陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)系 (咸陽 712000)

耿朝萌 　劉林波　郭瑞林△　蘇　冰△ 　張曉雪△

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·臨床檢驗·

大腸埃希菌生物膜兩種檢測方法對比研究

陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)系 (咸陽 712000)

耿朝萌 劉林波郭瑞林△蘇冰△張曉雪△

摘要目的：剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色和半定量粘附實驗檢測大腸埃希菌生物膜的敏感性和特異性比較。方法：對臨床分離的83株大腸埃希菌進行生物膜形成實驗，分別經(jīng)剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色和半定量粘附實驗，隨機抽取25株進行激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察。結(jié)果：臨床分離的83株大腸埃希菌經(jīng)剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色陽性率37.3%，敏感性81.8%，特異性100%；半定量粘附實驗陽性率45.8%，敏感性100%，特異性78.6%；兩種檢測方法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色、半定量粘附實驗均可用于大腸埃希菌生物膜的檢測。

主題詞@大腸埃希菌生物膜/細胞學(xué)剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色細菌粘附染色與標記顯微鏡檢查，共焦比較研究

細菌生物膜形成在細菌感染中的作用已引起廣泛關(guān)注，對生物膜的檢測也得到了越來越高的重視，出現(xiàn)了各類不同的檢測方法[1-5]。本文對我院臨床分離的83株大腸埃希菌在體外能否形成生物膜進行實驗，并分別采用剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色，半定量粘附實驗，比較其陽性檢出率、敏感性和特異性，對其臨床意義進行探討，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1實驗菌株、主要試劑與儀器收集2014年8～11月陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床標本中分離的83株大腸埃希菌，刪除同一患者相同感染部位分離的重復(fù)分離菌株，所有菌株均經(jīng)臨床鑒定。LB肉湯，剛果紅(中國遠航試劑廠)，阿利新藍8GX(上海如吉生物科技有限公司)，結(jié)晶紫為國產(chǎn)分析純，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8),全自動酶標儀等。

2 方法

2.1剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色:

2.1.1阿利新藍染液：阿利新藍2 g，冰醋酸3 ml，蒸餾水97 ml，用前過濾；剛果紅染液：剛果紅 0.5g，50%酒精100 ml。

2.1.2剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色：將少量的無菌生理鹽水滴于經(jīng)高壓滅菌的載玻片上，從血平板上挑取少許活化的菌落與之混勻，再滴加阿利新藍染液,室溫下靜置10～20min后，經(jīng)火焰干燥后再滴加少許剛果紅染液，涂布均勻,室溫下染色5min,用蒸餾水沖洗至無染料流下為止，濾紙吸干后油鏡下觀察。重復(fù)實驗3次。

結(jié)果判斷：形成生物膜的細菌為淡紅色，胞外多糖等為深紅色，細胞之間邊界不清，深紅色的胞外多糖聚集成團并包裹于菌體周圍。

2.2半定量粘附實驗: 參照文獻[1]方法進行，重復(fù)實驗3次。

2.3激光共聚焦顯微鏡: 隨機抽取25株大腸埃希菌，參照文獻[5]進行CLSM掃描。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法：運用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用χ2檢驗，檢驗標準α=0.05。

結(jié)果

1兩種方法對大腸埃希菌生物膜的陽性檢出率83株臨床分離的大腸埃希菌中，經(jīng)剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色實驗和半定量粘附實驗分別有31株和38株形成生物膜，其陽性率分別為37.3%、45.8%，兩種方法的檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.21，P>0.05)。

2兩種方法敏感性和特異性的比較隨機抽取的25株大腸埃希菌經(jīng)CLSM觀察有11株形成生物膜，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色實驗有9株陽性，半定量粘附實驗有11株陽性，隨機抽取的25株經(jīng)CLSM觀察有14株未形成生物膜，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色實驗有14株陰性，半定量粘附實驗有11株陰性。兩種方法的敏感性與特異性分別為81.8%、100%和100%、78.6%。

討論

生物膜(Biofilm,BF)是與浮游菌相對應(yīng)的存在形式，是細菌在生長過程中為適應(yīng)外界環(huán)境，粘附于生物或非生物表面，由自身細胞產(chǎn)生的胞外聚合物(胞外多糖、胞外DNA和蛋白等)及其基質(zhì)包裹的具有三維結(jié)構(gòu)的菌細胞群體。細菌形成生物膜是引起持續(xù)性、反復(fù)性感染的常見致病機制，大腸埃希菌形成的生物膜可以引起前列腺炎、膽道感染、導(dǎo)尿管相關(guān)性膀胱炎等對人類健康造成極其嚴重危害的疾病，并與外科手術(shù)植入物[6-7]等相關(guān)感染有緊密聯(lián)系。有報道表明細菌生物膜的形成常常也是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和藥物治療失敗的重要原因。

生物膜的檢測主要有定性、定量檢測和形態(tài)學(xué)觀察。主要的檢測方法有剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色、半定量粘附實驗[1]、菌落計數(shù)法[2]、剛果紅實驗[3]、銀染法[4]、掃描電鏡或CLSM[5]的形態(tài)學(xué)觀察。本文對我院臨床分離的83株大腸埃希菌在體外生物膜形成能力進行檢測，分別采用剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色、半定量粘附實驗，比較其陽性檢出率有無統(tǒng)計學(xué)差異。隨機抽取其中25株，以CLSM觀察結(jié)果為真陽性標準，檢測剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色，半定量粘附實驗的敏感性和特異性。

剛果紅作為指示劑的選擇培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用于生物膜形成的定性檢查，而阿利新藍在組織細胞化學(xué)中常規(guī)應(yīng)用于酸性粘多糖及粘蛋白染色，因此，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色應(yīng)用于細菌胞外糖染色效果較佳。其操作方法相對簡便，實驗結(jié)果易于觀察，但阿利新藍染液的pH值在實驗中非常重要，在pH2.5時染色效果最佳，但剛果紅在酸性條件下會形成棕黑色沉淀，故在染色過程中滴剛果紅染液之前需將阿利新藍染液中的冰醋酸完全揮發(fā)。半定量粘附實驗[1]為胞外粘附基質(zhì)的結(jié)晶紫染色法，因其能通過吸光度間接反應(yīng)生物膜的形成量，而多用于微孔板、試管等小容器中的生物膜的半定量分析。其實驗所需試劑及器材成本較低，實驗條件要求不高而被一般的臨床實驗室廣泛應(yīng)用，但對于需動態(tài)觀察生物膜的形成并不適用。CLSM不僅可以觀察到生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)還可以對標本進行斷層掃描，再通過三維重建得到標本的立體結(jié)構(gòu)以顯示生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并可與圖像處理軟件如ISA軟件[5]將三維圖像數(shù)據(jù)化，且減少了掃描電鏡繁瑣的制片過程對生物膜結(jié)構(gòu)的破壞。同時，CLSM也可與熒光原位雜交技術(shù)(FISH)相結(jié)合，更直觀的反應(yīng)生物膜中活菌與死菌的比例，更真實地反映生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)與細菌之間的關(guān)系，并可同時檢測多種屬細菌。但是，CLSM價格昂貴，且實驗條件要求較高，難以滿足一般臨床實驗室對生物膜形成能力的評估要求。

大腸埃希菌是多種易形成生物膜的院內(nèi)感染細菌之一。本文采用的兩種檢測方法檢測本院臨床分離的83株大腸埃希菌生物膜的陽性檢出率分別為37.3%、45.8%，無統(tǒng)計學(xué)差異。但我院臨床分離的大腸埃希菌形成生物膜的檢出率明顯低于文獻[8]的報道。本實驗以CLSM觀察結(jié)果為真陽性標準，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色的敏感性為81.8%、特異性為100%，半定量粘附實驗的敏感性為100%、特異性為78.6%。因此，在觀察生物膜形成的實驗中，特別是標本量較大的實驗中，可考慮利用半定量粘附實驗的敏感性高、特異性相對較低的特點，對菌株是否形成生物膜進行過篩檢查，可疑菌株則可用剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色特異性高的特點加以證實。

據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)和美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)估計，約60%～80%的人類細菌感染性疾病的發(fā)生與生物膜有關(guān)。近年來，隨著人工假體、各種導(dǎo)管等醫(yī)療材料的廣泛應(yīng)用，人口老齡化及免疫低下人群的出現(xiàn)，使生物膜感染在醫(yī)院細菌感染中所占比例逐年上升，并且感染后果日趨嚴重。因此，生物膜檢測方法的優(yōu)化不容忽視，并且還需要大量實驗廣泛而深入的研究，才能得到客觀、準確的檢測結(jié)果，為臨床生物膜的檢出及對細菌生物膜耐藥性的研究提供可靠的幫助。

參考文獻

[1]Br?unlich M, Okstad OA, Slimestad R,etal. Effects of aronia melanocarpa constituents on biofilm formation of escherichia coli and bacillus cereus[J]. molecules,2013, 18(12): 14989-14999.

[2]謝紅梅,胡必杰,周昭彥,等.銅綠假單胞菌生物膜形成影響因素的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2007,17(12):1475-1477.

[3]邢銘友,劉莉娜,龔鳳云,等.表皮葡萄球菌Ica操縱子與細胞間多糖粘附素及生物膜表型的相關(guān)性[J].華中科技大學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,37(4):449-452.

[4]李俊娟,王強,孫開宇,等.銅綠假單胞菌生物膜與亞抑菌濃度抗菌藥物的相關(guān)研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(24):5437-5440.

[5]林麗華,余加林,劉官信.大蒜素對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響及結(jié)構(gòu)定量化分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2012,24(1):22-26.

[6]Samimi DB, Bielory BP, Miller D,etal. Microbiologic trends and biofilm growth on explanted periorbital biomaterials: A 30 year review[J].Ophthal Hast Reeonstr Surg, 2013, 29(5):376-381．

[7]Abohins C, Dowsey MM, Peel T,etal. Early prosthetic hip joint infection treated with debridement, prosthesis retention and biofilm-active antibiotics: Functional outcomes, quality of life and complications [J].Intern Med J,2013,43(7):810-815.

[8]熊杰,楊繼勇,鄒自英,等.臨床血液分離大腸埃希菌株耐藥性及生物被膜形成分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2012,41(35):3699-3701.

(收稿：2015-04-24)

【中圖分類號】R446.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.046

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