膜[33]，并認(rèn)為TCP纖毛參與霍亂弧菌體內(nèi)微菌落的發(fā)育[87]。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小腸粘液蛋白能夠抑制霍亂弧菌表面多糖基因vps的表達(dá)[88]，同時，Bhowmick等證明，小腸粘液蛋白能夠刺激霍亂弧菌GbpA的表達(dá)，產(chǎn)生的GbpA結(jié)合在粘膜蛋白上的寡糖殘基，有利于體內(nèi)生物被膜的形成[89]。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌在穿透小腸粘液層時，伴隨著鞭毛斷裂，細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控蛋白HapR活性受到抑制，有利于霍亂弧菌毒力和生物被膜基因的表達(dá)[90]。動物細(xì)胞和宿主實驗證明，霍亂弧菌能夠感知與小腸細(xì)胞的接觸，并激發(fā)vpsT的表達(dá)[91-92]。Klose的研究團隊也認(rèn)為，鞭毛脫落是霍亂弧菌生物被膜形成的信號，并推測霍亂弧菌利用Na離子驅(qū)動的鞭毛馬達(dá)基因作為感應(yīng)器，識別霍亂弧菌與外界介質(zhì)的接觸[93-94]。

腸道膽汁是一個復(fù)雜的混合物，包含膽汁酸、膽固醇和許多不飽和脂肪酸等。膽汁提取物和膽酸鈉能通過激發(fā) VpsR顯著促進(jìn)霍亂弧菌生物被膜的形成[95]。膽酸混合物還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞體內(nèi)c-di-GMP的濃度來影響生物被膜，這種調(diào)控可以被腸道內(nèi)的碳酸氫鈉所中和[96]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)一種主要的膽酸鹽(Taurocholate，牛磺酸膽酸鹽)能夠降解霍亂弧菌生物被膜[97]。有趣的是，最近報道?；撬峤Y(jié)合態(tài)膽酸鹽還能抑制霍亂弧菌和綠膿假單胞菌生物被膜[98]。因此，膽酸鹽對腸道內(nèi)霍亂弧菌生物被膜的調(diào)控非常復(fù)雜和精細(xì)。

腸道內(nèi)的其他物質(zhì)也參與調(diào)控霍亂弧菌生物被膜的發(fā)育。例如非特異性人類分泌性免疫球蛋白SIgA能夠抑制霍亂弧菌生物被膜的形成，這種抑制作用是SIgA結(jié)合寡糖中的甘露糖導(dǎo)致的[99]。人體的腸道微生物能夠合成很多吲哚，也作為信號分子激發(fā)霍亂弧菌vps基因的表達(dá)[100]。

4 結(jié)論與展望

霍亂弧菌是人類歷史上非常重要的一種病原菌，生物被膜的發(fā)育對霍亂弧菌的感染和環(huán)境適應(yīng)具有重要的意義。近年來，研究人員對霍亂弧菌生物被膜發(fā)育進(jìn)行了深入的研究?；魜y弧菌生物被膜主要構(gòu)成成分有霍亂弧菌細(xì)菌表面多糖VPS、基質(zhì)蛋白和eDNA等。霍亂弧菌生物被膜的發(fā)育過程中，首先通過鞭毛運動尋找介質(zhì)表面合適的粘附位點，然后通過MshA纖毛媒介與無機介質(zhì)表面的粘附，或TCP纖毛和GbpA粘附蛋白，與有機介質(zhì)表面結(jié)合。霍亂弧菌在介質(zhì)表面形成單層細(xì)胞粘附后，VPS大量合成，同時基質(zhì)蛋白RbmA、Bap1和RbmC也開始合成，共同粘結(jié)細(xì)菌與介質(zhì)、細(xì)菌與細(xì)菌、以及細(xì)菌與生物被膜化學(xué)成分，形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的成熟的生物被膜，eDNA和外膜顆粒OMV也參與霍亂弧菌生物被膜的構(gòu)成。當(dāng)霍亂弧菌遇到合適的環(huán)境刺激，在蛋白酶和核酸酶等作用下，生物被膜開始解離，釋放出的游離細(xì)菌有利于霍亂弧菌體內(nèi)定殖和環(huán)境逃逸。霍亂弧菌生物被膜組成物質(zhì)的合成主要受 VpsT和 VpsR調(diào)控，HapR、H-NS、AphA、VqmA等蛋白也參與其中，它們還互相影響，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；魜y弧菌的小RNA通過降解或穩(wěn)定目標(biāo)基因的mRNA，參與霍亂弧菌對生物被膜發(fā)育的調(diào)控。

霍亂弧菌能夠應(yīng)答不同的環(huán)境信號來調(diào)控生物被膜的發(fā)育，包括菌體自身產(chǎn)生的信號，例如群體感應(yīng)信號、c-di-GMP、(p)ppGpp、cAMP和多胺類物質(zhì)；自然環(huán)境信號，例如鹽離子濃度和滲透壓、糖類物質(zhì)、磷、鈣、鐵以及溫度等；宿主環(huán)境信號，例如腸道細(xì)胞粘附、厭氧環(huán)境、膽酸鹽、腸道粘液蛋白以及腸道環(huán)境中宿主和土著微生物分泌的化學(xué)物質(zhì)(吲哚、SIgA等)。

霍亂弧菌生物被膜形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到了較為詳盡的研究，但主要集中在研究實驗室條件下生物被膜的發(fā)育，分子機理研究也主要集中在遺傳學(xué)方面?？紤]到霍亂弧菌是一種腸道致病菌，其發(fā)病機制與腸道環(huán)境刺激緊密聯(lián)系，我們建議今后的研究應(yīng)該聚焦在宿主腸道環(huán)境中霍亂弧菌生物被膜的發(fā)育過程。

腸道環(huán)境中信號分子非常復(fù)雜，而且在不同腸道微環(huán)境中分布不均勻。例如，Matthew Waldor發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌在腸道中的定殖具有位置特異性，在小腸近端霍亂弧菌主要定殖在小腸隱窩(Intestinal crypt)中，而在小腸遠(yuǎn)端霍亂弧菌均勻定殖在腸上皮細(xì)胞上[101]。同時，隨著霍亂弧菌的感染，腸道環(huán)境會發(fā)生動態(tài)變化。Andrew Camilli報道，磷反應(yīng)調(diào)控因子PhoB對霍亂弧菌生物被膜和游動性的調(diào)控只發(fā)生在細(xì)菌感染末期[56,65]。因此，腸道微環(huán)境下生物被膜發(fā)育的研究需要建立在時空動態(tài)變化的基礎(chǔ)上。宿主腸道環(huán)境包含著多種不同的環(huán)境因子能夠共同調(diào)控霍亂弧菌生物被膜的發(fā)育。腸道內(nèi)膽汁和碳酸氫鈉都通過調(diào)控霍亂弧菌胞內(nèi)c-di-GMP濃度，影響生物被膜的合成，膽汁和碳酸氫鈉在小腸內(nèi)分布是不均勻的，因此和其他信號分子一起，構(gòu)成了霍亂弧菌感應(yīng)腸道位置的GPS系統(tǒng)[96,102]。目前，Kim等利用單細(xì)胞成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，遺傳背景相同的霍亂弧菌細(xì)胞在流體中應(yīng)答群體感應(yīng)信號時呈現(xiàn)不同反應(yīng)，這種反應(yīng)與霍亂弧菌細(xì)胞在流體中的時空分布差異相關(guān)[103]。

霍亂弧菌會根據(jù)不同的環(huán)境信號，形成不同特性的生物被膜。例如，霍亂弧菌在淡水中形成VPS依賴性生物被膜，而在海水中形成 VPS非依賴性生物被膜[104]。我們近期的研究報道，霍亂弧菌能利用AphB和OhrR精細(xì)識別不同的氧化還原電位水平，這種氧化還原電位水平的變化發(fā)生在霍亂弧菌在自然環(huán)境和宿主環(huán)境穿梭的過程中[105-106]。我們相信，霍亂弧菌的生物被膜調(diào)控也參與到霍亂弧菌在不同生境之間穿梭的過程中，其具體分子機理的闡述，會對我們深入認(rèn)識霍亂弧菌以及其他微生物生物被膜發(fā)育提供啟迪。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Biofilm development and environmental determinants inVibrio cholerae

Quanmin Wang, Yao Ma, Lijun Liu, Jun Zhu, and Zhi Liu
College of Life Science & Technology,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430074,Hubei,China

Biofilm associatedVibrio choleraeexhibits hypervirulence and supreme fitness against the harsh stresses during its infectious cycle.It is important to study the relationships between the regulation mechanism ofV.choleraebiofilm development and its environmental adaption in host niche and aquatic habitat.Here, we summarize the recent advances inV.choleraebiofilm, including biofilm compositions, development and regulation.Particularly, we extensively discuss howV.choleraefosters its biofilm architecture and assembly via sensing and responding various environmental determinants, such as bacterium self-produced molecules, natural environment components and host factors.

biofilm,Vibrio cholerae, environmental determinants

February11,2017;Accepted:May2,2017

Zhi Liu.Tel/Fax: +86-27-87001156; E-mail: zhiliu@hust.edu.cn

王全民, 馬遙, 劉麗鈞, 等.霍亂弧菌生物被膜發(fā)育與環(huán)境調(diào)控.生物工程學(xué)報,2017,33(9):1533–1546.

Wang QM, Ma Y, Liu LJ, et al.Biofilm development and environmental determinants inVibrio cholerae.Chin J Biotech,2017,33(9):1533–1546.

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.81572050).

國家自然科學(xué)基金(No.81572050)資助。

時間：2017/5/17

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170517.1444.001.html

劉智 華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，中組部“青年千人計劃”獲得者(第11批)。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)系博士，華中科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程博士后，美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系研究助理。研究方向為腸道環(huán)境中微生物與宿主相互作用。先后在Proc Natl Acad Sci USA、Nucleic Acids Res、mBio等國際權(quán)威期刊發(fā)表SCI論文30多篇，其中Proc Natl Acad Sci USA4篇。曾獲“國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎二等”、湖北省自然科學(xué)獎和江蘇省科學(xué)進(jìn)步獎等，同時多篇論文多次受到同行專家的專題推薦?；貒笤贑ell Rep、Mol Microbiol、Scientific Rep等刊物上發(fā)表多篇研究論文，獲得國家自然科學(xué)基金面上項目及“973”課題資助。