周夢怡，勇強，徐莉

（1、南京林業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京210037；2、南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京210037）

細胞培養(yǎng)無菌技術(shù)及有效控制污染的措施

周夢怡1，勇強2，徐莉1

（1、南京林業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京210037；2、南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京210037）

細胞培養(yǎng)技術(shù)是分子生物學(xué)研究中的重要手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。而無菌技術(shù)又是細胞培養(yǎng)技術(shù)中的關(guān)鍵性技術(shù)。簡要地介紹細胞培養(yǎng)時常見的污染物，并結(jié)合在實際工作中總結(jié)出來的經(jīng)驗，著重討論污染途徑及對應(yīng)的有效控制措施，為細胞培養(yǎng)操作者提供參考。

細胞培養(yǎng)；無菌技術(shù)；污染

為了避開正常體內(nèi)自體調(diào)節(jié)以及實驗應(yīng)激所可能產(chǎn)生的機體整體因素的影響，在20世紀(jì)初，出現(xiàn)了一種研究動物細胞的方法——組織培養(yǎng)［1］。組織培養(yǎng)包括了器官培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)。特別是細胞培養(yǎng)，自20世紀(jì)后半葉開始，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域，發(fā)揮出了日益重要的作用［2，3］。

細胞培養(yǎng)是指經(jīng)酶的、機械的或化學(xué)的方法將組織或原代外植塊的細胞分散開來，使呈細胞懸液，然后將其培養(yǎng)于固體基質(zhì)上貼壁生長，或使其在培養(yǎng)基中懸浮生長［4］。由于細胞是在模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體外條件下進行生長，缺乏機體的免疫系統(tǒng)等機制，因此細胞培養(yǎng)工作除了需要完善的實驗設(shè)計和技術(shù)方法外，成敗的關(guān)鍵還在于能否保持無菌狀態(tài)、戰(zhàn)勝多種來源污染的挑戰(zhàn)。這就要求細胞培養(yǎng)操作者不僅要清楚細胞培養(yǎng)時潛在的污染物，還要掌握對應(yīng)的控制措施。

1　污染物［5-7］

細胞培養(yǎng)時可能的主要污染源有三類：化學(xué)污染、細胞交叉污染和微生物污染。化學(xué)污染在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生率低。同一時期內(nèi)進行多種細胞培養(yǎng)時可能會出現(xiàn)細胞交叉污染的情況，造成培養(yǎng)的細胞不純。微生物則是細胞培養(yǎng)時最常見的污染物。如何有效的控制微生物污染，是細胞培養(yǎng)的重要問題。造成細胞污染的常見微生物種類有細菌、真菌和支原體。

1.1細菌污染細菌是一種原核細胞微生物，常見的細菌污染主要由大腸埃希菌、枯草桿菌、假單胞菌、葡萄球菌等引起。通常在發(fā)生細菌污染后，培養(yǎng)基會變渾濁，pH會變低，細胞的生長被抑制，甚至死亡。在10×物鏡下可觀察到細胞間的空隙有點狀顆粒。

1.2真菌污染真菌是一種真核細胞微生物，個體比細菌大。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。被真菌污染后，培養(yǎng)基pH會發(fā)生改變，表面可出現(xiàn)肉眼可見的、白色或淺黃色漂浮物。在光學(xué)顯微鏡下可觀察到細胞間有縱橫交錯的絲狀或樹枝狀菌絲。被酵母菌污染后，培養(yǎng)液亦會發(fā)生渾濁，但pH變化不大，酵母菌呈獨立的圓形或卵形顆粒，分散在細胞周圍生長。被念珠菌污染的培養(yǎng)液則依然清亮，念珠菌呈鏈狀生長。真菌喜溫暖潮濕的環(huán)境，故細胞培養(yǎng)箱、水浴鍋等系統(tǒng)都是真菌生長的溫床，是潛在的污染途徑。

1.3支原體污染支原體，曾被稱為類胸膜肺炎微生物，是為目前發(fā)現(xiàn)的最小、最簡單的原核生物。支原體沒有固定的形態(tài)，多呈球形。支原體沒有細胞壁，通過吸取宿主的營養(yǎng)物和甾醇類物質(zhì)進行生長和維持細胞形態(tài)。支原體污染是一個困擾大多數(shù)實驗室的問題。支原體的大小為0.1～0.3μm，光學(xué)顯微鏡下不易觀察到，可穿過絕大部分的濾膜，并且因其沒有細胞壁，作用于細胞壁的抗生素對它無效。支原體生長緩慢，培養(yǎng)基無特殊的外在表現(xiàn)，但它對宿主細胞的表達、功能、生長、胞內(nèi)細胞器、代謝等方面都會產(chǎn)生深遠影響［8］。在培養(yǎng)過程中若發(fā)現(xiàn)細胞增殖減慢、飽和密度下降或發(fā)生破碎時，可懷疑是支原體的污染。

2　污染途徑及對應(yīng)的控制措施

細胞一旦發(fā)生污染，不僅影響實驗結(jié)果，而且浪費人力、物力和時間。保持無菌，無論對于新人還是老手，都是一個巨大的挑戰(zhàn)。體外培養(yǎng)的細胞缺乏免疫系統(tǒng)，自體不能清除污染物，因此控制污染的最佳方式就是預(yù)防污染。

結(jié)合文獻報道［4，9-13］和本人的實際經(jīng)驗認(rèn)為，在細胞培養(yǎng)過程中，潛在的污染途徑主要包括操作技術(shù)和環(huán)境，其中環(huán)境因素又包括了無菌試劑和材料、層流超凈工作臺、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、水浴鍋和冰箱等。

2.1操作技術(shù)如果培養(yǎng)環(huán)境潔凈，那么污染會因操作者的技術(shù)問題而出現(xiàn)。

2.1.1培養(yǎng)操作前⑴個人衛(wèi)生：進入細胞培養(yǎng)室時應(yīng)更換實驗室專用鞋或者穿鞋套；穿戴實驗服、口罩和手套，用消毒酒精（75%濃度的乙醇）擦拭雙手；如果操作者是長發(fā)，應(yīng)扎于腦后。⑵工作臺準(zhǔn)備：提前0.5～1h打開超凈臺的紫外燈進行消毒；用蘸有消毒酒精的紙巾擦拭超凈臺的臺面、擋板等。⑶試劑準(zhǔn)備：從冷藏室或冷凍室取出所需的培養(yǎng)基等試劑，于37°C水浴鍋中進行加熱；加熱后用消毒酒精擦拭瓶身，并立馬放入超凈工作臺內(nèi)。須注意的事項有：外套、書包等物品，易附著豐富的微生物，不應(yīng)帶入細胞房。

2.1.2培養(yǎng)操作中⑴臺面布置：按實驗需要和個人習(xí)慣，合理放置試劑、耗材、儀器等物品；點燃酒精燈后開始實驗操作。⑵操作：靠近火焰進行實驗操作；試劑瓶經(jīng)火焰旋轉(zhuǎn)灼燒后打開；挑選吸管，快速的縱向在火焰上來回移動并做180°旋轉(zhuǎn)；將試劑瓶向吸管傾斜，吸出所需的液體量；灼燒瓶頸后，重新蓋上蓋子；等所有操作完畢后，擰緊瓶蓋。

須注意的事項有：操作要準(zhǔn)確、敏捷、有序；吸取溶液時，應(yīng)專管專用，避免交叉污染；吸管管口要向下傾斜，以防止液體倒流進入移液器內(nèi)發(fā)生污染；盡量減少細胞和培養(yǎng)基的敞口時間；已開口的試劑瓶盡可能的傾斜放置，防止下落微生物的污染；避免在敞口的細胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿蓋上方操作；不要面對工作臺或細胞培養(yǎng)箱講話或咳嗽，防止口腔微生物隨唾沫飛入而發(fā)生污染；若發(fā)生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及時擦去。

2.1.3培養(yǎng)操作后⑴整理：將試劑放回原來的存儲位置；整理工作臺面，物歸原位，合理丟棄廢液和廢物。⑵消毒：用消毒酒精擦拭臺面；打開超凈工作臺和細胞房的紫外燈，照射1～2h。

須注意的事項有：紫外燈開啟后，人不能進入，紫外線對眼睛和裸露的皮膚均有危害，若要進入，一定要先關(guān)閉紫外燈，待人離開后打開。

2.2環(huán)境如果操作者技術(shù)水平很高，且操作嚴(yán)謹(jǐn)，那么當(dāng)環(huán)境惡化時，也會導(dǎo)致污染風(fēng)險的增加。進行細胞培養(yǎng)時，環(huán)境必須潔凈。

2.2.1無菌試劑和材料正規(guī)途徑購買的商業(yè)化的試劑（包括培養(yǎng)基、胰酶等）已經(jīng)過了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，可直接進行使用。有些實驗室為了防止細胞培養(yǎng)過程中細菌污染的發(fā)生，會在培養(yǎng)基中添加一定量的抗生素，例如青鏈霉素?？股氐氖褂茫谝欢ǔ潭壬峡梢杂行У囊种萍毦?。但必須要意識到，抗生素會影響細胞的生化反應(yīng)和分化［14］；同時一些隱藏的污染物也會因為抗生素的存在而不能被檢測出，時間久了發(fā)生慢性污染。所以應(yīng)避免對抗生素的依賴。試劑的瓶子外表面直接與空氣接觸，不是無菌的，所以在放入超凈工作臺前，要用消毒酒精進行外表面消毒。

常用的細胞培養(yǎng)器皿，包括培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板，出廠時已做過無菌處理，可直接使用。但是一些未標(biāo)注無菌的材料，如吸管、離心管或玻璃瓶等，要經(jīng)過嚴(yán)格的高壓濕熱滅菌（121°C，100kPa，30min），才能放入工作臺中進行使用。

細胞培養(yǎng)過程中涉及到的自行配制的溶液要經(jīng)過高壓濕熱滅菌（如水、磷酸鹽緩沖溶液等）或0.22μm無菌濾膜過濾（不耐高溫的溶液）、并檢測確認(rèn)為無菌后，方可使用。

2.2.2層流超凈工作臺層流根據(jù)風(fēng)的流向，分為水平式和垂直式兩種。層流超凈工作臺，一方面通過持續(xù)、穩(wěn)定的過濾氣流吹過工作臺面，為細胞培養(yǎng)創(chuàng)造出可靠的無菌環(huán)境；另一方面保護操作者，降低生物危害。但是如果層流超凈工作臺使用不當(dāng)，它將成為一個污染途徑。臺面上放置了過多的設(shè)備和材料，層流被破壞，失去了操作者和細胞房之間的保護邊界層，從而導(dǎo)致有菌空氣進入操作臺內(nèi)。清潔過程中馬虎大意，將紙巾、棉球等物品掉入到工作臺面下面，落在初濾器上，妨礙氣流。

保證層流超凈工作臺有效性的措施有：①不將工作臺當(dāng)做儲物柜使用，應(yīng)有序擺放必須的設(shè)備和材料，保護層流，減少衛(wèi)生死角；②操作動作溫柔，保護層流的穩(wěn)定性；③定期檢查工作臺面下方和周邊縫隙，清理掉落物品，并用消毒酒精進行擦洗；④由有資質(zhì)的工程師定期進行層流超凈工作臺的維護工作，檢測過濾器、管道系統(tǒng)、外殼和封閉度，并進行有必要的濾器更換。

2.2.3恒溫恒濕培養(yǎng)箱細胞污染一個主要的途徑就是恒溫恒濕培養(yǎng)箱。恒溫恒濕培養(yǎng)箱，在培養(yǎng)細胞取出和放入的過程中，直接與空氣接觸，微生物會被夾帶進入；加之其內(nèi)部濕度高、溫度適宜，特別有利于真菌繁殖。除非使用開放式的培養(yǎng)容器，否則并不需要高濕度。亦可采用基于Hanks溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，避免對CO2氣體交換的需要。使用透氣瓶蓋的培養(yǎng)瓶，也可進一步降低因氣體交換而產(chǎn)生污染的風(fēng)險。

細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，如果接觸了操作臺以外的地方，在放入培養(yǎng)箱前須經(jīng)消毒酒精擦拭。但須注意的是，消毒酒精要經(jīng)操作臺吹干，否則會導(dǎo)致培養(yǎng)箱內(nèi)乙醇濃度升高，可達5mM。研究發(fā)現(xiàn)，該濃度酒精會影響細胞的正常功能［15］。

在很多情況下，細胞培養(yǎng)必須使用恒溫恒濕培養(yǎng)箱。為了有效的控制該污染途徑，可采取的措施有：①在加濕托盤內(nèi)添加真菌抑制劑，如硫酸銅、十二烷基磺酸鈉，可抑制托盤內(nèi)真菌的生長；亦或盛裝無菌的去離子水，并每周進行更換，托盤用消毒酒精或高溫滅菌的方法進行嚴(yán)格的清潔；②使用無毒抗真菌清潔劑對培養(yǎng)箱內(nèi)外進行定期清潔，先用清潔劑、再用消毒酒精進行擦拭；為不留死角，清潔前應(yīng)將培養(yǎng)箱內(nèi)部能拆卸的部件都拆卸下來，清潔時也特別要注意不能拆卸的犄角旮旯處；③不正確的使用空氣過濾器，那將變?yōu)榕囵B(yǎng)箱一個可怕的污染途徑，故須按使用說明定期更換空氣過濾器；④在使用過程中，任何溢出液必須立刻用消毒酒精清除干凈；⑤一旦發(fā)些培養(yǎng)物被污染，立馬清走。

2.2.4水浴鍋水浴鍋在細胞培養(yǎng)過程中起解凍溶液、加熱培養(yǎng)基之用。不與細胞直接接觸，故很容易被忽視。殊不知，溫暖而潮濕的環(huán)境，它也非常適合真菌的生長。如果仔細觀察就會發(fā)現(xiàn)，一段時間后水浴鍋的水就會變渾濁。隱藏在這的真菌會通過附著在加熱的瓶身上進入到細胞房內(nèi)。要控制這個污染途徑，方法有：①定期更換水浴鍋的水并清洗內(nèi)部，可添加真菌抑制劑來延長更換周期；②瓶子在加熱時，注意瓶口不接觸到水，可用錫箔紙包裹瓶口和瓶頸；③瓶子加熱后，先擦干水、再用含消毒酒精的紙巾擦拭后，放入操作臺內(nèi)。

2.2.5冰箱冰箱也是一個被忽視的污染途徑。在細胞培養(yǎng)過程中，會用到各種各樣的試劑，它們都有對應(yīng)的儲存條件。例如，培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液等存儲在4°C環(huán)境內(nèi)，胰酶、血清、抗生素等存儲在-20°C環(huán)境內(nèi)。每次打開門時，潮濕的空氣進入后冷凝，造成潮濕的環(huán)境，這可導(dǎo)致冰箱內(nèi)壁累積真菌而產(chǎn)生污染的風(fēng)險。同時，潮濕的空氣還會提高存放其內(nèi)的瓶身上真菌孢子沉積的幾率。有效的控制方式有：①定期清潔冷藏庫，包括內(nèi)壁、支架，先用清潔劑，再用消毒酒精；②用錫箔紙包裹瓶蓋和瓶頸后儲存。

3　結(jié)束語

如何保持無菌，是每個細胞培養(yǎng)實驗室一直面對的難題。污染幾率增加的主要原因包括：操作技術(shù)不嚴(yán)格，試劑質(zhì)量不達標(biāo)，大氣中孢子計數(shù)增加，培養(yǎng)箱或操作臺使用和維護不當(dāng)，污染了的冰箱和水浴鍋。因此，在細胞培養(yǎng)過程中，操作者不僅要嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，同時還要特別注意新產(chǎn)品、新品牌、以及設(shè)備的清潔維護。

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