程　超，張宏海，2，盛文軍，2，韓舜愈，2，王　婧，2，*（.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州730070）

多重破壁技術(shù)提取葡萄酒泥廢酵母β-葡聚糖研究

程超1，張宏海1，2，盛文軍1，2，韓舜愈1，2，王婧1，2，*
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州730070）

以葡萄酒泥廢酵母為試材，采用高壓均質(zhì)法和凍融法協(xié)同破碎酵母細(xì)胞壁，并輔以復(fù)合蛋白酶和脂肪酶酶解技術(shù)，研究多重破壁技術(shù)對β-葡聚糖純度的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken實驗設(shè)計原理，以酵母濃度、均質(zhì)時間和凍融加水量為實驗因素，以β-葡聚糖純度為響應(yīng)值，優(yōu)化葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取工藝。結(jié)果表明：葡萄酒泥酵母β-葡聚糖最優(yōu)提取工藝為均質(zhì)壓力70 MPa，酵母濃度13%，均質(zhì)時間34 min，凍融加水量25%，在此條件下提取所得酵母β-葡聚糖純度為91.69%，得率為13.23%，該方法為酵母葡聚糖的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

葡萄酒泥廢酵母，工業(yè)化破壁，復(fù)合酶解，β-葡聚糖

近幾年多項研究表明，酵母β-葡聚糖是目前生物活性較強(qiáng)的一類免疫多糖，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低膽固醇、防輻射、治愈傷口等諸多生物活性作用，可以參與生物細(xì)胞的多種生命調(diào)節(jié)［1-4］。因此，備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

葡萄酒泥廢酵母是葡萄酒釀造過程中的主要副產(chǎn)物之一，其生成量約占葡萄酒產(chǎn)量的4%～5%［5-6］。因此，利用葡萄酒泥廢酵母開發(fā)β-葡聚糖，變廢為寶，不僅可以大幅度降低原料的生產(chǎn)成本，而且能夠有效減輕企業(yè)的環(huán)保壓力，獲得社會效益。

酵母β-葡聚糖屬于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)多糖，位于細(xì)胞壁的最內(nèi)層，占細(xì)胞壁干重的30%～60%［7］。因此通過大規(guī)模破碎酵母細(xì)胞壁可分離提取酵母葡聚糖。目前常用的破壁方法較多，主要有酶法、機(jī)械破壁法、凍溶法、有機(jī)溶劑法等，但各種破壁方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。郭衛(wèi)蕓等［8］對反復(fù)凍融法破碎啤酒酵母細(xì)胞壁的研究發(fā)現(xiàn)，該方法對酵母內(nèi)部的有效成分損害較小，但存在得率和產(chǎn)品純度低等缺點(diǎn)；Chema B等［9］研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶和脂肪酶處理能夠從釀酒酵母細(xì)胞壁中提取β-葡聚糖，但這種單一方法酶解時間較長，細(xì)胞破壁率較低，導(dǎo)致產(chǎn)品純度低。張莉弘等［10］利用超聲波處理使啤酒酵母破壁，但該方法處理量小，只適用于實驗室研究。高壓均質(zhì)法利用機(jī)械破壁原理，方法簡單，成本低廉，處理量大，但戴寧等［11］利用該方法對酵母破壁的研究發(fā)現(xiàn)，這種單一破壁方法也存在產(chǎn)品得率低的缺點(diǎn)。因此，利用多重復(fù)合破壁技術(shù)工業(yè)化制備酵母β-葡聚糖具有重要的研究價值。

本研究以葡萄酒泥廢酵母為原料，采用適合工業(yè)化生產(chǎn)的高壓均質(zhì)法和凍融法協(xié)同破碎酵母細(xì)胞壁，并輔以復(fù)合蛋白酶和脂肪酶酶解技術(shù)；以β-葡聚糖純度為評價指標(biāo)，在單因素實驗設(shè)計的基礎(chǔ)之上，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝，以期建立較為高效的工藝路線，旨在為開發(fā)利用葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄酒廢酵母泥甘肅紫軒酒業(yè)有限公司；D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司，純度≥98%；木瓜蛋白酶（80萬U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、脂肪酶（2萬U/g）上海源葉生物科技有限公司；酵母抽提酶（40萬U/g）

南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

Genesis 10s紫外可見分光光度計美國Thermo Scientific公司；TD5A-WS型臺式低速離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；GYB 60-6S高壓均質(zhì)機(jī)（功率3 kW，額定流量60 L/h）上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；海爾冰箱青島海爾股份有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實驗方法

1.2.1葡萄酒泥廢酵母β-葡聚糖提取工藝

1.2.1.1工藝流程葡萄酒泥預(yù)處理→誘導(dǎo)自溶→高溫浸提→高壓均質(zhì)→凍融→復(fù)合蛋白酶→脂肪酶→沉淀（乙醇洗滌）→烘干（65℃至恒重）→β-葡聚糖。

1.2.1.2操作要點(diǎn)a.葡萄酒泥預(yù)處理［12］：收集葡萄酒泥，加等體積蒸餾水混勻，過80目篩，反復(fù)洗滌（4000 r/min，10 min），直至酒泥沉淀呈白色，上清液澄清為止，收集濕酵母細(xì)胞備用。

b.誘導(dǎo)自溶：取10 g濕酵母細(xì)胞懸浮于100 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH4.4）中，并添加2.2%的NaCl，50℃自溶27 h。

c.甘露糖蛋白的去除［9］：取自溶后酵母細(xì)胞沉淀10 g懸浮于100 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）中，121℃高溫浸提5 h。

d.高壓均質(zhì)［13］：將高溫浸提后酵母細(xì)胞沉淀加水配成懸浮液，利用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破壁，設(shè)定均質(zhì)壓力（70 MPa）和不同均質(zhì)時間。

e.凍融［14-15］：取高壓均質(zhì)后酵母細(xì)胞沉淀，添加不同量蒸餾水，反復(fù)凍融。

f.復(fù)合蛋白酶處理：將酵母抽提酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)配。其中，三種酶添加量分別為0.5%；酶解時間50 min、溫度55℃、pH7.0、料液比1∶5 （g/mL）。

g.脂肪酶處理［9］：控制脂肪酶添加量為0.1%，酶解時間3 h、溫度40℃、pH7.0、料液比1∶10（g/mL）。1.2.2單因素實驗

1.2.2.1酵母濃度對β-葡聚糖純度的影響將高溫浸提后的酵母細(xì)胞沉淀加水配成5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的懸浮液，控制每次處理的菌液體積為500 mL，設(shè)定均質(zhì)壓力（70 MPa）和均質(zhì)時間（30 min）；加蒸餾水反復(fù)洗滌3次，離心收集沉淀，并測定β-葡聚糖的純度。

1.2.2.2均質(zhì)時間對β-葡聚糖純度的影響將高溫浸提后的酵母細(xì)胞沉淀加水配制成7.5%的懸浮液，控制菌液體積，設(shè)定均質(zhì)壓力（70 MPa）和不同均質(zhì)時間（10、20、30、40、50 min）；加蒸餾水反復(fù)洗滌3次，離心收集沉淀，并測定β-葡聚糖的純度。

1.2.2.3凍融加水量對β-葡聚糖純度的影響稱取適量經(jīng)高壓均質(zhì)后的酵母細(xì)胞沉淀，分別添加不同量的蒸餾水（10%、15%、20%、25%、30%），在-18℃凍結(jié)2 h，反復(fù)凍融3次，沸水浴中解凍30 min；加蒸餾水反復(fù)洗滌3次，離心收集沉淀，并測定β-葡聚糖的純度。

1.2.2.4凍融次數(shù)對β-葡聚糖純度的影響稱取適量經(jīng)高壓均質(zhì)后的酵母細(xì)胞沉淀，添加20%的蒸餾水，在-18℃凍結(jié)2 h，分別反復(fù)凍融1、2、3、4、5次，并在沸水浴中解凍時間為30 min；加蒸餾水反復(fù)洗滌3次，離心收集沉淀，并測定β-葡聚糖的純度。

1.2.3響應(yīng)面優(yōu)化實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，借助Design-Expert 8.0軟件，運(yùn)用Box-Behnken實驗設(shè)計原理，以均質(zhì)時間（A）、凍融加水量（B）、酵母濃度（C）為自變量，以β-葡聚糖純度為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析實驗，優(yōu)化提取條件。

表1　響應(yīng)面優(yōu)化實驗因素水平表Table 1　Levels and factors for the response surface optimization test

1.2.4β-葡聚糖含量測定方法采用紫外分光光度法

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［16］準(zhǔn)確配制葡萄糖質(zhì)量濃度分別為32、48、64、80、96、112、128 μg/mL的系列溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2樣品處理［17］準(zhǔn)確稱取酵母β-葡聚糖樣品0.4 g（精確至0.1 mg）至20 mL具塞試管中，加入6 mL 濃HCl（37%，v/v）混勻。在30℃下水浴45 min（每15 min混合振蕩1次）。然后將懸浮物定量轉(zhuǎn)移到200 mL杜氏瓶中，將杜氏瓶放入高壓滅菌鍋，121℃，60 min。取出后冷卻，用NaOH溶液調(diào)溶液pH到6～7，然后定容至200 mL，過濾備用。

1.2.4.3β-葡聚糖含量測定［18］取稀釋的樣品液1 mL（相當(dāng)于45 μg左右的葡萄糖），按1.2.4.1步驟操作，測定OD490，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算成品中β-葡聚糖含量。

式中，C為樣品溶液中葡萄糖的濃度（mg/mL）；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；W為相應(yīng)的樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.5β-葡聚糖純度和得率的計算［19］β-葡聚糖純度（%）=提取物中β-葡聚糖含量/提取物總重量×100

β-葡聚糖得率（%）=最終β-葡聚糖產(chǎn)品重量/原料總重量×100

1.2.6蛋白質(zhì)和脂肪的測定參照GB 5009.5-2003［20］和GB/T 5009.6-2003［21］的方法。

1.2.7統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品，紫外分光光度法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0085x-0.0142，相關(guān)系數(shù)R2=0.9986，吸光度值和葡萄糖濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of Glucose

2.2單因素結(jié)果與分析

2.2.1酵母濃度對β-葡聚糖純度的影響由圖2可知，在高壓均質(zhì)過程中，酵母濃度在5.0%～12.5%范圍內(nèi)，β-葡聚糖純度呈緩慢上升趨勢；當(dāng)酵母濃度為12.5%時，β-葡聚糖純度達(dá)到最大值67%，并顯著高于其他濃度，說明12.5%為高壓均質(zhì)較適的酵母濃度；而酵母濃度超過12.5%后，隨著濃度增加，β-葡聚糖純度呈下降趨勢，可能是由于酵母濃度增加使表觀粘度增加，而粘度會影響高壓均質(zhì)的作用效果，因此酵母濃度增加會使高壓均質(zhì)的破碎效率下降，故而影響β-葡聚糖的純度。

2.2.2均質(zhì)時間對β-葡聚糖純度的影響由圖3可知，在均質(zhì)壓力70 MPa下，均質(zhì)時間對β-葡聚糖純度有顯著影響。隨著均質(zhì)時間增加，β-葡聚糖純度呈現(xiàn)先顯著上升后逐漸穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)均質(zhì)時間為30、40、50 min時β-葡聚糖純度變化不大。原因在于高壓

圖2　酵母濃度對β-葡聚糖純度的影響Fig.2　Effect of different yeast concentration on the purity of β-Glucan

圖3　均質(zhì)時間對β-葡聚糖純度的影響Fig.3　Effect of different homogeneous time on the purity of β-Glucan均質(zhì)時間為30 min時，酵母細(xì)胞破壁效果較好，隨著均質(zhì)時間增加，破壁率的上升梯度開始減小，可以預(yù)測破壁率會逐漸趨于一個特定水平而不再變化，因而β-葡聚糖純度變化不大。

2.2.3凍融加水量對β-葡聚糖純度的影響由圖4可知，凍融加水量對β-葡聚糖純度有顯著影響。隨著加水量的增加，β-葡聚糖純度呈現(xiàn)先顯著上升后逐漸平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)加水量為25%時，β-葡聚糖純度顯著高于加水量為20%時的β-葡聚糖純度，達(dá)到了76.14%；而后隨著加水量的增加，β-葡聚糖純度變化不大，逐漸趨于穩(wěn)定水平。原因在于酵母細(xì)胞內(nèi)部間隙在加水量25%時被水分幾乎完全填充，致使在反復(fù)凍融（凍結(jié)-解凍）過程中冰晶體對酵母細(xì)胞的機(jī)械作用發(fā)揮到最大。

圖4　凍融加水量對β-葡聚糖純度的影響Fig.4　Effect of different freezing-thawing water content on the purity of β-Glucan

2.2.4凍融次數(shù)對β-葡聚糖純度的影響由圖5可知，凍融次數(shù)對β-葡聚糖純度有顯著影響。隨著凍融次數(shù)的增加，β-葡聚糖純度呈現(xiàn)先顯著上升后逐漸平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)凍融次數(shù)為3次時，β-葡聚糖純度達(dá)到了74.41%；而后隨著凍融次數(shù)的增加，純度變化幅度不大，逐漸趨于穩(wěn)定水平。原因在于當(dāng)凍融次數(shù)達(dá)到一定限度后，酵母細(xì)胞大部分已被破碎，破碎率趨于較大值，因而β-葡聚糖純度不會再有較大幅度的變化。

圖5　凍融次數(shù)對β-葡聚糖純度的影響Fig.5　Effect of different freezing-thawing number on the purity of β-Glucan

2.3響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.1回歸模型的確定實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。將表2實驗數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到β-葡聚糖純度與各因素變量的二次方程模型為：

該方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.9850，響應(yīng)變量R2為0.9658，因此，可以充分描述獨(dú)立變量對葡萄酒泥酵母中β-葡聚糖純度的影響。該模型Prob（p）＞F值為0.0001，模型極顯著，模型擬合程度良好。

表2　Box-Behneken響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 2　Results of Box-Behnken response surface experiments

2.3.2回歸方程的方差分析由表3可以看出，回歸方程的一次項（除B外）和二次項（除A2外）極顯著，說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是簡單線性關(guān)系。交互項AB顯著，AC極顯著，說明A和B，A和C之間交互作用很好。另外，模型的變異系數(shù)CV為0.49%，證明回歸方程擬合程度較好，說明實驗具有很高的可信性和準(zhǔn)確性。失擬項不顯著，說明實驗誤差很小。

表3　回歸模型的方差分析Table 3　Variance analysis for the regression equation

各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映各因素對實驗指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對實驗指標(biāo)影響越大。從方差分析表可知各因素對β-葡聚糖純度的影響程度大小順序為：均質(zhì)時間＞酵母濃度＞凍融加水量。

2.3.3各因素之間的交互作用根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)面分析圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，反映均質(zhì)時間、凍融加水量、酵母濃度對響應(yīng)值的影響。觀察響應(yīng)曲面所對應(yīng)的等高線圖來確定兩因素對響應(yīng)值的影響程度，等高線為橢圓，則說明兩者交互作用顯著。

由圖6和方差分析可知，因素A與B，A與C交互作用顯著，而B與C之間的交互作用不顯著。

圖6　A（均質(zhì)時間）、B（凍融加水量）和C（酵母濃度）的交互響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface figure of homogeneous time，freezingthawing water content and yeast concentration

2.3.4驗證實驗及結(jié)果分析由響應(yīng)曲面及回歸方程分析可知，葡萄酒泥廢酵母β-葡聚糖的最佳提取工藝條件為：均質(zhì)時間33.51 min，凍融加水量25.46%，酵母濃度12.74%。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件提取酵母β-葡聚糖，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為：均質(zhì)時間34 min，凍融加水量25%，酵母濃度13%。按上述條件進(jìn)行實驗結(jié)果的驗證，進(jìn)行3次平行實驗，測得β-葡聚糖的平均純度為79.69%，與理論預(yù)測值（79.88%）相比，其相對誤差約為0.19%，說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

2.4不同破壁工藝提取酵母β-葡聚糖純度及得率分析

對葡萄酒泥廢酵母β-葡聚糖提取過程中每步工藝所得產(chǎn)物的成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。在整個提取過程中，β-葡聚糖的純度逐漸增加，特別是高壓均質(zhì)處理（S4）、凍融處理（S5）、復(fù)合蛋白酶酶解（S6）這三步工藝，對所得產(chǎn)物的β-葡聚糖純度有顯著影響，β-葡聚糖純度由51.99%增加到89.05%。蛋白質(zhì)的含量隨各提取步驟而逐漸減小，由起始的58.27%降到3.07%。脂肪含量則在整個提取過程中由起始的5.10%降到了微量，尤其是脂肪酶處理對脂肪含量的降低有較大影響，這與Silke C J等［22］研究結(jié)果相仿。朱益波等［19］采用適合工業(yè)化生產(chǎn)的高速分散機(jī)并輔以酶法對廢啤酒酵母進(jìn)行破壁處理以獲得β-葡聚糖，所得提取物中總糖質(zhì)量百分含量為84.90%，得率為13.70%；Chema B等［9］采用復(fù)合酶處理從釀酒酵母細(xì)胞壁中提取β-葡聚糖，所得產(chǎn)品純度為79%。本研究結(jié)果表明葡萄酒泥廢酵母經(jīng)過洗滌、誘導(dǎo)自溶、高溫浸提、高壓均質(zhì)結(jié)合凍融法破壁、復(fù)合蛋白酶解、脂肪酶解后β-葡聚糖純度可以達(dá)到91.69%，最終得率為13.23%。相比之下，本實驗提取所得酵母β-葡聚糖純度得到顯著提高，而且該方法摒棄了傳統(tǒng)的酸、堿及氧化劑的使用，且破壁工藝中采用機(jī)械法和反復(fù)凍融相結(jié)合，具有設(shè)備簡單，處理量大、效率高等特點(diǎn)，不僅獲得了較高的產(chǎn)品純度，而且該方法運(yùn)轉(zhuǎn)成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，能夠為葡萄酒泥酵母β-葡聚糖的開發(fā)利用提供參考。

表4　每步處理后產(chǎn)物的成分分析Table 4　Composition analysis of each step treated dry products

3　結(jié)論

通過單因素實驗，確定了各因素對葡萄酒泥廢酵母β-葡聚糖純度的影響規(guī)律。應(yīng)用響應(yīng)面分析法對各因素的最佳水平范圍及其交互作用進(jìn)行研究，建立了酵母β-葡聚糖提取工藝的二次多項式回歸模型，得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)：均質(zhì)壓力70 MPa，酵母濃度13%，均質(zhì)時間34 min，凍融加水量25%，在此條件下提取所得酵母β-葡聚糖純度為91.69%，得率為13.23%，可為酵母β-葡聚糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Extraction ofβ-Glucan from waste wine yeast by multiple cell-wall-broken technologies

CHENG Chao1，ZHANG Hong-hai1，2，SHENG Wen-jun1，2，HAN Shun-yu1，2，WANG Jing1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Key Lab of Viticulture and Enology，Lanzhou 730070，China）

The cell wall of wine yeast was broken by high pressure homogenization and freezing-thawing methods collaboratively.Combined with enzymatic hydrolysis of compound protease and lipase，the effect of multiple cell-wall-broken technologies on purity ofβ-Glucan was studied.On the basis of single factor experiment，the Box-Behnken design was adopted.The concentration of yeast，homogeneous time and freezing-thawing water content were factors，and the purity ofβ-Glucan was response value，the extraction process ofβ-Glucan from waste wine yeast was optimized.The results showed that the optimal extraction parameters were obtained as follows：homogeneous pressure 70 MPa，concentration of yeast 13%，homogeneous time 34 min and freezingthawing water content 25%，while extraction purity ofβ-Glucan content was 91.69%and yield was 13.23% under these conditions.The process provided a reference basis for the development and utilization of Glucan from yeast.

waste wine yeast；industrialized cell-wall-broken technologies；compound enzyme hydrolysis；β-Glucan

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0111-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.013

2015-07-27

程超（1991-），女，碩士研究生，研究方向：葡萄酒微生物，E-mail：nmcgg349245322@163.com。

王婧（1969-），女，副教授，研究方向：食品安全與發(fā)酵微生物，E-mail：wangjing@gsau.edu.cn。

甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項（GNSW-2014-11）。