龔惠，陳志丹，鄒云增

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院上海市心血管病研究所，上海200032）

干細(xì)胞與心肌再生

龔惠，陳志丹，鄒云增

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院上海市心血管病研究所，上海200032）

由于成年心肌細(xì)胞通常不能再生，嚴(yán)重的心肌損傷會(huì)導(dǎo)致心肌不可逆的重構(gòu)壞死，從而發(fā)生心功能失調(diào).干細(xì)胞再生治療為心肌再生提供了很好的策略.為了尋找合適的干細(xì)胞類型，促進(jìn)心肌再生，有效改善心功能，需要更好地了解心肌修復(fù)和再生的分子基礎(chǔ).已有研究發(fā)現(xiàn)多種干細(xì)胞可促進(jìn)心肌再生.描述了骨髓干細(xì)胞的促血管新生及心肌分化的能力在心梗治療中的作用，還討論了心臟側(cè)群干細(xì)胞以及誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞在心肌再生中的作用和分子機(jī)制.所闡述的最新數(shù)據(jù)有利于拓展干細(xì)胞治療的有效潛能及臨床影響.

干細(xì)胞；心肌再生；骨髓干細(xì)胞；心臟側(cè)群干細(xì)胞；誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞

冠心病及高血壓等原因會(huì)引起心肌缺血，心臟發(fā)生重構(gòu)以代償心功能，在病理性刺激持續(xù)存在的情況下，心臟功能向失代償轉(zhuǎn)變，最終發(fā)展成為心力衰竭［1］.心力衰竭的預(yù)后非常差，5年病死率高達(dá)50%以上，嚴(yán)重威脅人類健康，被認(rèn)為是“心血管疾病中尚未攻克的堡壘”.由于成年心肌細(xì)胞通常不能再生，心臟移植成為治療重型心力衰竭的唯一有效途徑.但由于心臟供體的嚴(yán)重匱乏，成千上萬的心力衰竭患者在等待中死亡.而干細(xì)胞具有增殖和分化潛能，是器官發(fā)育和組織修復(fù)的基礎(chǔ).尋找合適的干細(xì)胞類型，促進(jìn)心肌再生，有效改善心功能是心肌再生治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).

1　骨髓干細(xì)胞與心肌再生

在所有干細(xì)胞類型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）促進(jìn)心肌再生的相關(guān)研究最早.MSC最初在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)或體外特定誘導(dǎo)條件下，可分化成多種組織細(xì)胞包括心肌及內(nèi)皮等［2］.由于MSC來源廣、易培養(yǎng)，具有較強(qiáng)的分化潛能和可以自體移植等優(yōu)點(diǎn)，為各種心肌細(xì)胞壞死性疾病提供了一條新的有效的治療途徑，被認(rèn)為是即將引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞.國(guó)際上將骨髓干細(xì)胞移植用于治療心肌梗死始于2001年［3］.除急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）外，其他心臟疾病如陳舊性心肌梗死、重癥心絞痛、嚴(yán)重心肌病以及由各種原因引起的心力衰竭等也都涉及心肌細(xì)胞的壞死，同樣可以施行自體骨髓干細(xì)胞移植治療［3］.

臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，冠脈內(nèi)骨髓干細(xì)胞移植可改善急性心肌梗死后左室收縮舒張功能及冠脈血流儲(chǔ)備［4］.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床研究也證實(shí)，同種異體骨髓MSC對(duì)急性心肌梗死的心功能改善起到積極的作用，對(duì)慢性心梗病人的治療雖然沒有提高心臟的左室收縮功能，卻能改善舒張功能.不過MSC移植后存活率低等問題嚴(yán)重影響其對(duì)心功能的改善效果.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的臨床團(tuán)隊(duì)嘗試多次冠脈內(nèi)注射MSC，觀察到多次注射比單次注射對(duì)大面積心梗的心功能恢復(fù)作用更明顯［5］，并且觀察到急性心梗后4～7 d是最佳移植時(shí)間，能夠明顯降低再次血運(yùn)重建率、死亡或再次心肌梗死的聯(lián)合發(fā)生率等［4］.這主要是因?yàn)樘幱谶@個(gè)時(shí)間窗的心肌彈性可能更有利于移植細(xì)胞的存活和分化［6］，心臟微環(huán)境對(duì)移植后MSC在體內(nèi)的存活及分化有重要的作用.

盡管MSC移植治療心梗是非常有臨床價(jià)值的，但其具體機(jī)制并不十分清楚.有學(xué)者認(rèn)為，除了MSC分化成心肌細(xì)胞或血管細(xì)胞等細(xì)胞外，其通過旁分泌作用修復(fù)心肌或促進(jìn)血管新生也產(chǎn)生一定的作用［7］.因此，探索MSC移植促進(jìn)心肌再生及改善心功能的機(jī)制，采用多種手段協(xié)同改善MSC的存活及分化，有利于突破MSC移植效率低的瓶頸，從而更有效地治療心梗后心衰.

2　心臟側(cè)群干細(xì)胞與心肌再生

側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞是一種特殊類型的干/祖細(xì)胞，最初是1996年Goodell等［2］在分離純化小鼠骨髓造血干細(xì)胞時(shí)分離和鑒定出的，其發(fā)育和分化狀態(tài)可能介于胚胎和成體干細(xì)胞之間，仍具有很強(qiáng)的多向分化潛能和增殖特性，能參與相應(yīng)組織的更新與再生.由于SP細(xì)胞具有將熒光染料Hoechst 33342泵出細(xì)胞外的特性，利用這一特性并結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選法可對(duì)SP細(xì)胞進(jìn)行分離純化，且因其在流式二維分析點(diǎn)陣圖上呈彗星狀分布在造血干/祖細(xì)胞主群的一側(cè)，因此被稱為SP細(xì)胞.自2002年以來，不斷有證據(jù)表明，心臟中也含有SP細(xì)胞，即心臟側(cè)群細(xì)胞（cardiac side population cells，CSPs）.CSPs具有干細(xì)胞特性，表達(dá)一些干細(xì)胞的標(biāo)志，如Sca-1，Mdr1，c-kit等，因此CSPs細(xì)胞實(shí)際是心臟成體干細(xì)胞的集合，是研究心臟原位修復(fù)的重要方向［8］.

CSPs具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，能夠增殖形成克隆并分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪組織等多種細(xì)胞類型［9-10］.在生理狀態(tài)下CSPs維持極低水平的增殖更新，發(fā)生心肌梗死后，SP細(xì)胞的增殖水平快速提高，然后逐步降低.已有研究表明，心梗后心臟中有一部分來自骨髓中的SP細(xì)胞駐留心臟，轉(zhuǎn)化為CSPs［11］，提示CSPs的增多有可能對(duì)修復(fù)心肌有重要作用.然而在各種病因所致的心肌損傷中，心肌再生和修復(fù)還是有很大的局限性.究竟是CSPs更新水平不夠、數(shù)量有限，還是缺乏合適的微環(huán)境介導(dǎo)CSPs的增殖分化從而導(dǎo)致心肌損傷的不可逆發(fā)生？這些問題都有待進(jìn)一步研究.

本研究團(tuán)隊(duì)試圖找到激活CSPs，喚起心臟的自我修復(fù)能力的方法.前期研究觀察到粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）還可以直接活化心肌細(xì)胞STAT3信號(hào)抑制心肌細(xì)胞凋亡［12］.已有研究表明，G-CSF能夠促使骨髓干細(xì)胞向損傷的心臟趨化成為CSPs，發(fā)揮修復(fù)心肌的作用［13］.因此，G-CSF被看作有潛力治療心肌梗死的藥物而進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段.另外，本研究團(tuán)隊(duì)在CSPs表面還發(fā)現(xiàn)UrotensinⅡ（UⅡ）受體的存在.與G-CSF受體不同，UⅡ受體的活化并不能促進(jìn)CSPs的增殖能力，而是通過活化JNK信號(hào)通路抑制其增殖能力［14］.在壓力超負(fù)荷小鼠的心衰模型中，觀察到血清中UⅡ明顯上升，使用Urantide阻斷UⅡ受體能夠促進(jìn)壓力超負(fù)荷小鼠CSPs增殖，提高心臟修復(fù)能力，改善心臟功能［15］.因此，如何制定最佳藥物組合，促進(jìn)CSPs增殖和分化，最大程度地提升心臟自我修復(fù)潛力將是未來的研究方向.

3　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與心肌再生

2006年Takahashi等［16］通過特定基因的表達(dá)將完全分化的成年細(xì)胞重新編程為類似胚胎狀態(tài)的全能性或多能性的細(xì)胞，即誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）.由于iPSCs可由體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化而來，具有來源廣泛、取材便捷、免疫相容性高等優(yōu)點(diǎn)，并且其生理特性接近胚胎干細(xì)胞，是研究組織再生包括心肌再生的重要工具.iPSCs技術(shù)也被認(rèn)為是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)里程碑式的突破，具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值.

但要真正將iPSCs應(yīng)用于臨床治療心血管疾病，還需先解決以下幾個(gè)問題：①iPSCs自發(fā)向心肌細(xì)胞分化的效率極低，并且分化后的功能不成熟；②iPSCs有成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要研究iPSCs向心肌細(xì)胞高效分化的機(jī)制，建立穩(wěn)定的定向分化技術(shù)體系，并盡可能篩選純化心肌細(xì)胞以進(jìn)行移植，避免直接iPSCs治療可能引發(fā)的腫瘤風(fēng)險(xiǎn).

各研究團(tuán)隊(duì)大多通過化學(xué)小分子預(yù)處理或者直接導(dǎo)入心肌分化相關(guān)基因促使iPSCs向心肌細(xì)胞分化［17-18］.本研究團(tuán)隊(duì)利用蛋白組學(xué)技術(shù)，分析了二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）誘導(dǎo)P19CL6細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)蛋白譜差異，從中篩選出重要調(diào)節(jié)因子——核小體組裝蛋白類似蛋白1（nucleosome assembly protein 1-like 1，Nap1L1）［19］. Nap1L1是一種核小體組裝蛋白，參與DNA復(fù)制和核小體組裝，并且能促進(jìn)細(xì)胞包括iPSCs的增殖［20-21］.本研究團(tuán)隊(duì)分別構(gòu)建了Nap1L1敲減和過表達(dá)的iPSCs系，iPSCs的多能干性并未受到影響.在相同分化培養(yǎng)條件下，下調(diào)Nap1L1表達(dá)使iPSCs向心肌細(xì)胞分化的比率增加近5倍，分化的心肌細(xì)胞具備正常心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特征.通過構(gòu)建誘導(dǎo)型的Nap1L1過表達(dá)iPSCs系，明確了Nap1L1能夠調(diào)控中胚層的分化，從而調(diào)節(jié)心肌分化.同樣地，下調(diào)Nap1L1可明顯促進(jìn)iPSCs向平滑肌以及內(nèi)皮細(xì)胞的分化.已有研究表明，notch信號(hào)抑制可明顯促進(jìn)中胚層的分化以及心肌和血管細(xì)胞的分化，進(jìn)一步的研究表明Nap1L1調(diào)控中胚層及心肌分化是通過調(diào)控notch信號(hào)活性來實(shí)現(xiàn)的［22］.上述研究結(jié)果提示心肌細(xì)胞的分化是個(gè)非常復(fù)雜的過程，通過單一因素特異性地促進(jìn)iPSCs向心肌分化存在很大的局限性.本研究團(tuán)隊(duì)還觀察到，在心臟晚期發(fā)育過程中起重要作用的胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4（insulin-like growth factor binding protein 4，IGFBP4）也可促進(jìn)iPSCs向心肌細(xì)胞分化，具體機(jī)制主要是通過抑制wnt信號(hào)β-catenin從而促進(jìn)分化的心肌細(xì)胞增殖［23］.楊黃恬研究組通過11株不同的iPSCs系統(tǒng)篩選出了16種心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)物，發(fā)現(xiàn)只有抗壞血酸（ascorbic acid，AA）起到了一致和高效的誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的作用.通過比較不同濃度和不同分化時(shí)段AA的處理，建立了簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效的誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的體系，可將小鼠和人iPSCs向心肌細(xì)胞的分化效率分別提高約7.3倍和30.2倍，并明顯縮小不同iPSCs系間包括不具有自發(fā)心肌細(xì)胞分化潛能的iPSCs間心肌細(xì)胞的分化差異［24］.

雖然iPSCs為心血管研究尤其是心肌再生提供了新的機(jī)會(huì)，但將iPSCs真正應(yīng)用于臨床還存在若干問題.在了解iPSCs向心肌分化機(jī)制的基礎(chǔ)上，利用基因干預(yù)技術(shù)以及小分子化合物的誘導(dǎo)作用，協(xié)同促進(jìn)iPSCs向心肌細(xì)胞分化，從而用于損傷心肌的修復(fù)，這是未來需要進(jìn)一步發(fā)展的治療策略.

4　結(jié)束語

綜上所述，盡管干細(xì)胞為心肌再生提供了廣闊的應(yīng)用前景，但有些問題亟待解決.2014年美澳兩國(guó)科研人員利用人類干細(xì)胞，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中成功修復(fù)了猴子受損的心臟，實(shí)現(xiàn)了心肌再生，為推動(dòng)相關(guān)技術(shù)早日進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段帶來新的希望.而如何通過基因及化學(xué)藥物技術(shù)最大程度地提高移植細(xì)胞的存活率，使各類干細(xì)胞發(fā)揮自身優(yōu)勢(shì)促進(jìn)人類心臟損傷后的心肌再生，是干細(xì)胞研究者們正在努力的目標(biāo).

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Stem cells and cardiac regeneration

GONG Hui，CHEN Zhidan，ZOU Yunzeng
（Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Human myocardium has poor regenerative power，and significant myocardial injury results in irreversible damage，remodeling，and dysfunction.Stem cells enable promising regenerative strategies for cardiovascular diseases.The search for suitable stem cell phenotypes that will improve myocardial regenerative ability needs better understanding of the molecular mechanisms of repair and regeneration.Previous reports have suggested that several stem phenotypes regulate myocardial regeneration in vitro and in vivo. This review describes the therapeutic potential of mesenchymal stem cell（MSC）therapy in terms of angiogenic and regenerative capacity after myocardial infarction.In addition，the effect of cardiac side population cells（CSPs）and the differentiation of induced pluripotent stem cells（iPSCs）in cardiac regeneration are discussed.The review provides recent data and helps broaden therapeutic potential and clinical impact of stem cell therapy.

stem cell；cardiac regeneration；mesenchymal stem cell（MSC）；cardiac side population cells（CSPs）；induced pluripotent stem cells（iPSCs）

R 34

A

1007-2861（2016）03-0280-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.016

2016-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81370258）；上海市科委資助項(xiàng)目（13JC1401703）

龔惠（1975—），女，副研究員，研究方向?yàn)楦杉?xì)胞和心力衰竭.E-mail：ghui1975@163.com