李紹輝，許秀麗，章飛芳，周偉娥，鄭　陽(yáng)，張　元，李紅娜，張　峰，*（.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京0076；.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海0037）

瑪咖酰胺分析方法研究進(jìn)展

李紹輝1，2，許秀麗1，章飛芳2，周偉娥1，鄭陽(yáng)1，2，張?jiān)?，李紅娜1，張峰1，*
（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京100176；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237）

瑪咖是原產(chǎn)于秘魯?shù)恼湎∷幨硟捎弥参?，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。具有緩解疲勞、改善睡眠、改善性功能及抗氧化等生物活性?，斂０肥乾斂е刑赜械幕钚晕镔|(zhì)，有很強(qiáng)的生物活性?，斂０吩诂斂е泻亢艿?，目前主要用溶劑回流、超聲等方法提取，高效液相色譜法及液質(zhì)聯(lián)用方法進(jìn)行檢測(cè)。本文對(duì)瑪咖酰胺提取分析研究進(jìn)行綜述，為其進(jìn)一步深入研究提供參考。

瑪咖，瑪咖酰胺，高效液相色譜法，液質(zhì)聯(lián)用LI Shao-hui1，2，XU Xiu-li1，ZHANG Fei-fang2，ZHOU Wei-e1，ZHENG Yang1，2，ZHANG Yuan1，LI Hong-na1，ZHANG Feng1，*

瑪咖（Lepidium meyenii Walp.）是十字花科獨(dú)行菜屬植物，原產(chǎn)秘魯。具有很豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，能夠緩解疲勞［1-3］、改善睡眠［4］、改善性功能［5-7］和抗氧化［8-10］，被稱為“秘魯人參”?，斂ё鳛槟厦纻鹘y(tǒng)的藥食兩用植物，已經(jīng)在國(guó)際保健品市場(chǎng)上嶄露頭角。我國(guó)衛(wèi)生部2002年時(shí)正式批準(zhǔn)瑪咖進(jìn)入中國(guó)并開(kāi)始在云南等地種植，2011年衛(wèi)生部公告第13號(hào)文件批準(zhǔn)瑪咖粉為新資源食品。

瑪咖酰胺是瑪咖中特有的活性成分，有研究表明［11］瑪咖酰胺具有很強(qiáng)的生物活性，并且有改善性功能，提升生育能力［12-13］等功能。有文獻(xiàn)［14］用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)干瑪咖中瑪咖酰胺含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得其含量?jī)H為0.0016%～0.0123%?，斂０纷鳛楝斂И?dú)特的化學(xué)成分，關(guān)于其生物活性方面的研究卻很少，可能與瑪咖酰胺的含量低有關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上有很多瑪咖產(chǎn)品熱銷，如瑪咖粉、瑪咖精片、瑪咖酒、瑪咖口服液等。而對(duì)瑪咖產(chǎn)品質(zhì)量好壞的評(píng)價(jià)，沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)?，斂０纷鳛槠涮赜械幕钚猿煞?，對(duì)其含量的準(zhǔn)確測(cè)定將會(huì)對(duì)評(píng)價(jià)瑪咖質(zhì)量好壞及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立有重要的意義。本文就國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中有關(guān)瑪咖酰胺的研究，著重對(duì)其提取及分析檢測(cè)研究進(jìn)行綜述。

1　瑪咖酰胺的形成過(guò)程

Eliana等［15］研究了新鮮瑪咖在干燥過(guò)程中瑪咖酰胺的形成過(guò)程。在鮮瑪咖干燥過(guò)程中，細(xì)胞膜和脂質(zhì)釋放出大量游離脂肪酸。芐基芥子油苷在芥子酶作用下經(jīng)過(guò)一系列水解反應(yīng)形成芐胺。芐胺和游離脂肪酸反應(yīng)形成了瑪咖酰胺。不同的游離脂肪酸和芐胺就形成了不同的瑪咖酰胺。

2　瑪咖酰胺的發(fā)現(xiàn)

Zheng B L等［16］用乙醇水溶液在干燥瑪咖中提取到一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的生物堿，通過(guò)HPLC方法分離純化，再用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，檢出了3種瑪咖酰胺。分別是N-芐基八烷酰胺、N-芐基-16-羥基-9-羰基-（10E，12E，14E）-十八碳三烯酰胺、N-芐基-（9，16）-二羰基-（10E，12E，14E）-十八碳三烯酰胺。Muhammad I等［17］采用石油醚從干燥瑪咖中提取，并經(jīng)過(guò)高分辨質(zhì)譜（HRMS）、紅外光譜（IR）、核磁共振（NMR）確定結(jié)構(gòu)，得到了2個(gè)新的瑪咖酰胺：N-芐基十六烷酰胺、N-芐基-5-羰基-（6E，8E）-十八碳二烯酰胺。Zhao J P等［18］報(bào)道發(fā)現(xiàn)了7種瑪咖酰胺，其中有5個(gè)新結(jié)構(gòu)：N-芐基-9-羰基-12Z-十八碳烯酰胺、N-芐基-9-羰基-（12Z，15Z）-十八碳二烯酰胺、N-芐基-13-羰基-（9E，11E）-十八碳烯酰胺、N-芐基-15Z-二十四烷酰胺、N-（3-甲氧基芐基）-十八烷酰胺。高大方等［19］用干燥瑪咖粉末經(jīng)過(guò)乙醇超聲提取，經(jīng)過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）分離分析得到3種新型結(jié)構(gòu)的瑪咖酰胺：N-對(duì)羥基芐基-5-羰基-（6E，8E，10E）-十八碳三烯酰胺、N-對(duì)羥基芐基-5-羰基-（6E，8E）-十八碳二烯酰胺、N-芐基-2E-十八碳烯酰胺。Fernando E等［20］對(duì)干瑪咖用正己烷索氏提取，經(jīng)過(guò)二維核磁結(jié)構(gòu)鑒定，得到兩個(gè)新瑪咖酰胺：N-（4，5-二甲氧基芐基）-十六碳酰胺、N-芐基二十四碳酰胺。

瑪咖中酰胺類物質(zhì)很多，主要區(qū)別在兩方面，一方面是苯環(huán)上的取代基種類和取代基的位置不同。另一方面是碳鏈的長(zhǎng)度，碳鏈的不飽和度，不飽和鍵的位置，還有順?lè)串悩?gòu)體的差別。隨著研究的深入，更多高新技術(shù)的應(yīng)用，可能會(huì)有越來(lái)越多的新瑪咖酰胺被發(fā)現(xiàn)。

3　提取方法

3.1回流提取

回流提取是用有機(jī)溶劑通過(guò)加熱的方式對(duì)瑪咖粉末中的酰胺類物質(zhì)進(jìn)行提取的一種方法。當(dāng)溶劑揮發(fā)后又被冷卻回到溶劑中，這樣周而復(fù)始對(duì)酰胺物質(zhì)進(jìn)行提取，直到提取完全。唐燕文等［21］對(duì)比了不同提取溶劑回流提取對(duì)瑪咖中酰胺類物質(zhì)的提取效果。文中分別用石油醚、乙醚、不同純度的乙醇水溶液對(duì)瑪咖粉末進(jìn)行提取，結(jié)果表明乙醇濃度為95%時(shí)瑪咖酰胺的提取效率最高?，斂０肥侨鯓O性物質(zhì)，所以弱極性有機(jī)溶劑能夠?qū)⑵鋸姆勰┲刑崛〕鰜?lái)，由于瑪咖酰胺的酰胺鍵具有成氫鍵的能力，所以與純乙醇相比，95%的乙醇提取效率更高?；亓魈崛⌒枰L(zhǎng)時(shí)間加熱，在提取瑪咖酰胺時(shí)可能會(huì)因溫度過(guò)高導(dǎo)致提取物的不穩(wěn)定?；亓魈崛〉膬?yōu)點(diǎn)是裝置簡(jiǎn)易，節(jié)省溶劑，操作簡(jiǎn)單，普通實(shí)驗(yàn)室都很容易滿足實(shí)驗(yàn)要求。然而回流提取消耗的溶劑量比較大，耗時(shí)較長(zhǎng)，大量溶劑必然會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。

3.2超聲提取

超聲的原理主要是產(chǎn)生空化效應(yīng)，熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)［22］。空化效應(yīng)是指液體中由于超聲原因產(chǎn)生負(fù)壓，當(dāng)負(fù)壓達(dá)到一定臨界值時(shí)，就會(huì)將液體拉斷，從而在液體中形成局部氣體或蒸汽空腔的現(xiàn)象。機(jī)械效應(yīng)是超聲在液體內(nèi)傳播過(guò)程中，傳遞的機(jī)械能使液體質(zhì)點(diǎn)在其傳播空間內(nèi)發(fā)生振動(dòng)，強(qiáng)化了液體的擴(kuò)散和傳質(zhì)，加速溶解。熱效應(yīng)是超聲在傳播過(guò)程中其機(jī)械能被介質(zhì)吸收轉(zhuǎn)換成熱能?？栈?yīng)及伴隨的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)促進(jìn)瑪咖酰胺向液體中溶解，從而加快提取過(guò)程，提高效率。

Eliana等［15］在研究瑪咖酰胺形成過(guò)程時(shí)，用超聲提取，液質(zhì)方法檢測(cè)其含量變化?，斂Х勰┯萌軇┏曁崛?，固相萃取（SPE）凈化后測(cè)定含量，避免了較大基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)的影響。朱穎秋等［23］將瑪咖粉末用乙醇超聲提取，提取液用HPLC方法測(cè)定瑪咖酰胺的含量。由于雜質(zhì)的干擾，研究的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品只有2個(gè)其相鄰色譜峰分離度達(dá)到要求，另一個(gè)色譜峰不符合要求無(wú)法進(jìn)行含量計(jì)算。

超聲的優(yōu)點(diǎn)是加速提取過(guò)程，提高效率，節(jié)省溶劑和時(shí)間，操作簡(jiǎn)單。但會(huì)對(duì)瑪咖細(xì)胞造成破壞使更多的物質(zhì)被溶劑提取出來(lái)，直接檢測(cè)會(huì)造成干擾。HPLC檢測(cè)時(shí)，很多具有紫外吸收的成分會(huì)與瑪咖酰胺共流出，必須分離效果良好才能準(zhǔn)確定量，加大了定量分析的難度。用質(zhì)譜檢測(cè)，雜質(zhì)會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生較大的基質(zhì)效應(yīng)，造成結(jié)果偏高或偏低。

3.3超臨界流體萃取

超臨界流體萃取技術(shù)是利用超臨界流體從液體或固體中萃取特定成分，達(dá)到分離目標(biāo)產(chǎn)物的一種新型分離技術(shù)［24］。超臨界流體萃取安全無(wú)毒，操作條件溫和，不易對(duì)瑪咖酰胺造成破壞［25-26］。朱穎秋等［23］對(duì)比了超臨界流體萃取、超聲提取、回流提取等提取方法的效率。結(jié)果表明超臨界流體萃取的效率和超聲提取效率相同，都低于回流提取。由于超臨界流體萃取的設(shè)備價(jià)格高昂，提取效率與超聲提取和回流提取相比并沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)，所以用于瑪咖酰胺的提取并不太合適。

4　分析方法

4.1高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型分離分析技術(shù)。具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高和分析速度快等特點(diǎn)，適用于復(fù)雜樣品的分離分析。文獻(xiàn)中對(duì)采用HPLC的方法對(duì)瑪咖酰胺進(jìn)行檢測(cè)［27-30］。Megan M等［14］用合成的N-芐基十六烷酰胺作為外標(biāo)物，用HPLC方法對(duì)瑪咖中的酰胺類物質(zhì)進(jìn)行定量分析。測(cè)得不同秘魯瑪咖樣品中酰胺類物質(zhì)含量從0.0016%到0.0123%不等。朱穎秋等［23］用實(shí)驗(yàn)室自制的3種瑪咖酰胺作為標(biāo)準(zhǔn)品，用HPLC方法對(duì)麗江、香格里拉、會(huì)澤和攀枝花等4個(gè)產(chǎn)地的瑪咖進(jìn)行分析。瑪咖粉末經(jīng)超聲提取后用C18色譜柱分離，208 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，用0.05%磷酸的乙腈-水溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫。結(jié)果對(duì)2種瑪咖酰胺進(jìn)行了定量分析，另一種由于分離度不好，達(dá)不到定量要求。該方法平均回收率達(dá)到98%以上，線性系數(shù)r=0.9999，具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。用HPLC方法對(duì)瑪咖樣品中瑪咖酰胺進(jìn)行檢測(cè)，具有高效、快速等特點(diǎn)。但是由于瑪咖酰胺種類很多，在檢測(cè)過(guò)程中很難避免雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，導(dǎo)致結(jié)果偏高，應(yīng)對(duì)提取液進(jìn)行凈化，使檢測(cè)解結(jié)果更為準(zhǔn)確。

4.2液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）

近年來(lái)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到極大的重視和發(fā)展且應(yīng)用日益廣泛。液相色譜法具有對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品的高效分離能力，質(zhì)譜法具有高選擇性、高靈敏度，可對(duì)樣品目標(biāo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析以及定性、定量檢測(cè)［31］。LC-MS技術(shù)利用液相色譜的高效分離能力對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行分離，再以質(zhì)譜為檢測(cè)器提供化合物的結(jié)構(gòu)信息。綜合了色譜和質(zhì)譜的特點(diǎn)形成一種優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的分離鑒定技術(shù)，使樣品分離、定性和定量成為一個(gè)連續(xù)的過(guò)程。特別是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）不僅分離能力強(qiáng)，選擇性好，靈敏度高，而且還可以對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品中的痕量成分進(jìn)行確證分析，為瑪咖中酰胺類物質(zhì)的準(zhǔn)確定性定量分析提供便利。

液質(zhì)聯(lián)用儀由HPLC、接口裝置及MS三大單元組成。目前常用的液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用包括四極桿質(zhì)譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜等。四級(jí)桿質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)在于性能穩(wěn)定、成本較低、可以同時(shí)很好地進(jìn)行定性和定量分析；不足之處在于只能得到低分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)。飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中不同質(zhì)量的離子在質(zhì)譜計(jì)中飛行時(shí)間的不同而達(dá)到分離。本法具有高靈敏度高選擇性，能得到高質(zhì)量譜圖和化合物精確分子量。

隨著對(duì)瑪咖研究的深入，越來(lái)越多的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于瑪咖酰胺的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)及含量測(cè)定［32-34］。朱延財(cái)?shù)龋?5］采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)云南產(chǎn)黑色瑪咖中瑪咖酰胺含量進(jìn)行分析，具有靈敏度高，分辨率高，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中12種瑪咖酰胺的酰胺鍵與陽(yáng)離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的［M+H］+和［M+Na］+峰，有些能形成微弱的［M+K］+峰。對(duì)3個(gè)不同品種的瑪咖樣品進(jìn)行定量，結(jié)果表明云南黑色瑪咖中酰胺含量最高。高大方等［18］采UPLC-MS/MS對(duì)云南產(chǎn)瑪咖進(jìn)行成分分析鑒定，發(fā)現(xiàn)了6種首次報(bào)道的瑪咖酰胺類成分。UPLC-MS/MS提供更豐富的分子量信息，為瑪咖酰胺的分析鑒定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

5　展望

瑪咖有“秘魯人參”之稱，藥食兩用，能緩解疲勞。瑪咖酰胺是瑪咖中特有的活性成分，具有緩解疲勞，提高生育能力等功效。由于瑪咖酰胺含量很低，至今研究較少，主要集中在提取分離，分析鑒定方面，現(xiàn)已有回流提取、超聲提取和超臨界流體萃取等提取技術(shù)應(yīng)用于瑪咖酰胺的分離，高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用等分析技術(shù)應(yīng)用于瑪咖酰胺的分析檢測(cè)。由于含量較低，檢測(cè)方法需要更好的靈敏度，先進(jìn)的液質(zhì)聯(lián)用方法將起到重要的作用。由于瑪咖酰胺的烷基鏈很長(zhǎng)，疏水作用強(qiáng)，所以用普通的反向色譜柱進(jìn)行分析，保留時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)。如果增大有機(jī)相比例，保留時(shí)間將有所提前，但用液質(zhì)方法檢測(cè)時(shí)不利于樣品離子化，會(huì)降低方法的靈敏度?？紤]到瑪咖酰胺都有酰胺鍵，可嘗試鍵合氨基的色譜柱，采用高水相的流動(dòng)相洗脫，這樣既可以使保留時(shí)間提前，又有利于樣品離子化，提高液質(zhì)檢測(cè)方法的靈敏度?，斂崛∥镏须s質(zhì)很多，必然會(huì)對(duì)分析造成干擾，因此前處理凈化過(guò)程至關(guān)重要。固相萃取適用于復(fù)雜樣品的凈化，對(duì)瑪咖酰胺的分析可能會(huì)有較好的效果。鑒于瑪咖酰胺含量較低，分子印跡技術(shù)應(yīng)用于瑪咖酰胺的富集凈化，將會(huì)為分析方法提供便利。通過(guò)分子印跡技術(shù)的富集，普通的液相檢測(cè)就能滿足分析要求，大大降低了成本。隨著研究的深入，固相萃取、分子印跡、液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)將會(huì)發(fā)揮重要的作用，對(duì)瑪咖酰胺的研究將會(huì)更進(jìn)一步。

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Research progress in analysis methods of macamides

（1.Institute of Food Safety，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China；2.School of Pharmacy，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Maca was a rare medicinal and edible plant，originating in Peru.It contains abundant nutrients.Maca has the ability to relieve fatigue，improve sleep，improve the function and antioxidant and other biological activity. Macamides were the special active substances in Maca，having strong biological activity.The content of the macamides in maca was low.At present，the method of solvent reflux，ultrasonic extraction，HPLC and liquid chromatography-mass spectrometry were used to detect it.In this paper，the extraction and analysis of macamides were reviewed，which provides a reference for its further research.

maca；macamides；HPLC；LC-MS

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0370-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.066

2015－05－04

李紹輝（1989-），男，碩士研究生，研究方向：中藥學(xué)，E-mail：shaohui_L@126.com。

張峰（1974-），男，博士，研究員，研究方向：分析化學(xué)，E-mail：fengzhang@126.com。

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（2012YQ14000806）；北京市科技計(jì)劃課題（Z141100002614020）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201410088）；中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2015JK008）。